張峰+吳柳娟+李躺+王燦+胡益波+丁學(xué)知+夏立秋

摘 要 通過優(yōu)化刺糖多孢菌發(fā)酵合成多殺菌素培養(yǎng)基成分，改善培養(yǎng)條件，從而提高多殺菌素產(chǎn)量.在單因素以及Plackett-Burman試驗設(shè)計的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗設(shè)計方法對發(fā)酵培養(yǎng)基組分中的玉米漿、可溶性淀粉、丙酸鈉進行研究，運用遺傳算法優(yōu)化的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立多殺菌素產(chǎn)量與培養(yǎng)基組分濃度之間的預(yù)測模型，采用循環(huán)算法對此模型進行尋優(yōu)，得到三種組分的最佳配比為：玉米漿7 g/L、可溶性淀粉16 g/L、丙酸鈉2 g/L，多殺菌素產(chǎn)量達到（550.22±3.84）mg/L，采用上述方法優(yōu)化后的培養(yǎng)基使得多殺菌素產(chǎn)量比原始培養(yǎng)基產(chǎn)量（225 mg/L）提高145%.本研究結(jié)果可為培養(yǎng)基優(yōu)化提供一種有效的建模方法.

關(guān)鍵詞 刺糖多孢菌；多殺菌素；發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化；神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；遺傳算法

中圖分類號 S4823；TQ927 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2537（2017）05-0036-08

Optimization of the Spinosad Fermentation Medium by Applying Genetic Algorithm and Neural Network

ZHANG Feng， WU Liu-juan， LI Tang， WANG Can， HU Yi-bo， DING Xue-zhi， XIA Li-qiu*

（State Key Laboratory Breeding Base of Microbial Molecular Biology， Key Laboratory of Developmental Biology of

Freshwater Fishes， College of Life Science， Hunan Normal University， Changsha 410081， China）

Abstract In this work， we report an approach to improve spinosad production by optimizing the fermentation medium components. Corn steep liquor， soluble starch and sodium propionate in the fermentation medium were investigated by Box-Behnken design （BBD）， which was based on single factor and the Plackett-Burman design. Moreover， a prediction model of the spinosad yield as a function of the medium component concentration has been established by using the artificial neural network （ANN） optimized by genetic algorithm （GA）. Using ANN optimized by GA as the objective function， we employed the circulatory algorithm to optimize the medium components and the optimal ratio of the three components as follows： with corn steep liquor 7 g / L， soluble starch 16 g/L， and sodium propionate 2 g/L， the final yield of spinosad reached （550.22±3.84） mg/L， which was 145% higher than the original fermentatiom medium（225 mg/L）obtained when cultured on the optimized medium. Our results from this study can provide an effective modeling method for medium optimization.

Key words saccharopolyspora spinosa； spinosad； optimization of fermentation medium； neural network； genetic algorithm

多殺菌素又名刺糖菌素，是由土壤放線菌刺糖多孢菌 （Saccharopolyspora spinosa）經(jīng)有氧發(fā)酵產(chǎn)生的具有大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的次級代謝產(chǎn)物[1].因其具有廣譜殺滅害蟲作用，對人、非靶標動物和環(huán)境安全，可生物降解等優(yōu)點[2]，被國際上認為是一種具有發(fā)展前景的綠色殺蟲防護劑.

自2005年，美國環(huán)保局（ United States Environmental Protection Agency）批準將多殺菌素作為儲糧防護劑以來，已在有機作物上應(yīng)用[3-4]，但多殺菌素工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)量很低[5]，如何提高發(fā)酵產(chǎn)量受到國內(nèi)外研究者的高度重視.已有研究者通過遺傳改造的方法，使多殺菌素產(chǎn)量得到不同幅度的提高[6-9].刺糖多孢菌發(fā)酵多殺菌素，不僅與其遺傳基礎(chǔ)有關(guān)，而且與其培養(yǎng)條件也密切相關(guān)[10].優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分，是提高多殺菌素產(chǎn)量的一個有效技術(shù)途徑.但多殺菌素發(fā)酵培養(yǎng)基組分復(fù)雜，組分間往往存在較強的交互作用，培養(yǎng)基組分和發(fā)酵目的產(chǎn)物間是一種非線性關(guān)系；由于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能以任意精度逼近非線性函數(shù)，而遺傳算法既可以避免陷入局部最小，又可以加快收斂速度，所以將神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法結(jié)合，非常適合非線性模型的建立.研究表明，利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法進行微生物發(fā)酵條件優(yōu)化，能促進發(fā)酵目的產(chǎn)物的產(chǎn)量得到不同程度的提高[11-14].endprint

本文通過單因素實驗結(jié)果及文獻研究結(jié)果[15-17]，篩選出幾種促進作用的因子，進行Plackett-Burman試驗設(shè)計，篩選出對發(fā)酵多殺菌素具有顯著影響的因子進行下一步的Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化.基于Box-Behnken試驗設(shè)計的結(jié)果構(gòu)建利用遺傳算法優(yōu)化的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，進一步尋找多殺菌素發(fā)酵最優(yōu)培養(yǎng)基配方.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）菌株，本實驗室選育保藏.初始發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d，多殺菌素產(chǎn)量為225 mg/L.

1.1.2 試劑 TSB（Tryptic Soy Broth）（海博生物技術(shù)有限公司，AR）；葡萄糖（上海山浦化工有限公司，AR）；酵母粉（安琪酵母股份有限公司，BR）；七水合硫酸鎂（天津化學(xué)試劑三廠，AR）；棉籽粉（北京中棉紫光生物科技公司，工業(yè)級）；豆餅粉（濟寧雙華工貿(mào)有限公司，工業(yè)級）；可溶性淀粉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，AR）；碳酸鈣（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，AR）；油酸甲酯（上海阿拉丁試劑有限公司，CP）；油酸丁酯（上海阿拉丁試劑有限公司，CP）；丙酸鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，CP）；氯化鋇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，AR）；玉米漿（上海源葉生物科技有限公司，AR 45%）.

1.1.3 培養(yǎng)基及溶液 種子培養(yǎng)基（g/L）：TSB（Tryptic Soy Broth） 45.0；葡萄糖10.0；酵母粉9.0；七水合硫酸鎂2.2；115 ℃滅菌30 min.初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖60.0，棉籽粉22.5，豆餅粉5.0，可溶性淀粉100，碳酸鈣5.0，油酸甲酯42.0 mL/L.用2 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7.2，115 ℃滅菌30 min.

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 將刺糖多孢菌菌株從-80 ℃超低溫冰箱中取出，以1%（體積比，下同）接種到裝有50 mL種子活化培養(yǎng)基中，280 r/min，30 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，作為種子液.種子液以10%接種于裝有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，280 r/min，30 ℃振蕩培養(yǎng)，無特殊說明則培養(yǎng)240 h.

1.2.2 發(fā)酵樣品分析與檢測方法 發(fā)酵液的多殺菌素含量通過高效液相色譜分析檢測[18].

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計 試驗設(shè)計因子及水平見表1和表2.選擇N=12的試驗設(shè)計，見表3，誤差列是“虛擬變量”，用于估計誤差.在Design-Expert 8.06中進行Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果分析.

1.3.2 Box-Behnken試驗設(shè)計 本實驗通過Plackett-Burman試驗設(shè)計確定了玉米漿、可溶性淀粉和丙酸鈉的質(zhì)量濃度是對刺糖多孢菌發(fā)酵多殺菌素有重要影響的因子.進行Box-Behnken試驗時，每個因子取3個水平對應(yīng)編碼值為（-1，0，1），見表2.試驗點共17個，包括12析因點和用于估計實驗誤差的5個重復(fù)的零點實驗.Box-Behnken試驗因素水平如表2.

1.4 優(yōu)化方法

1.4.1 響應(yīng)面模型 基于Box-Behnken試驗數(shù)據(jù)進行響應(yīng)面建模（Response Surface Model， RSM）：

y是方程預(yù)測值（多殺菌素產(chǎn)量，mg/L），β0是常數(shù)；βi，βii，βij分別為一次項系數(shù)，二次項系數(shù)和交互項系數(shù)；xi和xj為自變量（培養(yǎng)基組分濃度，g/L）.Box-Behnken試驗結(jié)果的方差分析以及回歸分析在Design-Expert 8.06軟件中進行.

.4.2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型 本研究創(chuàng)建了一個3-10-1型的前饋反向傳播（BP）網(wǎng)絡(luò)（圖1），以Box-Behnken試驗結(jié)果作為訓(xùn)練和驗證數(shù)據(jù)，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的誤差函數(shù)作為遺傳算法的適應(yīng)度函數(shù)，對BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的權(quán)值和閾值進行優(yōu)化.再以優(yōu)化的BP網(wǎng)絡(luò)模型，作為循環(huán)算法的函數(shù)進行循環(huán)尋優(yōu)，考察自變量X1（玉米漿濃度），X2（可溶性淀粉濃度）和X3（丙酸鈉濃度）對多殺菌素的影響.遺傳算法初始設(shè)置：迭代次數(shù)為10，種群規(guī)模為50，交叉概率為03，變異概率為0.1.建模過程在Matlab 2015b中進行.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

經(jīng)前期實驗發(fā)現(xiàn)，玉米漿、可溶性淀粉、氯化鋇、油酸丁酯對多殺菌素合成有促進作用.本研究中，通過單因子實驗初步分析了玉米漿、可溶性淀粉、氯化鋇、油酸丁酯對多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量的影響.由圖2可知，玉米漿為7 g/L時，多殺菌素產(chǎn)量達到215.9 mg/L（圖2A）；可溶性淀粉15 g/L時，多殺菌素產(chǎn)量達到282.4 mg/L（圖2B）；油酸丁酯30 mL/L時，多殺菌素產(chǎn)量達到244.3 mg/L（圖2C）；氯化鋇濃度為3 mmol/L時，多殺菌素產(chǎn)量達到304.1 mg/L（圖2D）.

2.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果

Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4.由表4可知，模型P=0.009 2，該模型是極顯著的，同時決定系數(shù)R2為0.987 3，說明該模型回歸有效，試驗設(shè)計可靠.方差分析中各組分所對應(yīng)P值越小，說明此組分對刺糖多孢菌合成多殺菌素影響越大.因此各組分重要性順序為：ρ（可溶性淀粉）（P=0.002 5），ρ（玉米漿）（P=0.007 4），ρ（丙酸鈉）（P=0.007 7），ρ（酵母粉）（P=0.015 1），ρ（豆餅粉）（P=0028 9），φ（油酸丁酯）（P=0.039 7），c（氯化鋇）（P=0.091 0），ρ（棉籽粉）（P=0.598 6）.因為超過3個因子的Box-Behnken試驗設(shè)計實驗組數(shù)將大大增加，所以選擇前三個影響達到極顯著的培養(yǎng)基組分進行后續(xù)的研究.endprint

2.3 響應(yīng)面分析

Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6.由表6可見，模型失擬項（P=0.451 5>005）差異不顯著，說明回歸方程的失擬平方和基本是由實驗誤差等偶然因素引起的，需要進一步檢驗方程回歸結(jié)果是否顯著.回歸模型P<0.000 1，說明回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間關(guān)系時，其因變量與全體自變量之間的線性關(guān)系是極其顯著的，即該實驗方法可靠；分析得到一個多殺菌素產(chǎn)量對玉米漿、可溶性淀粉和丙酸鈉的二次多項式回歸模型為：

回歸方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.990 6，說明響應(yīng)值的變化有99.06%來源于所選因素，該模型能較好地描述試驗結(jié)果；預(yù)測相關(guān)系數(shù)R2（0.924 6）與調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2（0.978 5）一致，這說明觀測值與預(yù)測值高度相關(guān)，此模型可用來分析和預(yù)測玉米漿、可溶性淀粉和丙酸鈉濃度對刺糖多孢菌發(fā)酵多殺菌素產(chǎn)量的影響.由該方程預(yù)測的最優(yōu)培養(yǎng)基各組份濃度見表7，經(jīng)驗證多殺菌素產(chǎn)量達到（538.60±8.60）mg/L.

2.4 遺傳算法優(yōu)化BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的誤差函數(shù)作為遺傳算法的適應(yīng)度函數(shù)，對BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的權(quán)值和閾值進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)群體進化到第6代時其平均適應(yīng)度不再改變，至第10代時進化終止（圖3），此時BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練樣本和驗證樣本的擬合系數(shù)分別達到0.992 6和0.996 5，均方誤差均小于0.023（圖4），說明該模型能夠很好地描述實驗因素（玉米漿、可溶性淀粉、丙酸鈉質(zhì)量濃度）與多殺菌素產(chǎn)量間的相互關(guān)系.

2.5 基于優(yōu)化后的BP網(wǎng)絡(luò)的尋優(yōu)分析

采用循環(huán)計算的方法，以訓(xùn)練好的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為目的函數(shù)，將所有能夠操作的變量組合輸入到訓(xùn)練好的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，計算所得培養(yǎng)基組分為：玉米漿7 g/L，丙酸鈉2 g/L，可溶性淀粉16 g/L時有最高多殺菌素產(chǎn)量，經(jīng)發(fā)酵驗證，此時多殺菌素產(chǎn)量為550.22±3.84 mg/L，將響應(yīng)面法優(yōu)化配方下刺糖多孢菌發(fā)酵多殺菌素產(chǎn)量與此配方下產(chǎn)量進行獨立樣本t檢驗，結(jié)果表明差異顯著（P=0.047<0.05）.

3 結(jié)論與討論

放線菌次生代謝產(chǎn)物的生物合成是一個復(fù)雜的過程，它取決于前體物質(zhì)、能量供應(yīng)、酶活性、細胞狀態(tài)和培養(yǎng)條件等因素，且這種影響往往是非線性的.在多殺菌素工業(yè)化發(fā)酵過程中，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，有利于節(jié)省成本，提高經(jīng)濟效益.RSM和Artificial Neural Network（ANN）是常用的非線性數(shù)據(jù)建模和過程優(yōu)化的分析工具.相比RSM，ANN具有明顯的優(yōu)勢：不必知道分析函數(shù)的確切形式.Box-Behnken設(shè)計是響應(yīng)面設(shè)計中最常使用的一種.在本研究中，基于Box-Behnken設(shè)計結(jié)果建立RSM和ANN模型，實現(xiàn)了對刺糖多孢菌多殺菌素發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化.在優(yōu)化過程中，模型能否高精度預(yù)測真實響應(yīng)至關(guān)重要.相比RSM，ANN模型對實驗數(shù)據(jù)的預(yù)測值更接近實驗觀測值（圖5，表7），說明ANN模型比RSM模型擬合效果更好.基于遺傳算法優(yōu)化的ANN模型尋優(yōu)，驗證最高多殺菌素產(chǎn)量為550.22 mg/L，高于由RSM模型所確定的多項式方程預(yù)測結(jié)果（表7），說明ANN模型有更好的泛化能力.類似的結(jié)果表明[13，20-21]，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在組分復(fù)雜的培養(yǎng)基優(yōu)化過程中，相比響應(yīng)面分析法更有優(yōu)勢.優(yōu)化培養(yǎng)基通常被稱為提高發(fā)酵目的產(chǎn)物產(chǎn)量的初始步驟，然而，利用遺傳算法優(yōu)化BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建模方法，在多殺菌素的發(fā)酵過程優(yōu)化中鮮有報道.本研究通過此方法成功優(yōu)化了刺糖多孢菌發(fā)酵多殺菌素的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基優(yōu)化方法的選擇上具有一定的參考意義.

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