汪玉瓊 楊窯龍 冷語佳 黃李超 陳龍 代麗萍 涂政軍 高易宏 胡江 朱麗張光恒 任德勇 高振宇 董國軍 陳光 郭龍彪 葉國友 錢前,* 曾大力,*

(1中國水稻研究所 水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310006; 2國際水稻研究所，菲律賓 馬尼拉；#共同第一作者; *通訊聯(lián)系人,E-mail:dalizeng@126.com; qianqian188@hotmail.com)

水稻小?；騍G101的鑒定和精細(xì)定位

汪玉瓊1,#楊窯龍1,#冷語佳1黃李超1陳龍1代麗萍1涂政軍1高易宏1胡江1朱麗1張光恒1任德勇1高振宇1董國軍1陳光1郭龍彪1葉國友2錢前1,*曾大力1,*

(1中國水稻研究所 水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310006;2國際水稻研究所，菲律賓 馬尼拉；#共同第一作者;*通訊聯(lián)系人,E-mail:dalizeng@126.com; qianqian188@hotmail.com)

【目的】籽粒大小是決定水稻產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一，開展水稻籽粒大小相關(guān)基因的克隆和功能研究對于闡述水稻產(chǎn)量形成的遺傳調(diào)控機(jī)制具有重要意義?！痉椒ā坷眉谆撬嵋阴フT變粳稻品種中花11，篩選獲得一小粒突變體，命名為sg101(small grain 101)。通過形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)手段調(diào)查了SG101的突變對籽粒大小、穗部主要性狀及穎殼細(xì)胞數(shù)目和大小的影響，通過測定葉夾角和胚芽鞘長度分析其對外施油菜素內(nèi)酯的差異響應(yīng)，結(jié)合定量 PCR技術(shù)分析了油菜素內(nèi)酯合成途徑和信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)情況，并利用圖位克隆的手段精細(xì)定位了水稻小?；騍G101?！窘Y(jié)果】與野生型相比，突變體sg101粒長和粒寬均極顯著減小，從而導(dǎo)致千粒重極顯著降低。此外，sg101還表現(xiàn)出結(jié)實(shí)率降低、穗長變短、二次枝梗數(shù)減少、植株變矮等。細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn) sg101的穎殼細(xì)胞大小沒有改變，但細(xì)胞數(shù)目明顯減少。定量PCR檢測表明sg101中的細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)顯著下降。另外，突變體 sg101對外施油菜素內(nèi)酯響應(yīng)遲鈍，其油菜素內(nèi)酯合成途徑和信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)亦顯著降低。【結(jié)論】遺傳分析表明sg101突變體由隱性單基因控制，通過圖位克隆的方法將SG101精細(xì)定位于第1染色體上，物理距離為265 ksb的區(qū)間內(nèi)。這為該基因的克隆及深入的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

水稻；小粒；sg101；油菜素內(nèi)酯

水稻是重要的糧食作物之一，世界一半以上的人口都以稻米作為主食。近年來，隨著人口快速增長、氣候變化以及日益嚴(yán)重的土壤污染，作物的有效種植面積逐年減少。因此，提高水稻產(chǎn)量成為保證糧食安全的重要議題。水稻產(chǎn)量主要由每株有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重共同決定，其中，粒重的大小取決于粒長、粒寬和粒厚的變化。因此，合理優(yōu)化籽粒形狀，可為培育高產(chǎn)品種提供重要保證[1]。

已有研究表明，水稻粒型大小的遺傳調(diào)控途徑復(fù)雜多樣，可能涉及泛素化蛋白降解、植物激素和G蛋白信號(hào)途徑以及不同途徑之間的相互作用等。如最先克隆的粒長基因GS3編碼由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的跨膜蛋白；長粒品種明恢63由于OSR結(jié)構(gòu)域發(fā)生堿基突變造成蛋白翻譯提前終止；野生型日本晴包含完整的4個(gè)結(jié)構(gòu)域而表現(xiàn)為中間型的籽粒；小粒品種Chuan 7由于在第5外顯子發(fā)生堿基突變，造成移碼而導(dǎo)致羧基端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域缺失[2-6]。GL3.1則為編碼一絲/蘇蛋白磷酸酶基因，由于 4個(gè) SNP位點(diǎn)的差異導(dǎo)致籽粒長度的改變[7-8]。美國的長粒粳稻品種的GL7位點(diǎn)發(fā)生了17.1 kb的DNA大片段串聯(lián)重復(fù)序列，這種基因組結(jié)構(gòu)變異導(dǎo)致基因表達(dá)量的上升而引起籽粒長度增加[9]。Hu等[10]鑒定了一個(gè)編碼水稻生長調(diào)控因子OsGRF4的基因GS2，因在miR396c靶點(diǎn)發(fā)生一個(gè)稀有顯性突變造成基因表達(dá)量的上升，促進(jìn)了細(xì)胞的分裂和生長而表現(xiàn)粒長增加。GW2編碼細(xì)胞質(zhì)E3泛素連接酶，可能參與降解促進(jìn)細(xì)胞分裂的蛋白而調(diào)控籽粒大小[11-12]。GW5/qSW5表現(xiàn)與多聚有相互作用，通過泛素蛋白酶體途徑調(diào)控籽粒寬度[13]。GS5通過上調(diào)細(xì)胞周期基因的表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞分裂而調(diào)控籽粒的大小[14]，而GW8編碼啟動(dòng)子結(jié)合蛋白，高表達(dá)的GW8促進(jìn)細(xì)胞分裂、增加粒寬[15]。

水稻粒型基因中除了控制籽粒大小的主效QTL之外，還有許多與生長發(fā)育和激素傳導(dǎo)相關(guān)的基因也影響籽粒大小。如 D61、D11、SMG1、DSG1、BG1-D[16-20]也影響籽粒大小、株高及葉片形態(tài)等。本研究通過EMS誘變粳稻品種中花11，在田間發(fā)現(xiàn)了一粒型變小且能穩(wěn)定遺傳的小粒突變體，并命名為sg101 (small grain 101)。從表型、生理、遺傳等方面對該突變體進(jìn)行鑒定，明確了其遺傳特性，并對該突變基因進(jìn)行了精細(xì)定位。通過對突變體的研究，有利于進(jìn)一步了解水稻籽粒發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，為水稻傳統(tǒng)育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

利用EMS誘變粳稻品種中花11，從中篩選到一個(gè)小粒突變體，經(jīng)多代連續(xù)自交，獲得突變表型穩(wěn)定的小粒突變體，命名為sg101(small grain 101)。遺傳分析是利用突變體分別與臺(tái)中本地1號(hào)(TN1)、南京6號(hào)、9311雜交，觀察并統(tǒng)計(jì)F1植株表型和F1自交形成的F2植株表型。

1.2突變體表型分析

將野生型中花11和突變體sg101在同一時(shí)期、相鄰小區(qū)種植，并設(shè)置3個(gè)重復(fù)；每個(gè)小區(qū)種植6行，每行6株；待到植株成熟后分別對野生型中花11和突變體sg101的株高、各節(jié)間長度、穗長、每穗粒數(shù)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)、粒長、粒寬、千粒重等農(nóng)藝性狀進(jìn)行測定。取樣時(shí)排除邊際效應(yīng)，取中部植株并且測量的均為植株主穗，重復(fù)6次。

1.3細(xì)胞學(xué)觀察

1.3.1 石蠟切片觀察

取中花11和突變體sg101抽穗后且未開花的穎殼，將其迅速置于FAA固定液 (38%甲醛5 mL，冰醋酸5 mL，70%酒精90 mL) 中，并對固定的材料進(jìn)行真空抽氣，樣品經(jīng)軟化、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色等，倒置在光學(xué)顯微鏡下(Nikon 90i)拍照。

1.4sg101突變體基因定位

本研究利用混合分離分析法(BSA)構(gòu)建突變體混池，在定位群體中取帶有突變表型的單株 30株左右，分別稱取等量葉片混合，利用CTAB法提取DNA[21]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的163對SSR標(biāo)記對分離雙親、F1和混池的多態(tài)性進(jìn)行分析，選取突變體與混池DNA電泳條帶一致的標(biāo)記，即與突變基因SG101連鎖的標(biāo)記，再取 93株帶有突變表型單株對得到的連鎖標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證。將SG101定位于兩標(biāo)記之間，并利用秈稻 9311序列(http://www.rise.genomics.org.cn)和粳稻日本晴(NPB)序列(http://rgp.dna.affrc.go.jp)，在目標(biāo)區(qū)間開發(fā)多態(tài)性標(biāo)記，進(jìn)一步進(jìn)行精細(xì)定位。應(yīng)用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

1.5 油菜素內(nèi)酯(BR)處理

1.5.1 葉夾角試驗(yàn)

將中花11和sg101種子脫殼后滅菌，在1/2 MS培養(yǎng)基上發(fā)苗，在30℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)條件為16 h光照/8 h黑暗，待小苗長到1葉1心后，剪掉基部，并置于不同濃度梯度(分別是0.00、0.01、0.10、1.00 μmol/L)的油菜素內(nèi)酯(2,4-epiBL)水溶液中浸泡，28℃下黑暗處理 2 d。處理結(jié)束后，用量角器測量葉夾角，并選典型的小苗拍照。

1.5.2胚芽鞘伸長試驗(yàn)

將中花11和sg101種子脫殼后滅菌，在含有不同濃度油菜素內(nèi)酯(分別是 0.00、0.01、0.10、1.00 μmol/L)的1/2 MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，30℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng) 7 d，培養(yǎng)結(jié)束后，量取胚芽鞘的長度并拍照。

1. 6 RT-PCR

用總RNA提取試劑盒提取突變體sg101和野生型中花11的幼苗的根和莖葉部位總RNA，利用經(jīng)過DNase Ⅰ處理過的總RNA為模板，使用實(shí)時(shí)PCR用 cDNA合成試劑盒(TOYOBO)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。利用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)分別檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因和油菜素內(nèi)酯合成途徑及信號(hào)途徑相關(guān)基因在野生型和突變體根莖葉中的表達(dá)量，以 UBQ5(LOC_Os01g22490)作為內(nèi)參基因。10 μL實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系如下：cDNA模板1 μL，2× SYBR?Select Master Mix(TOYOBO) 5 μL,正反引物(10 μmol/L)各 0.35 μL，ddH2O 補(bǔ)足 10 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR程序如下：95℃下反應(yīng)10 min，95℃下反應(yīng)15 s；60℃下反應(yīng)1 min，72℃下反應(yīng)15 s，40個(gè)循環(huán)。用 2-△△Ct法計(jì)算各基因的相對表達(dá)量。用于檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因、油菜素內(nèi)酯合成途徑和信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)量的引物見表1。

表1 本研究用于RT-PCR分析的引物Table 1. Primers used for real-time RT-PCR in the study.

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體sg101表型特征和農(nóng)藝性狀分析

與野生型中花11相比，突變體sg101的籽粒顯著變小(圖1)，粒長、粒寬分別只有6.67 mm和5.20 mm，僅為野生型的78%和90%。由于sg101的籽粒在粒長和粒寬上均比野生型顯著減小，由此導(dǎo)致sg101在千粒重上也顯著降低，結(jié)果顯示突變體sg101的千粒重只有16.63 g，比野生型中花11的千粒重(25.5 g)下降了35%左右(圖1-E)。sg101除了籽粒變小之外，還表現(xiàn)植株變矮，其株高只有野生型的60% (圖1-F)。通過進(jìn)一步比較野生型和突變體sg101各節(jié)間長度，發(fā)現(xiàn)突變體各節(jié)間長度較野生型均發(fā)生不同程度縮短，其中第 1節(jié)間下降最大，節(jié)間長度僅為野生型的60%(圖1-G、H)。此外，突變體sg101還表現(xiàn)其他農(nóng)藝性狀的改變，如穗長縮短，一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)和每穗穎花數(shù)減少，結(jié)實(shí)率下降等(表2)。

2.2 突變體sg101籽粒的細(xì)胞數(shù)目減少

水稻籽粒大小通常由穎殼細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)目的多少?zèng)Q定。為了明確突變體sg101籽粒變小的原因，我們對完全抽穗但尚未開花的野生型中花11和突變體 sg101的穎殼石蠟切片進(jìn)行觀察(圖2-A～C)。通過對穎殼橫切面細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)野生型中花 11的細(xì)胞數(shù)目可達(dá) 1640個(gè)，而突變體sg101只有1470個(gè)，突變體較野生型減少了10%(圖2-D)。另外，我們還通過掃描電鏡比較了中花 11和sg101穎殼內(nèi)表皮的細(xì)胞大小(圖2-E～F)，結(jié)果表明其細(xì)胞大小沒有顯著差異(圖 2-G)。由此，我們推斷sg101突變體籽粒變小是由細(xì)胞數(shù)目減少引起。

2.3 突變體sg101細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)

圖1 野生型中花11和突變體sg101的表型比較Fig. 1. Phenotypes of Zhonghua 11(WT) and sg101.

表2 野生型中花11和突變體sg101的穗部性狀比較Table 2. Comparison of panicle-related traits between Zhonghua 11 and sg101.

細(xì)胞數(shù)目的變化通常與細(xì)胞分裂的改變有關(guān)，為了確定突變體sg101細(xì)胞數(shù)目變少是否與細(xì)胞分裂有關(guān)，我們利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析細(xì)胞周期相關(guān)基因在野生型和突變體中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在突變體sg101中，我們所檢測的5個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)均大幅下降(圖3)。其中，E2F2的表達(dá)量不到野生型的 10%，而 CYCT1:2、CYCD4:1、CYCD7:1和CYCB2:2也只有野生型1/5左右。sg101中細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的顯著下調(diào)，表明SG101可能通過調(diào)控細(xì)胞周期的變化而影響籽粒的大小。

2.4sg101對油菜素內(nèi)酯(BR)處理的響應(yīng)

sg101植株矮小、葉色深綠、籽粒小而圓且葉夾角變小，呈BR相關(guān)突變體的類似表型。為檢測sg101是否與油菜素內(nèi)酯合成或者信號(hào)途徑有關(guān)，我們利用油菜素內(nèi)酯2,4-epiBL處理野生型中花11和突變體sg10幼苗來測試其對BR的敏感性。由圖4-A可以看出，中花11的葉夾角隨著2,4-epiBL濃度的增加而增大，當(dāng)2,4-epiBL的濃度達(dá)1 μmol/L時(shí)，中花11的葉夾角已明顯下垂；而突變體sg101葉夾角的變化始終不明顯(圖4-B)。另外，我們還進(jìn)一步比較了外施BR時(shí)胚芽鞘的伸長狀況。由圖4-C發(fā)現(xiàn)，2,4-epiBL可以促進(jìn)野生型中花11和sg101的胚芽鞘生長，中花11對2,4-epiBL更敏感。

另外，我們還利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測了油菜素內(nèi)酯合成相關(guān)基因D2、OsCPOD和DWARF-4Q以及信號(hào)途徑相關(guān)基因BU1、BZRF、D61、PAVL1、OSLIC和OsMDP1在野生型和sg101幼根中的表達(dá)情況(圖5)。結(jié)果顯示，除OsLIC外，所檢測的其他與BR合成和信號(hào)途徑的相關(guān)基因的表達(dá)均有不同程度的下降。D2在sg101中的表達(dá)只有野生型的34%左右，BR信號(hào)途徑中的BU1、BZRF、D61分別只有野生型的27%、11%和21%。由此可以推斷突變體sg101對外源BR處理表現(xiàn)鈍感可能是其BR合成途徑和信號(hào)途徑受到影響。

圖2 野生型中花11和突變體sg101籽粒的比較Fig. 2. The comparison of grain between Zhonghua 11(WT) and sg101.

圖3 細(xì)胞周期相關(guān)基因在野生型中花11和突變體sg101中的表達(dá)差異Fig. 3. Expression levels of cell cycle-related genes in the wild type(WT) and sg101.

2.5SG101的遺傳分析

為了明確水稻矮稈小粒突變體sg101的遺傳特性，將突變體sg101分別與秈稻品種TN1、南京06號(hào)、9311進(jìn)行正、反交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明不論是正交還是反交，F(xiàn)1單株均表現(xiàn)與野生型類似的表型，說明該表型是受隱性基因控制的(表3)；通過對各組合F2代分離群體中正常表型與突變表型植株數(shù)量比值進(jìn)行 χ2測驗(yàn)，其結(jié)果均為 χ2＜χ20.05,1=3.84，顯示野生型植株和突變表型的單株在各 F2群體中的分離比符合 3∶1，表明sg101的突變表型是由單基因控制的質(zhì)量性狀(表3)。

2.6SG101基因定位

為了分離SG101基因，我們用sg101與TN1雜交后代F2群體中選取2600株具突變表型的植株作為定位群體，從中隨機(jī)挑選30株構(gòu)建突變體混池，利用本實(shí)驗(yàn)室均勻分布于12條染色體上的163對SSR和InDel標(biāo)記，挑選在sg101和TN1間呈多態(tài)性的分子標(biāo)記用于初步定位。瓊脂糖凝膠電泳檢測sg101、TN1、F1和突變體混池的PCR產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)水稻第1染色體上SSR標(biāo)記RM8097的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物明顯偏向突變體sg101帶型，推測RM8907可能與目標(biāo)基因連鎖。將用于構(gòu)建混池突變體的30株分別提取DNA，并對RM8907及其附近的SSR標(biāo)記RM6703和RM3738進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示大部分單株在這兩個(gè)標(biāo)記上的帶型與sg101一致，表明這兩個(gè)標(biāo)記亦與目標(biāo)基因連鎖。進(jìn)一步用93個(gè)具sg101表型的F2單株進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記RM8097、RM6703和RM3738的交換個(gè)體分別為15、10和16，RM3738的交換單株不包含RM6703的單株，而RM8907的交換單株與RM6703和RM3738各不相同，因此推斷目標(biāo)基因SG101介于SSR標(biāo)記RM8907和RM6703之間，其遺傳距離分別為8.1 cM和5.4 cM(圖6-A)。

圖4 中花11和突變體sg101對2,4-epiBL處理的響應(yīng)Fig. 4. Lamina joint test to 2,4-epiBL in Zhonghua 11(WT) and sg101.

圖5 BR合成和信號(hào)途徑相關(guān)基因在野生型中花11和突變體sg101中的表達(dá)Fig. 5. Expression levels of BR synthesis and signal transduction pathway genes in Zhonghua 11(WT) and sg101.

表3 SG101的遺傳分析Table 3. Genetic analysis ofSG101.

圖6 SG101的遺傳定位Fig. 6. Molecular mapping of SG101.

為了對 SG101進(jìn)行精細(xì)定位，在 RM8907和RM6703之間開發(fā)多個(gè)有多態(tài)性的InDel標(biāo)記(表4)，利用這些標(biāo)記對F2群體的2600個(gè)突變單株進(jìn)行連鎖分析，將目標(biāo)基因 SG101最終界定于分子標(biāo)記S3和 S4之間大約 265 kb的物理區(qū)間內(nèi)。通過Gramene和 Ricedata等網(wǎng)站預(yù)測，該區(qū)間共有 43個(gè)開放閱讀框，其中5個(gè)編碼逆轉(zhuǎn)座子蛋白，1個(gè)編碼轉(zhuǎn)座子蛋白，10個(gè)編碼表達(dá)的蛋白，2個(gè)編碼假定的蛋白，7個(gè)編碼推斷的細(xì)胞色素P450，3個(gè)編碼生長素代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，3個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子，1個(gè)編碼細(xì)胞分裂素相關(guān)蛋白，還有編碼水解酶蛋白、脫氫酶蛋白、微管相關(guān)蛋白、類囊體相關(guān)蛋白，50S核糖體蛋白、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白以及推斷的5個(gè)功能蛋白，但該區(qū)間內(nèi)未見已克隆的與籽粒大小相關(guān)基因的報(bào)道。因此，推測SG101可能是與籽粒大小有關(guān)的新基因。

3 討論

水稻不僅是重要的糧食作物，而且還是植物生物學(xué)研究的模式作物。高產(chǎn)一直是水稻育種改良的重要目標(biāo)，而粒型的大小直接決定粒重的變化，是水稻產(chǎn)量的重要影響因素之一。因此，深入研究水稻粒型變化的分子機(jī)理不僅有助于進(jìn)一步了解水稻產(chǎn)量形成機(jī)制，還可為水稻育種提供新的基因資源，具有重要的意義。

近些年，對調(diào)控籽粒大小做了很多研究，有研究指出器官大小由細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞大小共同決定，與之對應(yīng)的是兩個(gè)基本過程，即細(xì)胞增殖和細(xì)胞伸長[22,23]。而細(xì)胞增殖和細(xì)胞伸長與植物體內(nèi)激素含量相關(guān)。調(diào)控水稻粒重和灌漿的主效基因TGW6編碼一個(gè)吲哚乙酸-葡萄糖水解酶，在水稻籽粒發(fā)育階段通過控制生長素(IAA)的供應(yīng)影響細(xì)胞數(shù)目和籽粒長度[24]。Bg1-D是生長素的原初響應(yīng)基因，參與生長素的轉(zhuǎn)運(yùn)，通過控制細(xì)胞數(shù)目來影響籽粒大小，從而增加粒重[20]?？刂扑久克雽?shí)粒數(shù)的主效基因Gn1a，編碼一種降解細(xì)胞分裂素(CTK)的酶，抑制該基因的表達(dá)會(huì)使細(xì)胞分裂素在分生組織中積累，從而導(dǎo)致株高和每穗粒數(shù)的增加[25]。D1編碼赤霉素(GA)合成過程中的赤霉素3β羥化酶，突變體d1通過抑制細(xì)胞分裂表現(xiàn)出矮稈和小圓粒的表型[26]。

油菜素內(nèi)酯(BR)是植物體內(nèi)廣泛存在的一類甾醇類激素，在自然界中已發(fā)現(xiàn)超過70種BR[27]，目前已經(jīng)篩選很多與BR相關(guān)的突變體[28,29]。BR通過促進(jìn)細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)張正向調(diào)控細(xì)胞大小，所以水稻BR不敏感突變體和合成受阻突變體均表現(xiàn)出矮稈、葉夾角減小、籽粒變小、葉色變深和育性下降等表型，如d1、d11和d61等。本研究中突變體sg101表現(xiàn)出典型的BR缺失表型，如植株矮小、籽粒變小、結(jié)實(shí)率下降，生理實(shí)驗(yàn)也證明了該突變體對BR反應(yīng)遲鈍，說明SG101可能參與BR調(diào)控途徑來影響籽粒大小，SG101的克隆和功能研究為BR調(diào)控水稻籽粒大小提供新的線索。如D11編碼一個(gè)細(xì)胞色素P450，與幾個(gè)油菜素內(nèi)酯合成酶有很高的同源性，該基因的隱性突變導(dǎo)致BR生物合成受阻，突變體d11與野生型相比，植株變矮、籽粒變小[30]。D61/OsBRI1編碼BR的受體蛋白BRI1，該基因的突變會(huì)影響細(xì)胞分裂和伸長，調(diào)控器官的發(fā)育，導(dǎo)致植株矮小、葉片直立和籽粒變小[31]。BR信號(hào)傳遞途徑上，BU1是水稻BR信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的正調(diào)控因子，過量表達(dá)該基因?qū)е伦蚜Ｔ龃骩16]。因此，植物激素深刻地影響種子發(fā)育并且直接或間接影響種子大小，尤其是細(xì)胞分裂素、油菜素內(nèi)酯和生長素在控制籽粒大小方面起極其重要的作用。

本研究從中花11為背景的突變體庫中篩選到一個(gè)籽粒變小的突變體sg101，并進(jìn)行了遺傳分析和精細(xì)定位。遺傳分析表明該基因受一對隱性核基因控制，并將SG101精細(xì)定位于第1染色體長臂上，介于分子標(biāo)記S3和S4之間的265 kb區(qū)間內(nèi)。而第1染色體上已報(bào)道的控制水稻株高的sd1、控制水稻每穗粒數(shù)的主效基因Gn1a、影響細(xì)胞分裂和伸長的D61/OsBRI1均不在該區(qū)間內(nèi)。因此，推斷SG101為一新的與籽粒大小相關(guān)的基因，在推斷的43個(gè)開放閱讀框中，除6個(gè)編碼逆轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座子蛋白，12個(gè)假定/表達(dá)蛋白外，其中的細(xì)胞色素P450、生長素代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞分裂素相關(guān)蛋白、微管相關(guān)蛋白和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白均可能參與籽粒大小的調(diào)控，需要作進(jìn)一步的精細(xì)定位以及候選基因的功能互補(bǔ)。

表4 本研究中SG101定位所用引物Table 4. Primers used for fine mapping of SG101 in this study.

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Identification and Fine Mapping of Small Grain Gene SG101 in Rice (Oryza sativa L.)

WANG Yuqiong1,#,YANG Yaolong1,#,LENG Yujia1,HUANG Lichao1,CHEN Long1,DAI Liping1,TU Zhengjun1,GAO Yihong1,HU Jiang1,ZHU Li1,ZHANG Guangheng1,REN Deyong1,GAO Zhenyu1,DONG Guojun1,CHEN Guang1,GUO Longbiao1,YE Guoyou2,QIAN Qian1,*,ZENG Dali1,*
(1 State Key Laboratory of Rice Biology,China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China; 2International Rice Research Institute,Makati City,Philippines; #These authors contributed equally to this work; *Corresponding author,E-mail: dalizeng@126.com; qianqian188@hotmail.com)

【Objective】Grain size is an important agronomic trait in determining grain yield. The characterization and identification of grain size related genes will be beneficial to expound the genetic regulatory mechanisms behind yield formation in rice. 【Method】Here,we report the characterization of a rice (Oryza sativa L.) mutant,small grain 101(sg101),gained by EMS mutagenesis for Zhonghua 11. The effects of sg101 on grain size,panicle-related traits,cell number and size of lemma were assessed by morphological and cytological methods. The responses to brassinolide(BR)were detected based on the variation in leaf angle and coleoptile length. The expression level of BR signal and synthesis related genes were tested by RT-PCR. Map-based cloning was executed for fine mapping of SG101.【Result】The grain length,grain width and grain weight were significantly reduced in sg101. Moreover,sg101 showed decreased panicle length,secondary rachis branch number,plant height and seed setting rate. The paraffin section observation under a scanning electron microscope indicated that the cell number in sg101 was significantly decreased,while the cell size was similar to wild type,suggesting that SG101 affected the grain size by regulating the cell division. Quantitative RT-PCR analysis displayed that the expression of cell cycle related genes was reduced in sg101. After treatment with BR,sg101 showed smaller leaf angle and shorter coleoptile than those of the wild type and the expression of BR biosynthetic and signal pathway related genes was down-regulated in sg101. Genetic analysis revealed that sg101 phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene.【Conclusion】SG101 was mapped on the long arm of chromosome 1 between two STS markers S5 and S6 with a 265 kb physical distance. It laid a base for the further cloning and functional analysis of SG101.

rice; small grain; sg101; brassinolide

Q343.5; S511.032

A

1001-7216(2017)06-0580-10

10.16819/j.1001-7216.2017.6152

2016-11-15; 修改稿收到日期：2017-04-03。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(91435105,91735303,31661143006); 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程資助項(xiàng)目。