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(1.貴州師范學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550018;2.貴州元亨山茶葉籽生物科技有限公司,貴州貴陽(yáng) 550018;3.河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;4.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江金華 321017)

茶葉籽酵母的分離鑒定及其發(fā)酵特性研究

姜金仲1,2,楊鵬鳴3,王興春2,穆安德2,鄭寨生4

(1.貴州師范學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550018;2.貴州元亨山茶葉籽生物科技有限公司,貴州貴陽(yáng) 550018;3.河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;4.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江金華 321017)

為了闡明酵母菌在茶葉籽水漿發(fā)酵分層過(guò)程中的作用,從發(fā)酵5 h的發(fā)酵液分離、純化出一株酵母菌(編號(hào):JJZ11)。通過(guò)形態(tài)觀察、ITS rDNA及26S rDNA基因測(cè)序與比對(duì),以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建與分析,確定JJZ11為Meyerozymacaribbica的一個(gè)菌株,命名為茶葉籽酵母(MeyerozymacaribbicaJJZ11),菌種保藏號(hào)為CCTCC M 2016470。在茶葉籽水漿發(fā)酵過(guò)程中:茶葉籽水漿發(fā)酵液中茶葉籽酵母數(shù)量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少,進(jìn)行到10 h時(shí),降低為零;發(fā)酵液pH隨時(shí)間的延長(zhǎng)由開(kāi)始時(shí)的6.2逐漸降低,10 h時(shí)為3.73。當(dāng)培養(yǎng)基pH小于4.3時(shí),茶葉籽酵母的菌落數(shù)量均為零。茶葉籽水漿發(fā)酵分層過(guò)程與茶葉籽酵母的數(shù)量變化具有同步性,所以,茶葉籽酵母是引起茶葉籽水漿發(fā)酵分層的主要微生物之一。

茶葉籽酵母,MeyerozymacaribbicaJJZ11,茶葉籽水漿,發(fā)酵分層,茶葉籽

茶葉籽油是以茶葉樹(shù)(Camelliasinensis)的種子為原料生產(chǎn)的食用油,因其富含多種生物活性成分而被譽(yù)為東方橄欖油[1-2]。我國(guó)有茶園面積約120萬(wàn)公頃,按每公頃產(chǎn)茶葉籽37.5 kg計(jì)算,年產(chǎn)茶籽約4.5億千克;利用這些茶葉籽可以生產(chǎn)茶葉籽油45000 t、茶葉籽淀粉27000 t。但是,由于傳統(tǒng)茶葉籽油生產(chǎn)工藝還存在產(chǎn)率低、產(chǎn)品單一、茶葉籽組成成分相互污染以及毛油味道“戟喉”苦等問(wèn)題,這些茶葉籽資源目前僅有不到百分之十得到了利用,其余大部分被自然腐爛在茶園里。為了解決茶葉籽油傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝存在的問(wèn)題,姜金仲報(bào)道了一種茶葉籽油生產(chǎn)新工藝-茶葉籽油生物發(fā)酵生產(chǎn)工藝[3-4],該工藝的核心是“茶葉籽水漿發(fā)酵分層現(xiàn)象”,即通過(guò)生物發(fā)酵將茶葉籽水漿分為三層,然后取出上層加熱生產(chǎn)茶葉籽油;該工藝的最大優(yōu)點(diǎn)是在生產(chǎn)茶葉籽油的過(guò)程中有效避免了茶葉籽其他構(gòu)成成分對(duì)茶葉籽油的污染,同時(shí)又能生產(chǎn)茶葉籽淀粉,提高了茶葉籽油的產(chǎn)率及茶葉籽資源利用率[4]。既然發(fā)酵分層是由發(fā)酵引起的,發(fā)酵液中就必然存在發(fā)酵微生物。因此,本文對(duì)發(fā)酵液中的一種微生物(茶葉籽酵母)進(jìn)行了分離鑒定,并對(duì)其發(fā)酵特性進(jìn)行了研究,以期為茶葉籽酵母的進(jìn)一步利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

茶葉籽仁 土炕烘干帶內(nèi)種皮茶葉籽仁,種子主要采摘自湖北省隨州市廣水市福建大白茶品種,茶葉籽仁含水率8.4%、含油率(索氏抽提法)26.2%;MRS固體培養(yǎng)基 按照文獻(xiàn)[5]方法配制;石油醚 德州潤(rùn)昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;蛋白胨 安琪酵母有限公司;牛肉膏 德州潤(rùn)昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;酵母膏 廣州市昕迪實(shí)驗(yàn)器材有限公司;K2HPO4佛山市順德區(qū)魏瑪化工有限公司;NaOAc 北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心;瓊脂 安琪酵母股份有限公司。

XSP-9CA光學(xué)顯微鏡 上海光學(xué)儀器一廠;PHSJ-4A pH計(jì) 西安禾普生物科技有限公司;GL124-1SCN電子天平 季爾國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司;TG16-WS高速離心機(jī) 濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司;ET-7打漿機(jī) 湖北武漢宏旭機(jī)械設(shè)備責(zé)任有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶葉籽水漿發(fā)酵液的制備 稱取茶葉籽仁100 g,加清水300 g于35 ℃條件下浸泡16 h,將浸泡好的茶葉籽清洗后加水300 g進(jìn)行2輪打漿、過(guò)濾得濾液(茶葉籽水漿),將濾液置于35 ℃恒溫發(fā)酵,約5 h左右,濾液開(kāi)始明顯分為上、中、下三層,備用。

1.2.2 酵母的分離純化 在茶葉籽水漿發(fā)酵進(jìn)行到5 h時(shí),從發(fā)酵液中層取樣,在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng),培養(yǎng)溫度25 ℃;長(zhǎng)出菌落后,挑選獨(dú)立的菌落,用接種針挑取樣本放在載玻片上,用美藍(lán)染色[6],觀察是否是類似酵母菌的細(xì)胞,如果是類似酵母菌的細(xì)胞,接種擴(kuò)大繁殖該菌落,再進(jìn)行鑒定繁殖,反復(fù)4次,得到一株類似酵母的細(xì)胞純種,編號(hào)為JJZ11。

1.2.3 JJZ11菌株的鑒定 按照鑒定手冊(cè)[7]中的方法對(duì)JJZ11菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及鑒定。包括:菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)的觀察;繁殖特性及假菌絲的觀察等;顯微鏡60倍鏡下觀察拍照。

ITS rDNA及26S rDNA序列測(cè)定、分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建[8]:ITS rDNA及26S rDNA的序列測(cè)定、分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)繪制由中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院微生物檢測(cè)中心完成;測(cè)序結(jié)果利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast同源序列檢索,然后采用MEGA5.0軟件進(jìn)行同源性分析,1000次相似度重復(fù)計(jì)算,構(gòu)建以置信度為依據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 發(fā)酵液茶葉籽酵母數(shù)量鏡檢測(cè)定 按照1.2.1的方法制取發(fā)酵液,從茶葉籽水漿放入水浴鍋內(nèi)開(kāi)始,每隔1 h從發(fā)酵分層的中層液中取5 mL樣液放于試管中,在80 ℃下水浴加熱5 min后,用膠頭滴管取一滴于載玻片中央,用美藍(lán)染色[6],蓋上蓋玻片,在顯微鏡60倍鏡下觀察,取分別位于蓋玻片四角及中央的5個(gè)視野觀察,并記錄視野下的似酵母菌細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5 茶葉籽水漿發(fā)酵液pH的測(cè)定 從發(fā)酵開(kāi)始,每隔1 h取出發(fā)酵液50 mL,過(guò)濾,4000 r/min離心10 min,用pH計(jì)測(cè)定pH。

1.2.6 培養(yǎng)基pH對(duì)茶葉籽酵母生長(zhǎng)的影響 以MRS固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ),用稀酸及稀堿調(diào)節(jié)pH,使培養(yǎng)基pH分別為4.3、5.3、6.3、7.3及8.3。然后滅菌、常規(guī)涂布法接種,恒溫箱中25 ℃進(jìn)行培養(yǎng),每3 h觀察一次生長(zhǎng)現(xiàn)象及培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SSPS 17.0及Excel處理。

2 結(jié)果與分析

2.1JJZ11菌株的菌落及個(gè)體形態(tài)

JJZ11菌株28 ℃培養(yǎng)7 d的菌落如圖1所示,由圖1可以看出:JJZ11菌株的菌落呈奶油狀,乳白色,表面平伏,光滑反光。茶葉籽酵母28 ℃培養(yǎng)72 h的個(gè)體形態(tài)如圖2所示,細(xì)胞近球形、橢圓形或棒狀,大小1.3～2.0 μm×2.0～5.5 μm,有假菌絲,出芽繁殖。

圖1 JJZ11菌株的菌落

圖2 JJZ11菌株細(xì)胞及出芽

圖3 JJZ11的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2JJZ11菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立與分析

JJZ11菌株的ITS rDNA序列全長(zhǎng)為516 bp,26S rDNA序列全長(zhǎng)為533 bp。利用Blast進(jìn)行序列同源檢索,與Meyerozymacaribbica的相似度為100%。以ITS rDNA及26S rDNA的同源性為基礎(chǔ),用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,得到系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3。系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果表明,該系統(tǒng)樹(shù)中MeyerozymacaribbicaCBS9966T(FUNCBS/AY187283)是一個(gè)單獨(dú)的外群種,JJZ11菌株與該種單獨(dú)構(gòu)成一個(gè)分支;二者序列的相似性最大,遺傳距離最小,JJZ11菌株與該種的親緣關(guān)系最近;因此,中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院微生物檢測(cè)中心將JJZ11菌株鑒定為:Meyerozymacaribbica的一個(gè)菌株,將該菌株命名為茶葉籽酵母(MeyerozymacaribbicaJJZ11)。菌種已于2016年9月9日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏號(hào)為CCTCC M 2016470。

2.3茶葉籽酵母細(xì)胞在茶葉籽水漿發(fā)酵過(guò)程中的數(shù)量動(dòng)態(tài)

為了確定茶葉籽酵母(MeyerozymacaribbicaJJZ9911)在茶葉籽水漿發(fā)酵中的作用,測(cè)定了茶葉籽水漿發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)段發(fā)酵液中茶葉籽酵母細(xì)胞的數(shù)量,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可以看出,茶葉籽酵母細(xì)胞的數(shù)量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)整體下降趨勢(shì),發(fā)酵進(jìn)行到10 h時(shí),茶葉籽酵母細(xì)胞的數(shù)量已經(jīng)降為零。這說(shuō)明發(fā)酵開(kāi)始時(shí)茶葉籽酵母細(xì)胞的數(shù)量最多,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),中層液茶葉籽酵母的數(shù)量會(huì)逐漸減少。其可能的原因是:隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),發(fā)酵液已逐漸不適合茶葉籽酵母的生長(zhǎng);到10 h時(shí),發(fā)酵液已完全不適合茶葉籽酵母的生長(zhǎng)。

圖4 發(fā)酵液中茶葉籽酵母細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)

由圖4還可以看出,雖然發(fā)酵5 h以前,茶葉籽酵母細(xì)胞的數(shù)量有所減少,但減少幅度較小,最低點(diǎn)比最高點(diǎn)只降低了21.3%;但是,5 h之后降低幅度迅速增大,直至細(xì)胞數(shù)量為零。

2.4茶葉籽水漿發(fā)酵液的pH變化趨勢(shì)

由2.3可知,茶葉籽水漿發(fā)酵進(jìn)行到10 h時(shí),在茶葉籽水漿發(fā)酵中層液內(nèi)已不存在茶葉籽酵母。為了解釋這種現(xiàn)象發(fā)生的原因,對(duì)茶葉籽水漿發(fā)酵液的pH進(jìn)行了跟蹤測(cè)定,結(jié)果如圖5。發(fā)酵液pH隨時(shí)間的延長(zhǎng)由開(kāi)始時(shí)的6.2逐漸降低,10 h時(shí)為3.73,到13 h時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)3.39,以后又呈現(xiàn)出小幅度振蕩走高趨勢(shì)。

圖5 發(fā)酵液pH隨發(fā)酵時(shí)間的變化

2.5培養(yǎng)基pH對(duì)茶葉籽酵母生長(zhǎng)的影響

由上述茶葉籽水漿發(fā)酵液pH變化趨勢(shì)可以看出,茶葉籽水漿發(fā)酵液中茶葉籽酵母的數(shù)量與發(fā)酵液的pH變化趨勢(shì)有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系,為了驗(yàn)證發(fā)酵液pH變化是否為影響茶葉籽水漿發(fā)酵液中茶葉籽酵母數(shù)量的因素,對(duì)茶葉籽酵母進(jìn)行了培養(yǎng)基模擬培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖6。由圖6可以看出,在給出的5個(gè)培養(yǎng)觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)(36、39、42、45、48 h)數(shù)量變化曲線中,當(dāng)培養(yǎng)基pH為4.3時(shí),培養(yǎng)基上的酵母菌落數(shù)量均為零,這說(shuō)明在培養(yǎng)基pH等于4.3時(shí),茶葉籽酵母已不能正常生長(zhǎng)。

圖6 不同培養(yǎng)基pH條件下菌落數(shù)的變化

3 討論

3.1關(guān)于茶葉籽酵母的鑒定

茶葉籽酵母為Meyerozymacaribbica酵母的一個(gè)菌株,具有茶葉籽水漿發(fā)酵分層作用,目前未見(jiàn)國(guó)內(nèi)有關(guān)Meyerozymacaribbica的研究報(bào)道。國(guó)外最早報(bào)道Meyerozymacaribbica是Kurtzman CP等[9]。Meyerozymacaribbica雖然有自己的屬名及種名,但它卻是發(fā)酵假絲酵母(Candida fermentati)的無(wú)性型,所以,又稱為無(wú)性型發(fā)酵假絲酵母(anamorph Candida fermentati)[10],可見(jiàn)它的有性菌株屬于另外一個(gè)屬。Kim[11]報(bào)道過(guò)Meyerozymacaribbica的一個(gè)菌株:MeyerozymacaribbicaMG20W,認(rèn)為MG20W的基因組(complete genome sequence)與MeyerozymaguilliermondiiATCC 6260T的親緣關(guān)系最近,且該菌株具有嗜鹽的特性;而茶葉籽酵母卻與MeyerozymacaribbicaCBS9966T(FUNCBS/AY187283)的親緣關(guān)系最近;這說(shuō)明利用全基因組序列(complete genome sequence)進(jìn)行親緣關(guān)系比對(duì)時(shí),其比對(duì)結(jié)果與ITS rDNA及26S rDNA的比對(duì)結(jié)果有所差異。

茶葉籽水漿含有大量的茶皂素,茶皂素對(duì)多種酵母菌具有顯著的抑制作用[12],但作為酵母的MeyerozymacaribbicaJJZ11菌株卻能在茶葉籽水漿發(fā)酵過(guò)程中繁殖生長(zhǎng),結(jié)合Kim[11]報(bào)道的MG20W嗜鹽特性,說(shuō)明Meyerozymacaribbica酵母具有適應(yīng)不同生長(zhǎng)環(huán)境的能力,因而具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用潛力。

3.2茶葉籽水漿發(fā)酵液中茶葉籽酵母菌數(shù)量變化與茶葉籽水漿發(fā)酵分層的關(guān)系

茶葉籽水漿發(fā)酵分層現(xiàn)象是“茶葉籽油生物發(fā)酵生產(chǎn)工藝”的核心,該現(xiàn)象的具體發(fā)生過(guò)程為:茶葉籽水槳發(fā)酵液開(kāi)始時(shí)上下是渾然一體的,呈乳白色,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),發(fā)酵液分層逐漸由模糊變?yōu)榍逦?發(fā)酵進(jìn)行到4.5 h左右,發(fā)酵液明顯分為3層,乳白色頂層、淡棕色中層及灰白色底層[13]。由圖4可知,從發(fā)酵開(kāi)始到發(fā)酵5 h這段時(shí)間,發(fā)酵液中茶葉籽酵母的數(shù)量是最多的階段,由圖5可知,這段時(shí)間也處在整個(gè)發(fā)酵液pH逐漸降低的時(shí)段;酵母菌有氧代謝過(guò)程的主要產(chǎn)物為丙酮酸[14]和二氧化碳,從而導(dǎo)致發(fā)酵物pH降低;因此,可以判斷主要是茶葉籽酵母的發(fā)酵作用導(dǎo)致了茶葉籽水漿發(fā)酵液pH在這段時(shí)間的降低;發(fā)酵液的pH降低破壞了茶葉籽水漿膠體的平衡狀態(tài),導(dǎo)致茶葉籽水漿膠體內(nèi)比較輕的懸浮物上浮而分層。

綜合以上分析,可以初步認(rèn)為,茶葉籽酵母是引起茶葉籽水漿早期發(fā)酵并導(dǎo)致發(fā)酵液分層的主要微生物之一。

3.3茶葉籽酵母數(shù)量的變化與茶葉籽水漿發(fā)酵液pH之間的關(guān)系

由圖4可知,茶葉籽水漿發(fā)酵液中茶葉籽酵母數(shù)量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少,進(jìn)行到10 h時(shí),降低為零;由圖5可知,發(fā)酵液pH隨時(shí)間的延長(zhǎng)由開(kāi)始時(shí)的6.2逐漸降低,10 h時(shí)為3.73;由圖6可知,當(dāng)培養(yǎng)基pH為4.3時(shí),培養(yǎng)基上的酵母菌落數(shù)量均為零。

綜合分析上述結(jié)果可以看出,茶葉籽水漿開(kāi)始時(shí)pH較高,比較適合茶葉籽酵母的生長(zhǎng),隨著發(fā)酵液時(shí)間延長(zhǎng)及發(fā)酵液pH的逐漸降低,茶葉籽酵母的適生條件逐漸變差,到10 h時(shí)發(fā)酵液pH(3.73)已遠(yuǎn)低于培養(yǎng)基模擬培養(yǎng)的最低pH,茶葉籽酵母失去了適宜的生存條件,所以,發(fā)酵進(jìn)行到10 h時(shí)在發(fā)酵液中已找不到茶葉籽酵母。李劍芳等[15]指出,葡萄酒產(chǎn)香酵母E-45,最適生長(zhǎng)pH為5.4,最低和最高分別為1.6和9.5;于洋等[16]指出,發(fā)酵畢赤酵母YF-19的適宜pH為2.95;由此可見(jiàn),酵母的pH適應(yīng)范圍是很廣的,茶葉籽酵母的適宜pH及極端不適宜pH是在這些資料范圍內(nèi)的。

4 結(jié)論

JJZ11菌株是從茶葉籽水漿發(fā)酵液中分離出的酵母菌株,通過(guò)分離提純、形態(tài)觀察、ITS rDNA及26S rDNA基因測(cè)序與比對(duì),以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建與分析,確定JJZ11菌株為Meyerozymacaribbica酵母的一個(gè)菌株;并將該菌株初步命名為:茶葉籽酵母(MeyerozymacaribbicaJJZ11);菌種保藏號(hào)為CCTCC M 2016470。

在茶葉籽水漿發(fā)酵過(guò)程中:茶葉籽水漿發(fā)酵液中茶葉籽酵母數(shù)量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少,進(jìn)行到10 h時(shí),降低為零;發(fā)酵液pH隨時(shí)間的延長(zhǎng)由開(kāi)始時(shí)的6.2逐漸降低,10 h時(shí)為3.73。用培養(yǎng)基培養(yǎng)茶葉籽酵母,當(dāng)培養(yǎng)基pH小于4.3時(shí),無(wú)論培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短,茶葉籽酵母的菌落數(shù)量均為零。

發(fā)酵液中茶葉籽酵母細(xì)胞的數(shù)量5 h之前居最高位,5 h之后迅速下降,到10 h時(shí)降低到零,而茶葉籽水漿發(fā)酵分層現(xiàn)象恰好發(fā)生在5～7 h之前[13],所以,茶葉籽酵母是引起茶葉籽水漿發(fā)酵分層的主要微生物之一。

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Studiesonidentificationandfermentationcharacteristicsofteaseedyeast

JIANGJin-zhong1,2,YANGPeng-ming3,WANGXing-chun2,MUAn-de2,ZHENGZhai-sheng4

(1.Guizhou Education University,Guiyang 550018,China;2.Guizhou Yuanheng Mountain Tea Seed Biological Technology Co.,Ltd.,Guiyang 550018,China;3.School of Horticulture Landscape Architecture,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China;4.Jinhua Agricultural Science Institute,Jinhua 321017,China)

To illuminate function of yeast on the fermentation-layering of tea-seed-water-milk(TSWM),a strain of yeast(NO. JJZ9911)was isolated and purified from 5 h-fermented TSWM. By mean of morphological observation,ITS rDNA and(26S rDNA gene sequencing and comparison,and building and analysis of a phylogenetic tree,it was determined that JJZ9911 was one strain ofMeyerozymacaribbica. Therefore the strain was named as tea seed yeast(MeyerozymacaribbicaJJZ11),and its preservation number was CCTCC M 2016470. In the fermentation-layering process of TSWM,the number of tea seed yeast in fermented liquid gradually reduced with the extension of fermentation time and reduced to zero when fermentation reached to 10 h.The pH of fermented liquor gradually reduced from 6.2 to 3.73 till fermentation reached to 10 h. The number of tea seed yeast colony was zero while the medium pH was less than 4.3.The fermentation-layering process of TSWM was synchronic with the number change of tea seed yeast,therefore,the tea seed yeast was one of the main microbial that caused fermentation-layering of TSWM.

tea seed yeast;MeyerozymacaribbicaJJZ11;tea seed water milk;fermentation-layering;tea seed

2017-02-07

姜金仲(1958-)，男，博士，教授，主要從事茶葉籽綜合開(kāi)發(fā)利用方面的研究，E-mail：jjz9911@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460405)；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合成果[2017]4127)。

TS222

A

1002-0306(2017)22-0105-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.021