鄒俊駒+吳佳敏+賀又舜+伍參榮+趙國榮

摘要：目的 觀察甘露消毒丹及其拆方對柯薩奇病毒A16型（CoxA16）小鼠模型P-選凝素糖蛋白配體1（PSGL-1）和促炎因子的影響，探討其抗病毒的作用機(jī)制。方法 7日齡ICR小鼠150只，隨機(jī)分為正常組、模型組、全方組、芳?xì)埛浇M、清殘方組和利殘方組，每組25只。除正常組外，其余各組小鼠腹腔注射20 μL 107TCID50的CoxA16標(biāo)準(zhǔn)株原液進(jìn)行造模。除正常組和模型組外，其余各組給予相應(yīng)藥物干預(yù)。于給藥后第10日取材，檢測PSGL-1、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-4的表達(dá)，并進(jìn)行病理組織觀察。結(jié)果 除正常組外，其余各組小鼠肌肉組織內(nèi)存在大量CoxA16，表明造模成功；HE染色結(jié)果顯示，甘露消毒丹及其拆方可減輕CoxA16對肌肉的損傷。與正常組比較，模型組PSGL-1蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，全方組、芳?xì)埛浇M、清殘方組和利殘方組不同程度抑制PSGL-1蛋白的表達(dá)，減少致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-4的產(chǎn)生（P<0.01）。結(jié)論 甘露消毒丹及其拆方具有抗炎作用，其中以全方組效果最明顯。

關(guān)鍵詞：甘露消毒丹；拆方；P-選凝素糖蛋白配體1；促炎因子；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.011

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）12-0042-05

Effects of Ganlu Xiaodu Pills and Its Residues on PSGL-1 and Proinflammatory Cytokines in CoxA16 Mouse Model ZOU Jun-ju， WU Jia-min， HE You-shun， WU Can-rong， ZHAO Guo-rong （College of TCM， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Ganlu Xiaodu Pills and its residues on PSGL-1 and proinflammatory cytokines in Coxsackie virus A16 （CoxA16） mouse model； To discuss its antiviral mechanism of action. Methods Totally 150 ICR mice at age of 7 days were randomly divided into normal group， model group， all-side group， aromatic residual group， clearing residual group and removing residual group， with 25 mice in each group. Except for normal group， other groups were injected intraperitoneally with 20 μL of 107TCID50 CoxA16 standard stock solution to establish models. Except for normal group and model group， other groups were given relevant medicine for intervention. The expressions of PSGL-1， TNF-α， IL-1β and IL-4 and histopathological observation were detected after 10 days of medication. Results Except for the normal group， the existence of a large number of CoxA16 in other groups of mouse muscle tissues proved successful modeling. HE staining showed that Ganlu Xiaodu Pills and residual could reduce damage to the muscle by CoxA16 virus. Compared with the normal group， the expression of PSGL-1 protein in the model group increased （P<0.01）； compared with the model group， all-side group， aromatic residue group， clearing residual group， removing residual group inhibited the expression of PSGL-1 protein， reduced the inflammatory factors of TNF-α， IL-1β， and IL-4 （P<0.01）. Conclusion Ganlu Xiaodu Pills and its residues have anti-inflammatory effects， and the all-side group shows the best efficacy.

Key words： Ganlu Xiaodu Pills； residual； PSGL-1； proinflammatory cytokines； miceendprint

手足口病是一類由腸道病毒引起的急性傳染病，

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81173188）

通訊作者：賀又舜，E-mail：youshunh@sina.com

其中柯薩奇病毒A組16型（CoxA16）和腸道病毒71型（EV71）2種最為常見[1]。近年來，手足口病在我國出現(xiàn)多次大范圍爆發(fā)，對我國兒童的健康造成嚴(yán)重威脅。因此對于手足口病的臨床特征及最常見病原體的生物學(xué)特性、致病機(jī)理及疫苗開發(fā)等研究日益關(guān)注。前期研究發(fā)現(xiàn)，甘露消毒丹能抑制柯薩奇病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，并且能在細(xì)胞外影響病毒的吸附和穿入[2-3]，通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞亞群，誘導(dǎo)IFR3的表達(dá)，刺激免疫細(xì)胞分泌干擾素（IFN）-γ，達(dá)到抗腸道病毒目的[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，由甘露消毒丹演變出的各種拆方，其治療效果各有優(yōu)勢，如：甘露消毒丹化濁利濕殘方在調(diào)節(jié)免疫功能方面有優(yōu)勢，甘露消毒丹化濁利濕殘方擅長于控制炎癥反應(yīng)方面等[5-6]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，以甘露消毒丹抗CoxA16病毒作用為切入點(diǎn)，探討甘露消毒丹及其拆方對CoxA16小鼠模型P-選凝素糖蛋白配體1（PSGL-1）和促炎因子的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

SPF級ICR小鼠150只，3日齡，體質(zhì)量（3±1）g，動物許可證號SYXK（湘）2013-0005，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。飼養(yǎng)于室溫（30±0.5）℃、相對濕度（90±5）%的環(huán)境，采用12 h/12 h明暗光照，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

甘露消毒丹全方（簡稱“全方”）：滑石15 g，黃芩10 g，茵陳11 g，石菖蒲6 g，川貝母5 g，木通5 g，藿香4 g，連翹4 g，豆蔻4 g，薄荷4 g，射干4 g；甘露消毒丹清熱解毒殘方（簡稱“清殘方”）：黃芩 10 g，連翹4 g，薄荷4 g，射干4 g，川貝母5 g，甘露消毒丹芳香化濁殘方（簡稱“芳?xì)埛健保恨较? g，石菖蒲6 g，豆蔻4 g；甘露消毒丹化濁利濕殘方（簡稱“利殘方”）：茵陳11 g，滑石15 g，木通5 g。上述藥物及劑量均按照國家十二五高等中醫(yī)藥學(xué)教材《方劑學(xué)》[7]所載，購于湖南中醫(yī)藥大第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)周日寶教授鑒定符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)。各方加水適量，煎煮前先浸泡40 min，每次煎煮20 min，共煎煮2次，藿香、豆蔻、石菖蒲、薄荷在其他藥煎煮15 min后再下，繼續(xù)煎煮5 min即可?；旌?次藥液，置于65 ℃恒溫水浴濃縮，全方、清殘方、芳?xì)埛?、利殘方分別配制成含原藥材1.44、0.54、0.28、0.62 g/mL，滅菌后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。給藥劑量參考人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表[8]。

1.3 主要試劑與儀器

總RNA提取試劑盒（Rneasy Mini Kit），上海生工生物技術(shù)有限公司；SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒，上海生工生物技術(shù)有限公司；GoldStar TaqMan Mixture，康為世紀(jì)有限公司；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-4酶聯(lián)免疫試劑盒，長沙麗欣生物技術(shù)有限公司。高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），超凈工作臺（上海生工生物工程公司），熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），-80 ℃超低溫冰箱（美國Thereto公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模

將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、全方組、芳?xì)埛浇M、清殘方組和利殘方組，每組25只。除正常組外，其余各組均快速解凍，CoxA16標(biāo)準(zhǔn)株原液腹腔注射20 μL 107TCID50造模[9-10]。造模第3日觀察小鼠精神狀態(tài)、活動度、體質(zhì)量、毛發(fā)變化及死亡情況，記錄每日體溫、體質(zhì)量。成模第4日，各給藥組小鼠給予相應(yīng)藥物灌胃，0.2 mL/5 g，連續(xù)10 d。正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，每日1次。成模標(biāo)準(zhǔn)：通過外表觀察初步判斷染毒是否成功，其次通過病理切片觀察染毒動物肺組織充血情況，判定染毒的穩(wěn)定性，再利用定量PCR方法檢測染毒動物組織中是否存在CoxA16 RNA。

2.2 標(biāo)本采集與處理

實(shí)驗(yàn)小鼠分別于第0日（CoxA16標(biāo)準(zhǔn)株原液感染前）和感染后第3、5、8、10日取成活小鼠5只，乙醚吸入法麻醉小鼠，安樂處死。立即取后肢肌肉、大腦、小腸，部分置于4%中性多聚甲醛固定液中保存制作病理切片；部分置于2.5%戊二醛固定液中保存，用于電鏡觀察；再取部分后肢肌肉，用無菌4 ℃預(yù)冷的PBS和雙抗（青霉素、鏈霉素）沖洗2～3次，置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩E染色：常規(guī)石蠟包埋，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，間斷連續(xù)切片（厚度4 μm）、烤片、常規(guī)脫蠟，HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察肌肉組織形態(tài)學(xué)變化。

2.3 一般觀察

小鼠接種CoxA16標(biāo)準(zhǔn)株原液后每日觀察記錄小鼠表現(xiàn)，包括體質(zhì)量的增減和臨床癥狀：皮（毛）皺褶、駝背、消瘦、四肢乏力、肢體麻痹、抽搐、死亡等。并根據(jù)下述標(biāo)準(zhǔn)評分。0分：健康；1分：后肢無力；2分：一個肢體癱瘓；3分：一個以上肢體癱瘓；4分：死亡[11]。

2.4 Western blot檢測P-選凝素糖蛋白配體1蛋白表達(dá)

取樣本進(jìn)行6%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢，將膜置于封閉液中溫室封閉5 min，用漂洗液漂洗1 min；將混勻的抗體與反應(yīng)液HRP（鼠）混合液加入抗體稀釋液中混勻（一抗以1∶200比例稀釋，反應(yīng)液HEP以1∶100比例稀釋）；棄去漂洗液，將一抗、反應(yīng)液及稀釋液混合而成的抗體孵育液加到膜上，搖床孵育1 h；棄去抗體稀釋液，用漂洗液洗3～5次，每次3 min；ELC法進(jìn)行檢測，進(jìn)行圖像掃描、灰度分析。以PSGL-1與β-actin的光密度比值表示PSGL-1蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，應(yīng)用圖像分析軟件Image J進(jìn)行光密度半定量蛋白質(zhì)檢測。endprint

2.5 腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-4細(xì)胞因子檢測

將試劑盒從冰箱中取出，平衡至室溫。預(yù)估待測樣品濃度，使其符合試劑盒的檢測范圍。分設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔、待測樣品孔，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、待測樣品100 μL至各孔，避免產(chǎn)生氣泡。使用一次性封膜封板，37 ℃孵育80 min。吸去孔內(nèi)液體，甩干。每孔加入100 μL工作液A，使用一次性封膜封板，37 ℃溫育45 min。溫育后洗板3次，用厚疊紙吸干水分。每孔加100 μL工作液B，用一次性封膜封板37 ℃溫育45 min。溫育后洗板5次，用厚疊紙吸干水分。依次加90 μL底物溶液至每孔，使用一次性封膜封板37 ℃避光顯色。至反應(yīng)時間依次加50 μL終止溶液至每孔，終止反應(yīng)。于酶標(biāo)儀波長450 nm處測定各孔OD值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，組間比較方差齊者用方差分析，方差不齊者用秩和檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 模型驗(yàn)證

HE染色結(jié)果顯示：正常組小鼠肌肉紋理清晰，組織無炎癥浸潤；模型組肌肉紋路紊亂，炎癥因子大量浸潤。見圖1。表明在感染CoxA16病毒第4日，小鼠肌肉組織受到一定的損傷。造模第4日，PCR擴(kuò)增曲線顯示模型組小鼠后肢肌肉存在CoxA16病毒，正常組擴(kuò)增曲線無明顯變化，見圖2。上述數(shù)據(jù)表明CoxA16導(dǎo)致小鼠感染CA16病毒的模型成功。

4.2 一般狀況

小鼠接種CoxA16病毒后14 d，小鼠死亡數(shù)和疾病狀態(tài)分別用存活率和臨床疾病評分進(jìn)行評價。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)小鼠感染病毒1～2 d出現(xiàn)后肢軟弱、無力；3～4 d出現(xiàn)1個肢體或2個肢體以上出現(xiàn)麻痹、癱瘓，甚至出現(xiàn)震顫、嗜睡、共濟(jì)失調(diào)，嚴(yán)重者死亡，小鼠發(fā)病率100%。在臨床疾病評分中，甘露消毒丹各殘方組為0.8～2.1，全方組為0.3，見圖3。甘露消毒丹各殘方組小鼠存活率分別為80.31%、83.26%、65.11%，全方組為90.33%，模型組為35.26%，見圖4。表明甘露消毒丹及其拆方能明顯提高CoxA16感染小鼠的存活率與健康狀態(tài)，且全方組效果最優(yōu)，芳?xì)埛浇M和清殘方組效果較利殘方組佳。

4.3 病理觀察結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肌肉組織無炎癥浸潤，肌肉紋理清晰。各給藥組炎癥反應(yīng)有所減輕，其中全方組效果最好，對病毒導(dǎo)致肌肉炎癥浸潤的消除和肌肉紋理的修復(fù)效果顯著；清殘方組和芳?xì)埛浇M能降低肌肉炎癥浸潤，利殘方組能夠提高肌肉紋理的修復(fù)但抗炎效果欠佳。結(jié)果見圖5。

4.4 甘露消毒丹及其拆方對模型小鼠肌肉組織P-選凝素糖蛋白配體1蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肌肉組織PSGL-1蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01），表明機(jī)體在CoxA16感染性炎癥刺激下，在白細(xì)胞從血液、血管壁定向遷移到炎癥部位的過程中，肌肉組織內(nèi)PSGL-1表達(dá)增強(qiáng)；與模型組比較，全方組和各殘方組小鼠肌肉組織PSGL-1蛋白表達(dá)降低（P<0.01），全方組降低最顯著。結(jié)果見圖6、圖7。

5 討論

手足口病屬中醫(yī)學(xué)“春溫”“濕溫”等范疇，病因?yàn)橥飧袝r邪疫毒，內(nèi)傷濕熱蘊(yùn)結(jié)，心火熾盛，其病位在肺、脾、心三臟。邪毒由口鼻而入，蘊(yùn)郁肺脾，內(nèi)侵生濕生熱，向外發(fā)于肌表[12]。

選擇素是一個細(xì)胞黏附分子家族，由3種細(xì)胞表面糖蛋白組成，包括白細(xì)胞表達(dá)的L-選擇素、血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的E-選擇素、血小板和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的P-選擇素。L-選擇素是由白細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)性地所表達(dá)，而E-選擇素和P-選擇素由內(nèi)皮細(xì)胞被諸如TNF-α、IL-1所誘導(dǎo)表達(dá)，是對炎癥刺激的反應(yīng)[13]。PSGL-1是選擇素最具特征性的配體。PSGL-1是白細(xì)胞膜蛋白的唾液酸黏蛋白，其結(jié)構(gòu)為含有二硫鍵亞單位的二聚體，能與3種不同的選擇素結(jié)合[14]。在CoxA16感染性炎癥刺激下，PSGL-1在白細(xì)胞從血液、血管壁定向遷移到炎癥部位中起重要作用。

IL-4是由多種淋巴細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞自發(fā)或在各種因素刺激下產(chǎn)生的，其中IL-4生物學(xué)活性廣泛，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、造血調(diào)控等過程中均發(fā)揮重要作用；IL-1β是一種經(jīng)典的炎性因子，主要依賴于固有免疫細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞內(nèi)的Nalp3炎性小體成熟與分泌；在CoxA16感染的急性期，在神經(jīng)源性肺水腫和腦炎患者的血清和腦脊液中檢測到大量的IL-4、IL-1β和TNF-α[15]，表明促炎細(xì)胞因子與疾病的嚴(yán)重程度有明顯的相關(guān)性，感染性炎癥時，白細(xì)胞在選擇素和α4整合素的介導(dǎo)下，定向地移行至被感染的組織。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在CoxA16感染性炎癥刺激下，模型組PSGL-1的表達(dá)頗高，各給藥組均可降低CoxA16模型小鼠體內(nèi)PSGL-1的表達(dá)；而全方組、清殘方組PSGL-1的表達(dá)量低于芳?xì)埛浇M和利殘方組，其中全方組PSGL-1的表達(dá)量接近于正常組，顯示甘露消毒丹全方的效果最好。從甘露消毒丹對CoxA16小鼠模型肌肉組織內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-4的影響可以看出，全方組對于抗炎作用最顯著，其次為清殘方和芳?xì)埛剑Ч^低的是利殘方，這可能與藥物間的整體配伍產(chǎn)生的作用有關(guān)，全方組集清熱解毒、芳香化濁、清利藥物于一體，通過清理三焦達(dá)到整體調(diào)節(jié)作用；而清殘方效果僅次于全方組，可能是清熱解毒藥對病因起到直接的治療作用；芳?xì)埛叫Ч斡谌浇M和清殘方，卻優(yōu)于利殘方，可能是因?yàn)榉枷慊瘽崴幬锟赏ㄟ^辟穢和中、芳化濕濁毒邪的功效而發(fā)揮療效，但不能因此而忽略利殘方的作用，利殘方在全方中的作用頗為重要，否則濕邪穢濁無從導(dǎo)去，而且既往實(shí)驗(yàn)也表明，利濕化濁法及一些利濕化濁藥物對病毒感染性疾病的療效不僅包括對其病因的治療，也包括對病因引起的一系列機(jī)體功能紊亂的矯正。所以，我們應(yīng)當(dāng)從整個方劑各藥物間的配伍功效來分析全方的作用，并根據(jù)其不同作用效果來分析各個拆方藥物的作用特點(diǎn)。其具體作用機(jī)制，今后將進(jìn)一步從炎癥通路方面進(jìn)行研究。endprint

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（收稿日期：2017-02-03）

（修回日期：2017-03-19；編輯：華強(qiáng)）endprint