王義強(qiáng) ,王啟業(yè) ,華連灘 ,彭牡丹 ,鐘 潔 ,羅 浪
(1. 中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖南 長沙 410004; 2. 中南林業(yè)科技大學(xué) 生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室, 湖南 長沙 410004; 3. 國家林業(yè)局生物乙醇研究中心, 湖南 長沙 410004)
外源K-IBA對(duì)北美香柏扦插生根和內(nèi)源激素含量變化的影響
王義強(qiáng)1,2,3,王啟業(yè)2,華連灘2,彭牡丹2,鐘 潔2,羅 浪2
(1. 中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖南 長沙 410004; 2. 中南林業(yè)科技大學(xué) 生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室, 湖南 長沙 410004; 3. 國家林業(yè)局生物乙醇研究中心, 湖南 長沙 410004)
以北美香柏Thuja occidentalsL. 2年生枝條為材料,采用3-吲哚丁酸鉀鹽(K-IBA)3個(gè)濃度(3 000、6 000、10 000 mg/L)處理扦插生根試驗(yàn),清水處理為對(duì)照。扦插60天后統(tǒng)計(jì)插穗生根率、平均根長、最長根長、平均生根數(shù)。扦插后每隔15 d從 6 000 mg/L K-IBA 與對(duì)照處理插穗的基部取樣,測(cè)定生根過程中內(nèi)源激素吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)和玉米素(ZT)含量的變化。結(jié)果表明:外源K-IBA 對(duì)北美香柏扦插生根有促進(jìn)作用,其中6 000 mg/L K-IBA 的處理效果最好,其生根率為87.78%、生根數(shù)22.33根、平均根長12.33 mm、最長根長75.20 mm,顯著高于對(duì)照。與對(duì)照相比,6 000 mg/L K-IBA 處理組的內(nèi)源 IAA含量、GA 含量提高,而內(nèi)源ABA、ZT含量下降,促使生根率提高。在北美香柏扦插生根過程中,K-IBA處理調(diào)節(jié)了內(nèi)源激素IAA、GA、ABA和ZT含量的變化,而內(nèi)源激素的動(dòng)態(tài)變化,共同調(diào)控插穗不定根的形成。
北美香柏;扦插;不定根發(fā)育;內(nèi)源激素
北美香柏Thuja occidentalsL.,別名美國側(cè)柏,為柏科崖柏屬,常綠喬木。原產(chǎn)于北美東部,我國遼寧、山東、湖南、北京等地有引進(jìn)栽培[1]。北美香柏喜光,耐蔭,能適應(yīng)多種土壤,以肥沃的中性土及石灰?guī)r發(fā)育的堿性土上生長為佳,抗寒力強(qiáng),是石灰?guī)r區(qū)困難地造林的首選樹種之一,能盡快恢復(fù)石灰?guī)r地區(qū)的植被,防止水土流失。木材的用處較多,可作為各類建筑材料。枝葉芳香,富含維生素、黃酮、萜類等多種活性成分,是抗壞血病、抗衰老、預(yù)防心腦血管疾病的良藥。從枝葉中提取的精油芳香迷人、抑菌驅(qū)蟲,是高級(jí)香水、香油、建筑清潔劑的優(yōu)質(zhì)原料[2]。樹形優(yōu)美,可作觀賞樹種。其生態(tài)效益、社會(huì)效益十分顯著。北美香柏主要通過扦插途徑繁殖,然而扦插生根機(jī)理尚不清楚。本試驗(yàn)研究了外源激素K-IBA處理對(duì)北美香柏扦插生根的影響及北美香柏生根過程中內(nèi)源激素的變化,旨在探討其扦插生根機(jī)理,為該樹種的引種推廣栽培提供無性繁殖理論依據(jù)。
插穗選擇:于湖南湘西州森林生態(tài)研究試驗(yàn)站北美香柏實(shí)驗(yàn)基地選取生長健壯、無病蟲害的北美香柏Thuja occidentalsGreen Giant品種,2年生8~12 cm枝條,插前剪去部分靠近基部老葉,扦插于中南林業(yè)科技大學(xué)苗圃。溫度保持在20~30℃。
生長調(diào)節(jié)劑K-IBA (3-吲哚丁酸鉀鹽)購自Sigma-aldrich西格瑪奧德里奇(上海)有限公司。
采用單因素完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),設(shè)置3個(gè)K-IBA濃度(3 000、6 000、10 000 mg/L)處理,清水對(duì)照,每個(gè)組重復(fù)3次,每組30個(gè)插穗。
按珍珠巖:泥炭土3∶1體積比配置混合扦插基質(zhì),裝入7 cm×6 cm×7 cm無紡布網(wǎng)袋中,放入穴盤上。扦插前2 d,用0.5%高錳酸鉀對(duì)基質(zhì)消毒。將制備好的插穗每30條扎成 1 捆,然后用0.1%的高錳酸鉀溶液消毒60~90 s。取出用超純水沖洗干凈。用3個(gè)不同濃度K-IBA 溶液浸泡插穗形態(tài)學(xué)下端2~3 cm處20 s,清水浸泡為對(duì)照,扦插深度3~4 cm。扦插后,及時(shí)澆水,用50%多菌靈可濕性粉劑 500 倍液消毒,每隔 7天于傍晚給插穗噴灑 1 次。相對(duì)濕度穩(wěn)定于80%以上。
1.2.3.1 生根測(cè)定
扦插后,每隔15天進(jìn)行1次生根形態(tài)觀測(cè),分別記錄愈傷組織出現(xiàn)期、不定根出現(xiàn)期和發(fā)生的部位以及根系的生長過程,扦插60 d后統(tǒng)計(jì)插穗生根率、平均根長、最長根長、平均生根數(shù)。
1.2.3.2 高效液相色譜(HPLC)測(cè)定內(nèi)源激素(IAA、GA、ABA 、ZT)含量
扦插后,每隔 15天,從6 000 mg/L K-IBA 和對(duì)照處理中取樣 1次,共計(jì) 5 次。從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)抽取 10~12 條插穗,迅速用蒸餾水將基部沖洗干凈,濾紙擦干,然后置于冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室,迅速剝?nèi)∷霔l基部2~3 cm 韌皮部,剪碎混勻后用液氮速凍,放于-70 ℃冰箱中保存待測(cè)。
稱取樣品3 g用液氮研磨成粉于離心管中,加入40 ml 80%的預(yù)冷色譜甲醇,加入少量抗氧化劑,搖勻,4℃避光浸提12 h。將浸泡提取的北美香柏樣品于4℃ 3 000 r/min離心20 min,收集上清液。殘?jiān)俅斡?0 mL 80%的預(yù)冷甲醇浸提12 h,3 500 r/min 4℃ 離心15 min,合并上清液。38℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),除去甲醇。濃縮液用等體積的三氯甲烷萃取兩次,加入適量PVP,離心3 000 r/min離心5 min,丟棄下層溶液,上層溶液合并,并且調(diào)節(jié)pH至2.8~3。乙酸乙酯萃取后干燥。殘留物用3 mL甲醇∶0.8%冰醋酸=45∶55溶解,再用0.45 μm的微孔濾膜過濾,小玻璃杯收集濾液用于檢測(cè)。用流速0.06 mL/min高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定 IAA、GA、ABA 和ZT的含量。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理、圖表制作運(yùn)用Excel 2010。SPSS 22.0進(jìn)行方差分析和多重比較。
從表1中可看出,在不同K-IBA 濃度處理下,插穗的生根率、平均根長、最長根長和平均生根數(shù)指標(biāo)差異顯著(p<0.05)。隨 K-IBA 濃度的增加,插穗的生根率和最長根長都是先升高,當(dāng)K-IBA濃度為6 000 mg/L時(shí),生根率達(dá)最大值87.78%,而后隨濃度的升高而降低,當(dāng)K-IBA 處理濃度為10 000 mg/L時(shí)其生根率與3 000 mg/L K-IBA 濃度處理組差異不顯著,3個(gè)K-IBA 濃度處理的生根率分別比清水處理對(duì)照組提高23.34%、33.34%和21.11%。3個(gè)K-IBA 濃度處理下的插穗的平均根長、最長根長和平均生根數(shù)也均顯著高于對(duì)照處理組,隨著濃度的不斷升高平均根長是先升高后降低再升高的,最長根長在6 000 mg/L K-IBA 時(shí)達(dá)到最大值75.20 mm,平均生根數(shù)是在3 000 mg/L K-IBA濃度時(shí)最多,平均達(dá)25.67根。
表1 K-IBA濃度處理的扦插生根指標(biāo)?Table 1 The rooting characters of cuttings by different K-IBA treatments
綜合比較可以看出,在6 000 mg/L K-IBA 濃度處理下北美香柏扦插生根效果最好,其生根率為87.78%、生根數(shù)22.33根、平均根長12.33 mm、最長根長75.20 mm。
經(jīng)生根過程插穗基部形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),K-IBA處理插穗生根情況較對(duì)照組提前。扦插后15天,K-IBA 處理插穗基部皮孔膨大外凸、呈開裂跡象,少量插穗愈傷組織開始出現(xiàn)(圖1-A);第 30天,插穗皮部有小突起,形成少量不定根(圖1-B),因此在扦插后第30天前已有少量根原基的形成與分化;扦插后第45天,插穗不定根開始大量形成,插穗成活率基本穩(wěn)定(圖1-C);扦插后第60天,插穗不定根大量出現(xiàn),且生長迅速,已經(jīng)成為小苗木(圖1-D)。
圖1 北美香柏扦插生根進(jìn)程Fig. 1 Rooting process of cutting of Thuja occidental
圖2-A表明,扦插后6 000 mg/L K-IBA 處理的插穗 IAA 含量呈現(xiàn)先上升后下降的單峰變化。扦插后15天內(nèi)上升較慢,第15~30天時(shí),迅速上升,最高達(dá)到峰值128.64 ng/(g·FW),而對(duì)照處理插穗的IAA 含量變化很小。插后30~60天,6 000 mg/L K-IBA 處理插穗的 IAA 含量逐漸下降,對(duì)照處理插穗的則開始上升,上升量不大,第45天時(shí)升到峰值59.25 ng/(g·FW)。扦插45天后,不定根逐漸伸長,6 000 mg/L K-IBA和對(duì)照處理插穗的 IAA含量都逐漸下降。
由圖2-B可知,扦插后6 000 mg/L K-IBA 處理插穗GA含量為先升高后降,而對(duì)照組的GA含量先是略有下降后緩慢上升。扦插生根過程整體GA值 K-IBA處理組>清水對(duì)照組。扦插后6 000 mg/L K-IBA 處理插穗GA含量值逐步上升,至第45天為最高的7.45 ng/(g·FW),第45~60天逐漸下降至6.22 ng/(g·FW)。扦插后對(duì)照組GA含量值整體變幅很小,至第30天最低值3.97 ng/(g·FW),僅比起始含量值降低了0.12 ng/(g·FW),之后上升又緩慢下降,至60天為4.56 ng/(g·FW)。
扦插后6 000 mg/L K-IBA 處理插穗的ABA含量呈現(xiàn)迅速降低,而對(duì)照處理插穗的 ABA 含量僅輕微下降;第15天時(shí)6 000 mg/L K-IBA處理插穗的 ABA 含量下降至77.56 ng/(g·FW),對(duì)照組僅降為 119.87 ng/(g·FW)。6 000 mg/L K-IBA處理插穗的根原基誘導(dǎo)和愈傷組織形成,與較低水平的 ABA 含量有關(guān)。扦插至30~60天,兩組處理插穗的 ABA 含量均逐漸下降,6 000 mg/L K-IBA 處理插穗ABA含量下降幅度先小后大,而對(duì)照處理插穗的 ABA 含量下降幅度則由大到小。最后6 000 mg/L K-IBA 處理插穗的 ABA含量下降了59.48 ng/(g·FW),對(duì)照組只下降了0.256 ng/(g·FW)。
如圖2-D 所示,ZT值在整個(gè)扦插生根過程中,K-IBA 處理組<對(duì)照組。扦插后實(shí)驗(yàn)組和清水對(duì)照組處理插穗ZT含量都迅速下降, 6 000 mg/L K-IBA 處理組從14.71 ng/(g·FW)降至最低值9.54 ng/(g·FW),而扦插后15~45天一直上升至峰值19.18 ng/(g·FW),第45天后又急劇下降。對(duì)照處理扦插15天內(nèi),ZT含量從 14.71 ng/(g·FW) 持續(xù)下降到5.99 ng/(g·FW),而后又逐步上升,經(jīng)過30天上升到峰值11.99 ng/(g·FW),而后也急劇下降。在整個(gè)扦插進(jìn)程中,6 000 mg/L K-IBA 處理插穗 ZT含量始終低于對(duì)照。
圖2 北美香柏扦插生根過程中內(nèi)源激素( IAA、GA、ABA、ZT) 含量的變化Fig. 2 Endogenous hormones ( IAA、GA、ABA、ZT) content of Thuja occidental is cuttings in the course of adventitious root development
如圖3-A 所示,6 000 mg/L K-IBA 處理插穗IAA/ABA 比值在扦插后30天內(nèi)大幅度升高,達(dá)到1.30,此時(shí)正是插穗不定根原基形成和發(fā)育的時(shí)期,扦插后30~45天后急劇下降,繼而上升。對(duì)照處理插穗的 IAA/ABA 比值扦插后30天內(nèi)變化不大;第30~45天,IAA/ABA 比值微微升高,45~60 d逐步下降至扦插開始時(shí)數(shù)值,對(duì)照處理插穗的 IAA/ABA 比值扦插后總體變幅不大。
圖3 北美香柏扦插生根過程中內(nèi)源激素比值的變化Fig. 3 Change of the ratio of endogenous hormone of Thuja occidental cuttings in the course adventitious root dvelopment
如圖3-B 所示,6 000 mg/L K-IBA 處理的IAA/ZT 比值在插穗生根過程中表現(xiàn)出明顯的先上升、后下降、再升高的變化趨勢(shì),而對(duì)照處理組的 IAA/ZT 值的變化較平緩,呈現(xiàn)先緩慢上升后下降趨勢(shì)。在兩種不同處理扦插后第15~45天各處理的IAA/ZT 值差異最大,且大部分時(shí)間內(nèi)6 000 mg/L K-IBA 處理的 IAA/ZT 比值大于對(duì)照處理組,扦插后30天時(shí)6 000 mg/L K-IBA 處理比對(duì)照組的插穗IAA/ZT 值高4.05。
由北美香柏扦插生根的形態(tài)觀察,扦插30 d愈傷組織全部形成,說明在扦插第30 d之前已有少量根原基的形成與分化。扦插后30~45天為插穗基部分化生根的高峰期,根原基的誘導(dǎo)形成,扦插45天之后生根數(shù)量變化較小,根不斷伸長。
清水處理,生根率54.44%,表明北美香柏為較易扦插生根的樹種。K-IBA 對(duì)香柏生根有促進(jìn)作用,但高濃度的 K-IBA 會(huì)有一定的抑制作用。外源添加高的植物生長調(diào)節(jié)劑抑制了根內(nèi)源生長素的含量,影響到細(xì)胞的分裂與分化[3]。不同物種K-IBA 的使用,結(jié)果存在著一定的差異。Griffin等[4]用K-IBA 對(duì)大葉紫茉莉處理,發(fā)現(xiàn)其對(duì)生根有明顯的促進(jìn)作用,隨著濃度升高生根數(shù)量增加,但高濃度的 K-IBA 會(huì)有一定的抑制作用;張斌[5]利用K-IBA處理仿栗插穗,K-IBA能改善插穗的營養(yǎng)狀況,提高抗逆境能力,進(jìn)而提高生根效果,3 000 mg/L的處理效果最好。在本實(shí)驗(yàn)中,可以看出 K-IBA 處理濃度與生根率、平均根長、最長根長和平均生根數(shù)都具有顯著性,K-IBA 處理插穗后隨著濃度升高愈傷組織形成率、生根率、平均根長和平均生根數(shù)都明顯提高。K-IBA能增強(qiáng)插穗內(nèi)細(xì)胞的代謝過程,加快蛋白質(zhì)和淀粉的分解,促進(jìn)根原基的誘導(dǎo)和形成,進(jìn)而促進(jìn)生根[6-9]。其中6 000 mg/L K-IBA 的處理效果最為顯著。
不定根的形成受許多因素影響,包括激素、水、溫度和光照等[10]。此外還受扦插的處理方式,如留葉數(shù)、長度、切口等影響[11]。大量研究表明激素對(duì)植物生根非常重要[12]。在北美香柏扦插生根過程中,插穗基部 IAA 含量是隨著生根階段不同而發(fā)生變化的。圖2-A顯示6 000 mg/L K-IBA 處理的插穗在扦插第30天達(dá)到最高值,而后逐漸下降。據(jù)形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),第15~30天是北美香柏插穗根部膨大、誘導(dǎo)形成愈傷組織階段。后 IAA含量下降,反而對(duì)北美香柏扦插不定根的伸長有促進(jìn)作用。IAA 含量的變化和根原基出現(xiàn)的階段與Blakesley[13],詹亞光[14],劉明國[15],歐陽芳群[16]等研究結(jié)果趨同。6 000 mg/L K-IBA 處理組始終高于對(duì)照組原因可能是6 000 mg/L K-IBA 處理影響了IAA的合成。GA通過改變根內(nèi)皮層細(xì)胞分裂和伸長的速度,來影響根中其他細(xì)胞的分裂和伸長,繼而調(diào)控根的生長[17-19]。如圖2-B,對(duì)照組GA含量在愈傷組織形成期稍微下降,在根原基形成與不定根伸長階段升高。6 000 mg/L K-IBA處理組GA含量始終高于對(duì)照組,且在根原基形成與不定根伸長階段表現(xiàn)尤為明顯,能夠促進(jìn)根的伸長。在北美香柏扦插生根過程中,6 000 mg/L K-IBA 處理組的內(nèi)源 ABA 含量普遍低于對(duì)照組(圖2-C),可能是因?yàn)镵-IBA處理影響插穗內(nèi) ABA的合成,導(dǎo)致內(nèi)源ABA 含量下降,而ABA 是生長抑制激素,其含量的下降提高了生根率。玉米素屬細(xì)胞分裂素,利于植物的生長、分化。由圖2-D,在北美香柏扦插過程中6 000 mg/L K-IBA處理組ZT值總體趨勢(shì)與對(duì)照組一致,在愈傷組織出現(xiàn)與根原基形成初期的0~15天內(nèi),ZT含量下降;在不定根基本形成15~45天時(shí),ZT 含量略有回升;在不定根形成后45~60天時(shí)又稍下降。6 000 mg/L K-IBA 處理組北美香柏插穗ZT值總體低于對(duì)照組,說明6 000 mg/L K-IBA 處理北美香柏插穗也引起插穗內(nèi)部玉米素ZT 的下降反而有利于生根。
內(nèi)源激素的作用不是單一的,而是互相作用,協(xié)同參與愈傷組織的形成、根原基的誘導(dǎo)和形成、不定根的形成與伸長。不同內(nèi)源激素含量比值的大小對(duì)不定根形成能力的反應(yīng)比單一內(nèi)源激素的更具有說服力。IAA/ABA 和 IAA/ZT 比值常用作評(píng)判植物扦插生根難易的標(biāo)準(zhǔn)[20]。IAA/ABA比值變化與生根有關(guān)系。陳雪梅等[21],敖紅等[22],周再知等[23]表明IAA/ABA比值大,生根率高,反之,生根率低。由圖3-A可知,6 000 mg/L K-IBA 處理組的內(nèi)源IAA/ABA比值普遍高于對(duì)照組,說明外源K-IBA處理北美香柏插穗促進(jìn)生根;IAA/ABA比值在扦插后30 d內(nèi)升幅大,利于根原基形成。IAA/ZT 比值表現(xiàn)出與IAA/ABA比值相似的變化趨勢(shì),且IAA/ZT 比值都是大于1,說明插穗內(nèi)源激素IAA含量高于ZT含量,有利于不定根的形成。
外源K-IBA 對(duì)北美香柏扦插生根有促進(jìn)作用,其中6 000 mg/L K-IBA 的處理效果最好,其生根率為87.78%、生根數(shù)22.33根、平均根長12.33 mm、最長根長75.20 mm,顯著高于對(duì)照。與對(duì)照相比,6 000 mg/L K-IBA 處理組的內(nèi)源 IAA含量、GA 含量提高,而內(nèi)源ABA、ZT含量下降,促使生根率提高。在北美香柏扦插生根過程中,K-IBA處理調(diào)節(jié)了內(nèi)源激素IAA、GA、ABA和ZT含量的變化,而內(nèi)源激素的動(dòng)態(tài)變化,共同調(diào)控插穗不定根的形成。
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[本文編校:吳 彬]
Effects of K-IBA treatments on adventitious rooting and endogenous hormones contents of shoot cuttings ofThuja occidentalsL.
WANG Yiqiang1,2,3, WANG Qiye2, HUA Liantan2, PENG Mudan2, ZHONG Jie2, LUO Lang2
(1. Key Lab of Non-wood Forest Nurturing and Protection of National Ministry of Education, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Biotechnology Laboratory of Central South University of Forestry and Technology,Changsha 410004, Hunan, China; 3.Bio-ethanol Research Center of State Forestry Administration, Changsha 410004, Hunan, China)
The shoot cuttings ofThuja occidentalsL. were collected and treated with indole-3-butyric acid (K-IBA) (concentrations 3 000, 6 000 and 10 000 mg/L), Water treatment as a control. The rooting rate, average root length, the longest root length and average rooting number were recorded after cutting for 60 days; The endogenous hormones(IAA, GA,ABA, ZT) contents of cuttings of 6 000 mg/L K-IBA and control treatment were detected every 15 days interval.The significant difference was found among the four treatments. K-IBA promoted the rooting ofThuja occidentalsL, Among them, 6 000 mg/L K-IBA has the best treatment effect, which was significantly higher than that of CK. The rooting rate was 87.78%, the number of rooting was 22.33, the average root length was 12.33 mm, the longest root length was 75.20 mm. Compared with the control, the content of endogenous IAA and GA increased in 6 000 mg/L K-IBA treatment group, while the contents of endogenous ABA and ZT decreased, then promoted the rooting. K-IBA regulates the changes of endogenous hormones IAA, GA, ABA and ZT, and the dynamic changes of endogenous hormones regulate the formation of adventitious roots in the process of rooting.
shoot cuttings; rooting; plant growth regulator; endogenous hormones
S791.41 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1673-923X(2017)10-0007-06
10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.10.002
http: //qks.csuft.edu.cn
2017-03-23
國家林業(yè)局“948”項(xiàng)目(2013-4-25)
王義強(qiáng),教授,博士生導(dǎo)師;E-mail:wangyiqiang12@163.com
王義強(qiáng),王啟業(yè),華連灘,等. 外源K-IBA對(duì)北美香柏扦插生根和內(nèi)源激素含量變化的影響[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2017, 37(10): 7-12.