董佳敏，徐永清，彭麗娜，馮 旭，姚樹(shù)寬，趙巧芩，李鳳蘭，胡寶忠,2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030； 2.哈爾濱學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150086)

小麥品種東農(nóng)冬麥2號(hào)根中 TaEXPA7部分同源基因的克隆及表達(dá)特性分析

董佳敏1，徐永清1，彭麗娜1，馮 旭1，姚樹(shù)寬1，趙巧芩1，李鳳蘭1，胡寶忠1,2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030； 2.哈爾濱學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150086)

膨脹素(expansin)是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中誘導(dǎo)細(xì)胞壁松弛和伸展的蛋白，包括EXPA、EXPB、EXLA、EXLB四個(gè)基因家族，對(duì)植物根系的形成及快速發(fā)育具有重要作用。本試驗(yàn)以寒地冬小麥品種東農(nóng)冬麥2號(hào)兩葉一心期的根為材料，克隆了 TaEXPA7基因的3個(gè)CDS全長(zhǎng)，其氨基酸序列同源性較高，僅信號(hào)肽處有兩個(gè)氨基酸不同，其核酸序列長(zhǎng)度均為777 bp，編碼258個(gè)氨基酸，分別命名為 TaEXPA7-A、 TaEXPA7-B、 TaEXPA7-D，且分別定位于2AL、2BL、2DL染色體。蛋白均含有DPBB-1和Pollen-allerg-1兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分子量為27 670.74 Da，等電點(diǎn)為8.09，均為疏水性蛋白；與節(jié)節(jié)麥、二穗短柄草的相似性分別為99%和92%。采用兩葉一心期的根進(jìn)行qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)， TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因在根尖中的表達(dá)量均較高，伸長(zhǎng)區(qū)和成熟區(qū)次之；對(duì)冬小麥根進(jìn)行低溫、干旱和激素處理后，這三個(gè)基因均下調(diào)表達(dá)，并且 TaEXPA7-B基因的相對(duì)表達(dá)量較高， TaEXPA7-D的相對(duì)表達(dá)量較低。由此可見(jiàn)，多倍體小麥不同染色體上的基因在應(yīng)對(duì)不同環(huán)境脅迫時(shí)，表達(dá)以及應(yīng)答模式存在差異，并且在不同的環(huán)境脅迫下，發(fā)揮主導(dǎo)作用的染色體也存在差異；此外，該基因在根中的表達(dá)可能與低溫、干旱以及外源激素的脅迫有一定的關(guān)系，可能是促進(jìn)根系生長(zhǎng)的重要基因。

冬小麥； TaEXPA7；部分同源；表達(dá)特性

膨脹素(expansin)是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中誘導(dǎo)細(xì)胞壁松馳和伸展的蛋白，于1989年首次被發(fā)現(xiàn)。1992年，McQueen-Mason等[1]從黃瓜中分離純化出這種蛋白，并發(fā)現(xiàn)其能調(diào)節(jié)幼苗下胚軸的伸長(zhǎng)，第一次將其命名為expansin。在植物中，expansin可以分為四個(gè)基因家族α-expansin(EXPA)、β-expansin(EXPB)、expansin-likeA(EXLA)以及expansin-likeB(EXLB)，由信號(hào)肽、催化區(qū)和結(jié)合區(qū)三部分構(gòu)成[2]。

Hu等[3]分別克隆了小麥 TaEXPA1-A/B/D三個(gè)基因，并將其轉(zhuǎn)入擬南芥，發(fā)現(xiàn)其具有相似的功能。然而，小麥染色體組的復(fù)雜多倍體特性使得對(duì)其遺傳、表達(dá)特性及其功能的分析極具挑戰(zhàn)性。研究發(fā)現(xiàn)， OsEXPA1、 OsEXPA2、 OsEXPA3、 OsEXPA4、OsEXPB2和 OsEXPA17等基因均在水稻根尖特異性表達(dá)，參與根尖形態(tài)建成，促進(jìn)根系生長(zhǎng)發(fā)育[4-7]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于膨脹素基因在各種非生物脅迫下的表達(dá)特性被廣泛研究，如干旱、低溫和激素會(huì)影響膨脹素基因的表達(dá)，從而影響植物生長(zhǎng)。Che等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Al離子誘導(dǎo)后， OsEXPA10基因參與水稻的根細(xì)胞伸長(zhǎng)。韓陽(yáng)陽(yáng)等[9]研究發(fā)現(xiàn)，GA3、ET和IAA顯著抑制了 TaEXPB23的表達(dá)水平，而MeJA則上調(diào)了該基因的表達(dá)，IAA處理先抑制隨后誘導(dǎo)了 TaEXPB23的表達(dá)，而ABA則在后期稍微抑制了 TaEXPB23的表達(dá)；此外，鹽脅迫能夠明顯提高 TaEXPB23的mRNA表達(dá)水平，而高溫則抑制該基因的表達(dá)。

目前，在小麥中關(guān)于膨脹素和根之間關(guān)系的研究鮮有報(bào)道，復(fù)雜的小麥各個(gè)基因組之間的關(guān)系以及基因的表達(dá)差異關(guān)系也尚未明確。因此，本研究以寒地高產(chǎn)冬小麥品種東農(nóng)冬麥2號(hào)為材料，同源克隆了 TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因；通過(guò)生物信息學(xué)分析了解該基因基本的生物學(xué)功能；利用qRT-PCR技術(shù)，研究了這三個(gè)基因在小麥幼苗期根中不同部位及在低溫、干旱和激素脅迫下的表達(dá)特性及表達(dá)差異，以期為進(jìn)一步研究膨脹素在根系形態(tài)建成中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)材料為高抗寒的冬小麥品種東農(nóng)冬麥2號(hào)，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥育種研究室提供。

挑選顆粒飽滿的東農(nóng)冬麥2號(hào)種子，用0.1% HgCl2溶液消毒處理30 s，蒸餾水沖洗6 h，室溫浸種24 h，然后將種子平鋪于含有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，露白后移栽至苗缽，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)[9]。待根長(zhǎng)至大約30 cm時(shí)對(duì)根尖、伸長(zhǎng)區(qū)和成熟區(qū)進(jìn)行取樣，每個(gè)部位均單株取材，隨機(jī)取三株。以水培為對(duì)照組，對(duì)4 ℃、聚乙二醇(PEG)、脫落酸(ABA)、茉莉酸甲脂(MeJA)及水楊酸(SA)分別處理2 h、6 h、12 h、24 h和48 h的根進(jìn)行取材，均單株取材，隨機(jī)取三株，取樣后均迅速放入液氮中速凍，然后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取試劑盒TransZol、RT-PCR所用熒光染料SYBR Green、Top Taq酶、 Peasy-T3克隆載體、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自全式金生物科技有限公司；試驗(yàn)所有引物合成和測(cè)序在哈爾濱博仕生物進(jìn)行；試驗(yàn)所需大腸桿菌 DH5α、ABA、茉莉酸甲酯、水楊酸、聚乙二醇、LB肉湯、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂、氯仿、甘油等生化試劑均購(gòu)自凱譽(yù)生物科技有限公司。使用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；使用Excel和GraphPad Prism軟件完成作圖和數(shù)據(jù)處理。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

使用TransZol試劑盒(ER501)進(jìn)行總RNA的提取，-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用UV-240紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，OD260/OD280=1.8～2.1，且OD260/OD230>2.0，濃度不小于500 ng·μL-1，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。以O(shè)ligo(DT)為引物，將所得RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存，并用β-actin檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄效果。

1.3 TaEXPA7-A/B/D基因的克隆及序列分析

組織特異性表達(dá)分析表明， TaEXPA7基因在根中的相對(duì)表達(dá)量較高，且東農(nóng)冬麥2號(hào)的RNA-seq結(jié)果顯示，該基因的整體表達(dá)量較高，可能與根系生長(zhǎng)有重要關(guān)系。在NCBI的GenBank中查詢 TaEXPA7三個(gè)同源基因的CDS序列，對(duì)這三個(gè)基因的相似部分利用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物(表1)。以冬小麥幼苗期根的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳回收后，將回收產(chǎn)物連接到Peasy-T3載體上，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用含Amp(100 μg·mL-1)的LB平板篩選目的菌落，隨機(jī)挑取30個(gè)單菌落，采取菌液PCR的方法進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，將出現(xiàn)目標(biāo)基因的克隆送公司測(cè)序。利用NCBI ORF Find分析CDS序列的ORF，并用Primer 5.0軟件預(yù)測(cè)編碼的氨基酸序列，對(duì)獲得的序列用BLAST程序搜索GenBank中與 TaEXPA7-A/B/D基因同源的氨基酸序列，采用DNAMAN 6.0和MEGA 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.4 TaEXPA7-A/B/D基因的表達(dá)特性分析

在NCBI的GenBank中查詢 TaEXPA7-A/B/D的CDS差異序列并參照此差異序列分別設(shè)計(jì)特異性qRT-PCR引物(表1)。對(duì)1.2中得到的各處理cDNA進(jìn)行梯度稀釋，根據(jù)Ct值確定最佳反應(yīng)濃度。以確定好最佳濃度的cDNA為模板，以小麥肌動(dòng)蛋白基因β-actin為內(nèi)參，采用qRT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增、分析，生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)各3次。反應(yīng)體系(20 μL)如下：2×Trans Star Top Green Qpcr Super Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(FQD-9620)上進(jìn)行。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，采用DPS 7.05 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行方差及顯著性分析。

表1 引物信息Table 1 Information of primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的檢測(cè)結(jié)果

以電壓150 V，電流120 mA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的RNA(圖1)，可以看出，28S和18S兩條譜帶清晰且前者的亮度大于后者，說(shuō)明提取的總RNA質(zhì)量較好。

2.2 TaEXPA7-A/B/D基因CDS的克隆及序列分析

為了獲得 TaEXPA7的部分同源基因，根據(jù) TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因的ORF(Open Reading Frame,開(kāi)放閱讀框)序列(GenBank登錄號(hào)：AA0307290.1、AA0383180.1、AA0559500.1)的相似部分，設(shè)計(jì)了兩條特異引物( TaEXPA7-F，TaEXPA7-R)，進(jìn)行了PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得了一條800 bp左右的條帶(圖2)。將攜帶該目的條帶的克隆挑取30個(gè)進(jìn)行測(cè)序，獲得了3條分別定位于2AL、2BL和2DL染色體上的CDS序列，其長(zhǎng)度均為777 bp，依次命名為： TaEXPA7-A、TaEXPA7-B、TaEXPA7-D。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)基因均編碼258個(gè)氨基酸，分子量為27 670.74 Da，等電點(diǎn)為8.09，均為疏水性蛋白，包括DPBB-1和Pollen-allerg-1兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其三級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯差異(圖3)。利用DNAMAN進(jìn)行氨基酸同源比對(duì)結(jié)果(圖4)表明，3條序列僅在信號(hào)肽處有兩個(gè)氨基酸的編碼存在差異。而冬小麥與春小麥中 TaEXPA7-A/B/D僅在核苷酸序列中存在堿基差異，蛋白序列不存在差異。眾所周知，一般的蛋白質(zhì)都通過(guò)保守的結(jié)構(gòu)域行使其功能，而本試驗(yàn)中的這3條氨基酸序列僅在信號(hào)肽處存在差異，其功能是否相似還有待研究。

M為DL2000；1和2為樣品

M:DL2000；1 and 2:Sample

圖1東農(nóng)冬麥2號(hào)根中提取的總RNA

Fig.1TotalRNAextratedfromrootofDongnongdongmai2

M為DL2000,1為樣品

M:DL2000, 1:Sample

圖2TaEXPA7-A/B/DCDS的PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2PCRamplificationofTaEXPA7-A/B/DCDS

圖3 TaEXPA7-A/B/D編碼蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

2.3 TaEXPA7-A/B/D基因的序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST檢索，發(fā)現(xiàn)TaEXPA7-A/B/D基因序列與節(jié)節(jié)麥(XP_020162651.1)、二穗短柄草(XP_003580384.1)、水稻(XP_015636818.1)等大多數(shù)單子葉植物的同源性較高，表明 TaEXPA7-A/B/D基因普遍存在于單子葉植物中。用ClustalX軟件對(duì)這些氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，用MEGA 6.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建(圖5)，并用BOXSHADE對(duì)這些氨基酸序列進(jìn)行著色，分析其結(jié)構(gòu)(圖6)。結(jié)果表明，這些基因序列均具有信號(hào)肽和兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(DPBB-1和Pollen-allerg-1)，小麥與節(jié)節(jié)麥的氨基酸序列相似性最高，親緣關(guān)系最近。

2.4 TaEXPA7-A/B/D基因的表達(dá)特性分析

以獲得的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用qRT-PCR引物進(jìn)行熒光定量PCR，測(cè)定東農(nóng)冬麥2號(hào)TaEXPA7-A/B/D在兩葉一心期根中不同組織部位的表達(dá)特性以及三個(gè)基因之間的表達(dá)差異。結(jié)果(圖7)顯示，TaEXPA7-A/B/D基因在根的根尖、伸長(zhǎng)區(qū)和成熟區(qū)均有表達(dá)，且在根尖中的相對(duì)表達(dá)量都顯著高于伸長(zhǎng)區(qū)和成熟區(qū)。其中，TaEXPA7-B在根尖中的相對(duì)表達(dá)量最高。

以獲得的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用qRT-PCR引物進(jìn)行熒光定量PCR，測(cè)定冬小麥兩葉一心期根中TaEXPA7-A/B/D基因在不同環(huán)境脅迫下的表達(dá)特性以及表達(dá)差異。結(jié)果(圖8至圖10)顯示，無(wú)論在低溫、干旱還是激素處理下，該基因均下調(diào)表達(dá)。

低溫4 ℃處理后，TaEXPA7-A/B/D基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，處理12 h時(shí)的表達(dá)量最低，在12 h之前，TaEXPA7-D的相對(duì)表達(dá)量最高，12 h以后TaEXPA7-B的相對(duì)表達(dá)量最高。

干旱處理后，TaEXPA7-A/B/D基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為 TaEXPA7-B>TaEXPA7-A>TaEXPA7-D。30%PEG處理后，TaEXPA7-A/B/D基因的表達(dá)量呈現(xiàn)急劇下降的趨勢(shì)，而20%PEG處理后基因的表達(dá)量下降得較緩慢。20%PEG處理后，在12 h時(shí)，其相對(duì)表達(dá)量最低，此后又呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。

圖4 TaEXPA7-A/B/D的氨基酸同源比對(duì)

圖5 TaEXPA7-A/B/D與其他不同物種同源基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)生分析

圖6 氨基酸序列相似性分析

激素處理后，TaEXPA7-A/B/D基因的表達(dá)量均呈下降的趨勢(shì)。在MeJA處理后，在0～2 h之間，基因的表達(dá)量顯著下降，在2～48 h之間其表達(dá)量變化較??；在ABA處理后，基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)，TaEXPA7-D基因的表達(dá)量最低；在SA處理后，在0～2 h之間，基因的表達(dá)量顯著下降，在2 h時(shí)其表達(dá)量最低，此后，各基因的表達(dá)量隨時(shí)間的增加而緩慢上升。

同一組圖柱上不同字母表示根的不同部位之間差異顯著(P<0.05)。

The different letter above columns indicate significant difference between different parts of the root(P<0.05).

圖7TaEXPA7-A/B/D基因在根中不同組織部位的表達(dá)差異

Fig.7DifferentialexpressionofTaEXPA7-A/B/Dindifferentregionsofroots

*和**分別表示與處理前差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。下同。

* and ** indicate difference between before and after treatment at 0.05 and 0.01 level , respectively. The same at following figures.

圖84℃脅迫下TaEXPA7-A/B/D基因的表達(dá)差異

Fig.8DifferentialexpressionofTaEXPA7-A/B/Dunder4℃stress

圖9 干旱脅迫下TaEXPA7-A/B/D基因的表達(dá)差異

圖10 不同激素脅迫下TaEXPA7-A/B/D基因的表達(dá)差異

3 討 論

多倍化在生物學(xué)中是一種普遍存在的現(xiàn)象，是物種形成和進(jìn)化的重要途徑之一。多倍體基因組中的重復(fù)基因可能有以下三種不同的命運(yùn)：保持原有的功能、基因沉默和分化并執(zhí)行新的功能[10-11]。近年來(lái)，對(duì)于多倍化的研究越來(lái)越多。2007年，Shitsukawa等[12]分析了普通小麥中一個(gè)MADS 家族基因WLHS1 的3 個(gè)同源基因的結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)現(xiàn)WLHS1-A 基因存在一個(gè)新序列的插入，WLHS1-B的DNA高度甲基化，只有WLHS1-D 是有功能的。2010年，陳 琰等[13]采用RACE方法克隆了TaEXPB8的四個(gè)同源基因，在染色體定位時(shí)發(fā)現(xiàn)了多拷貝現(xiàn)象，其表達(dá)分析結(jié)果表明，該基因在小麥初生根的伸長(zhǎng)區(qū)表達(dá)量最高，并且受外源高濃度生長(zhǎng)素的抑制，由此推測(cè)出該基因可能在小麥根中起著重要作用。2012年孫其信等[14]對(duì)TaEXPA1-A/B/D基因研究發(fā)現(xiàn)，三個(gè)基因在幼根中的表達(dá)是沉默的，TaEXPA1-A/D在幼葉中表達(dá)，而TaEXPA1-B在幼葉中沉默，推測(cè)該基因的沉默可能與啟動(dòng)子中某一區(qū)域的甲基化和乙?；嘘P(guān)，并對(duì)TaEXA1-A/B/D基因進(jìn)行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)他們具有相似的功能。本試驗(yàn)從東農(nóng)冬麥2號(hào)中克隆了TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)其分別定位于2AL、2BL和2DL染色體上，對(duì)其核酸序列以及氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，雖然核酸序列有幾處的差異，但是氨基酸序列僅在信號(hào)肽位置有兩處差異，三個(gè)基因的表達(dá)量表現(xiàn)為 TaEXPA7-B>TaEXPA7-A>TaEXPA7-D。這三個(gè)基因是否行使相似的功能以及在多倍體基因組上的作用機(jī)制還有待研究。

當(dāng)受到非生物脅迫時(shí)，植物可通過(guò)調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，激活植物對(duì)脅迫的響應(yīng)機(jī)制，這些基因可以編碼控制抗逆基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，也可以直接編碼與抗脅迫有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)。因此，研究基因的表達(dá)特性對(duì)分析植物抵御非生物脅迫的作用機(jī)制是十分重要的。2016年，李 飛等[15]對(duì)低溫處理下東農(nóng)冬麥2號(hào)小麥三葉期根組織TaEXPA基因的表達(dá)分析表明，TaEXPA5、TaEXPA6和 TaEXPA7三個(gè)基因的表達(dá)量可能與其抗御低溫脅迫的能力正相關(guān)。本研究中，幼苗期根中的 TaEXAP7基因隨著4 ℃處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，且其表達(dá)量均小于未處理時(shí)基因的表達(dá)量，由此可見(jiàn)，該基因在冬小麥生長(zhǎng)的不同時(shí)期的表達(dá)量以及表達(dá)模式是不相同的，其作用機(jī)制也可能存在差異。趙美容等[16]于2016年在抗旱性不同的小麥擴(kuò)展蛋白活性及基因表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn)，TaEXPA3基因的表達(dá)在干旱脅迫下上調(diào)，且與品種抗旱性相關(guān)，表明干旱脅迫誘導(dǎo)的擴(kuò)展蛋白活性的提高與擴(kuò)展蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。而本研究中， TaEXPA7-A/B/D基因的表達(dá)在干旱脅迫下下調(diào)，且PEG濃度越高，其表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)下降越明顯。在膨脹素龐大的基因家族中，不同的基因行使著不同的功能，所以該基因也有可能參與和抗旱有關(guān)的作用機(jī)制。ABA、SA和JA是植物生長(zhǎng)必要的激素，可通過(guò)復(fù)雜而精細(xì)的網(wǎng)絡(luò)來(lái)調(diào)控植物不同階段的生長(zhǎng)發(fā)育，還可以響應(yīng)各種生物與非生物脅迫，從而提高植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。近年來(lái)，有人在外源激素影響基因表達(dá)特性的研究中發(fā)現(xiàn)，茉莉酸主要通過(guò)誘導(dǎo)擴(kuò)展蛋白基因的上調(diào)表達(dá)來(lái)提高擴(kuò)展蛋白的活性[17-19]。 TaEXPAB23在受到MeJA的處理后其mRNA水平表達(dá)量升高。本研究中， TaEXPA7-A/B/D三個(gè)基因均屬于下調(diào)基因。該基因能否降低膨脹素活性，是否參與了植物生長(zhǎng)的主要機(jī)制還有待研究。

最近，關(guān)于膨脹素基因與根系發(fā)育的研究已經(jīng)有許多報(bào)道。AtEXPA7、OsEXPA10、OsEXPA7、 HvEXPB7等均是與植物根系生長(zhǎng)相關(guān)的重要基因[20-22]。

TaEXPA7-A/B/D與 OsEXPA10基因有較高的相似性，結(jié)合本試驗(yàn)研究結(jié)果，推測(cè) TaEXPA7基因也是一組和植物根系生長(zhǎng)相關(guān)的重要基因，而根系能否正常生長(zhǎng)發(fā)育又是冬小麥成功越冬的關(guān)鍵，因此推測(cè)該基因可能是影響冬小麥生長(zhǎng)發(fā)育的重要基因。

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CloningandCharacterizationofTaEXPA7PartialHomologousGenesinRootsofWinterWheatDongnongdongmai2

DONGJiamin1,XUYongqing1,PengLina1,FENGXu1,YAOShukuan1,ZHAOQiaoqin1,LIFenglan1,HUBaozhong1,2

(1.College of Life Science,Northeast Agriculture University,Harbin,Heilongjiang 150030，China;2.Harbin University,Harbin,Heilongjiang 150086,China)

Expansin is a protein that induces cell wall relaxation and elongation during plant growth and development, which containsEXPA,EXPB,EXLAandEXLBfour gene families,playing an important role in the formation and rapid development of plant roots. In this experiment, the root of cold winter wheat Dongnongdongmai 2 at two leaf stage was used as the material to clone the three CDS full-length of the TaEXPA7 gene.Their amino acid sequences were highly homologous with only two different amino acids at signal peptide.The nucleic acid sequence length was 777 bp, encoding 258 amino acids.These three genes were named as TaEXPA7-A, TaEXPA7-B, TaEXPA7-D, located at 2AL, 2BL and 2DL chromosomes, respectively. The protein contained two conserved domains, DPBB-1 and Pollen-allerg-1, with molecular weight of 27 670.74 Da and isoelectric point of 8.09 and they were hydrophobic proteins. The similarity between them andAegilopstauschiiandBrachypodiumdistachyonwas 99% and 92%, respectively. qRT-PCR analysis of roots of winter wheat at two leaves stage showed that TaEXPA7-A/B/D expressed higher in root tips, followed by elongation zone and mature zone. The winter wheat roots were treated with low temperature, drought and hormone and the three genes were all down regulated,the relative expression of TaEXPA7-B gene was higher and that of TaEXPA7-D was lower,which indicated that genes in different chromosomes of polyploid wheat responded differently to environmental stresses,their gene expression and response patterns were different, and the dominant chromosomes were also different under different environmental stresses. Moreover, the expression of these genes in roots may be related to stress such as low temperature, drought and exogenous hormones.They may be important gene for root growth.

Winter wheat; TaEXPA7; Partial homology; Expression characteristics

時(shí)間：2017-11-14

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20171114.1027.018.html

2017-05-25

2017-07-08

國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金項(xiàng)目(J1210069)；中俄國(guó)際合作項(xiàng)目(2013DFR30270)

E-mail：1970113717@qq.com

李鳳蘭(E-mail:lifenglan@neau.edu.cn);胡寶忠(E-mail：bzhu@neau.edu.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)11-1419-09