宋志成，費(fèi)新敏，楊 煜，喬利仙，王晶珊，李廣存，郭寶太

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省植物生物技術(shù)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所，山東 濟(jì)南 250100；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所，北京 100081)

馬鈴薯A病毒(PotatovirusA，PVA)是在歐洲、北美等馬鈴薯產(chǎn)區(qū)分布廣泛，可侵染多種茄科植物的病毒，造成減產(chǎn)達(dá)40%[1]。該病毒可隨種薯傳播，也可通過蚜蟲以非持久的方式傳播。PVA與PVX、PVY等可發(fā)生復(fù)合侵染，對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)有很大的危害。目前在我國PVA有少量發(fā)現(xiàn)，但該病毒具有較高的流行風(fēng)險(xiǎn)，加強(qiáng)防治研究及口岸檢驗(yàn)檢疫控制非常必要。

馬鈴薯感染PVA后會(huì)出現(xiàn)花葉、壞死病斑等癥狀，因品種及病毒株系的不同而異[2]。PVA為馬鈴薯Y病毒屬成員，病毒粒子為彎曲線狀，2013年Ksenofontov等[3]對(duì)其紫外吸收光譜等物理化學(xué)特性進(jìn)行了細(xì)致的研究。PVA的基因組為正義單鏈RNA，1994年P(guān)uurand等[4]獲得了PVA全基因組序列，其長度約為9.6 knt，隨后的研究深入到PVA基因組全序列的比較[5]。在獲得PVA基因組全序列以前，通過基因組3′端部分序列的測(cè)定與分析便確定了PVA-CP基因的序列，CP含有269個(gè)氨基酸殘基[6]。對(duì)不同地區(qū)PVA分離物CP序列的分析發(fā)現(xiàn)其N端第5～7殘基為蚜傳基序DAG，該基序變異為DAS、DTG、DTS時(shí)，PVA病毒失去蚜蟲傳播能力[7]。在我國PVA研究起步很晚，2002年程曄等[8]報(bào)道了PVA杭州分離物，隨后的研究集中在PVA新分離物的分析鑒定、CP基因的克隆與序列分析[9-11]、PVA檢測(cè)方法及其改進(jìn)等內(nèi)容[12-16]。

防治PVA的有效途徑是生產(chǎn)中使用脫毒種薯或抗病品種，其中使用脫毒種薯更切實(shí)可行。Sip[17]利用莖尖組織培養(yǎng)和熱處理相結(jié)合的方法高效率地脫除了PVA與PVS。針對(duì)PVA進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)，則是無毒種薯脫毒質(zhì)量的重要保障。脫毒種薯的生產(chǎn)利用中，ELISA檢測(cè)仍然是普遍采用的方法，檢測(cè)PVA所用抗體及試劑盒均為進(jìn)口產(chǎn)品，未見國內(nèi)制備出PVA抗血清的報(bào)道。

1 材料和方法

從PVA-CP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建到ELISA測(cè)定于2014-2016年在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳研究室完成。

1.1 載體、菌株與病毒標(biāo)準(zhǔn)物

PVA-ACP基因的亞克隆載體pMD18-ACP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，pET22b-PhTPS是壇紫菜TPS基因(PhTPS)的原核表達(dá)載體[19]。大腸桿菌菌株DH5α、BL21由本實(shí)驗(yàn)室保存。馬鈴薯A病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)物和馬鈴薯病毒陰性標(biāo)準(zhǔn)物購自美國Agdia公司。

1.2 主要試劑與試劑盒

DNA Marker、蛋白Marker、限制性內(nèi)切酶為寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品，IPTG、蛋白提取試劑、蛋白酶抑制劑PMSF、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔二抗、質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒等購自上海生工生物工程股份有限公司，蛋白純化柱HiTrap Chelating HP、抗體純化柱Protein G購自美國GE公司，高效無蛋白封閉液為Thermo產(chǎn)品。

1.3 PVA-CP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

質(zhì)粒pMD18-ACP進(jìn)行NdeⅠ與Hind Ⅲ雙酶切，回收含PVA-CP基因的723 bp片段，pET22b-PhTPS經(jīng)同樣雙酶切后回收長度約為5 000 bp的載體大片段，2個(gè)片段的連接產(chǎn)物就是PVA-CP基因的原核表達(dá)載體，命名為pET22b-ACP，經(jīng)酶切鑒定與DNA序列測(cè)定確認(rèn)表達(dá)載體構(gòu)建的正確性，測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.4 細(xì)菌總蛋白的提取及重組CP的純化

重組菌BL21(pET22b-ACP)接種于液體LB培養(yǎng)基(Amp 100 μg/mL)中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD600為0.4～0.6，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，37 ℃振蕩培養(yǎng)10 h。菌體總蛋白的提取采用溶菌酶裂解法，包涵體用含8 mol/L尿素的磷酸鹽緩沖溶液(20 mmol/L Na2HPO3，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH值7.4)溶解，目的蛋白的純化采用鎳離子親和層析法。分別取1 mL未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)菌液離心，用40 μL 1×上樣緩沖液懸浮菌體；分別取40 μL包涵體懸浮液、目的蛋白純化溶液加入10 μL 5×上樣緩沖液并混勻；上述樣品煮沸5 min后，取20 μL上樣，SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)、提取及純化效果。

1.5 重組CP抗血清的制備

純化的重組CP經(jīng)透析、濃縮及定量后作為抗原免疫家兔，共進(jìn)行4次免疫，重組CP與等體積弗氏完全佐劑混勻乳化后用于初免，劑量為1 mg/只；蛋白抗原與等體積弗氏不完全佐劑混勻乳化后用于二免、三免與四免，劑量為0.5 mg/只，抗血清效價(jià)的測(cè)定采用間接ELISA法?？寡逯苽浼靶r(jià)測(cè)定由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.6 多克隆抗體的分離、純化與酶標(biāo)記

多克隆抗體(IgG)的分離采用飽和硫酸銨沉淀法，其純化采用Potein G親和層析法。IgG的酶標(biāo)記采用了戊二醛一步法：取1 mL濃度為2 mg/mL的IgG裝入透析袋中，用PBS(pH值7.4)于4 ℃透析18 h，期間換液3次；加5 mg堿性磷酸酶，溶解并混勻，繼續(xù)用PBS(pH值7.4)于4 ℃透析12 h，期間換液2次；取出混合溶液并加入2 μL 50%的戊二醛，室溫反應(yīng)2 h，經(jīng)PBS(pH值7.4)透析后取出酶標(biāo)抗體(IgG-AP)加入200 μL的甘油，4 ℃保存待用。

1.7 抗體與酶標(biāo)抗體活性的測(cè)定

重組CP多克隆抗體活性的測(cè)定采用間接ELISA法，用濃度為2 μg/mL的重組CP作抗原包被反應(yīng)孔，以免疫前抗血清為陰性對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照。酶標(biāo)抗體(IgG-AP)活性的測(cè)定采用直接ELISA法，重組CP包被濃度為2 μg/mL，設(shè)陰性對(duì)照與空白對(duì)照。DAS-ELISA測(cè)定時(shí)，陰性對(duì)照中用免疫前抗血清包被反應(yīng)孔，并設(shè)空白對(duì)照。ELISA測(cè)定中反應(yīng)孔的封閉采用高效無蛋白封閉液，每孔200 μL；用PBST洗滌反應(yīng)孔，每次3遍，在BioTek 公司Elx800型酶標(biāo)儀上測(cè)定OD值。

1.8 馬鈴薯A病毒的ELISA檢測(cè)

用重組CP多克隆抗體進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，用酶標(biāo)抗體(IgG-AP)進(jìn)行直接ELISA檢測(cè)，用2 mL的病毒提取緩沖溶液(含0.01 mmol/L Na2SO3，2% PVP-4000，0.2% BSA，2% Tween-20的PBS，pH值7.4)將PVA陽性病毒標(biāo)準(zhǔn)物溶解并制成抗原包被工作液，每孔包被量100 μL，馬鈴薯病毒陰性物為陰性對(duì)照，設(shè)空白對(duì)照。用重組CP多克隆抗體及酶標(biāo)抗體進(jìn)行PVA的DAS-ELISA檢測(cè)時(shí)，以PVA重組CP(2 μg/mL)為陽性對(duì)照，馬鈴薯病毒陰性物為陰性對(duì)照，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVA-CP基因的原核表達(dá)及重組CP的提取與純化

用 含PVA-CP基因的NdeⅠ-Hind Ⅲ片段替代表達(dá)載體pET22b-PhTPS中的PhTPS基因，獲得了PVA-CP基因的原核表達(dá)載體，命名為pET22b-ACP。從轉(zhuǎn)化子中提取重組質(zhì)粒，NdeⅠ與Hind Ⅲ雙酶切后獲得了載體片段與723 bp的基因片段(圖1，泳道5，6)，酶切結(jié)果符合預(yù)期，測(cè)序結(jié)果顯示PVA-CP基因插入載體的方向正確，序列沒有改變，原核表達(dá)載體構(gòu)建正確。

SDS-PAGE電泳檢測(cè)顯示經(jīng)誘導(dǎo)后菌體中表達(dá)出了特異性的蛋白條帶(圖2，泳道2，3)，其分子量約為30 kDa。723 bp的PVA-CP基因片段的翻譯產(chǎn)物約為26.9 kDa，pET22b(+)載體中3′端His標(biāo)簽序列對(duì)應(yīng)的翻譯產(chǎn)物為3.0 kDa，預(yù)期的重組蛋白為29.9 kDa，結(jié)果與預(yù)期相符。該目的蛋白主要以包涵體的形式存在，用鎳離子親和層析柱進(jìn)行純化后獲得了高純度的重組CP(圖2，泳道4)。

1.DNA Marker (DL15000)；2.表達(dá)載體pET22b-ACP；3.質(zhì)粒pET22b-ACP/Hind Ⅲ；4.質(zhì)粒pET22b-ACP/Nde Ⅰ；5～6.質(zhì)粒pET22b-ACP/Hind Ⅲ+Nde Ⅰ。

M.蛋白 Marker；1.未誘導(dǎo)的菌體蛋白；2.誘導(dǎo)后的菌體蛋白；3.包涵體蛋白；4.純化的重組CP。M.Protein Marker；1.Without induction；2.Induction with IPTG；3.Protein of inclusion body；4.Purified recombinant CP.

2.2 抗血清制備及重組CP多克隆抗體的純化與標(biāo)記

利用高純度重組CP溶液免疫家兔制備出了抗血清，間接ELISA測(cè)定顯示其效價(jià)為1∶512k，即獲得了高效價(jià)抗血清。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示與抗血清相比抗體粗分離液中雜蛋白的含量明顯減少(圖3，泳道2，3)，柱層析純化得到的多克隆抗體中重鏈和輕鏈清晰，結(jié)果表明，獲得了高純度多克隆抗體(圖3，泳道4)，并用戊二醛法進(jìn)行堿性磷酸酶標(biāo)記獲得了其酶標(biāo)抗體。

1.蛋白 Marker；2.PVA重組CP抗血清；3.抗體粗分離物；4.純化的多克隆抗體。1.Protein Marker；2.Antiserum of recombinant CP；3.Crude IgG；4.Purified IgG.

2.3 重組CP純化抗體及酶標(biāo)抗體活性的測(cè)定

以PVA重組CP為抗原包被反應(yīng)孔，在間接ELISA與直接ELISA測(cè)定中，陰性對(duì)照與空白對(duì)照都不顯色，含純化抗體或酶標(biāo)抗體的反應(yīng)孔顯色，目

測(cè)結(jié)果反應(yīng)為陽性，但稀釋度增加后反應(yīng)孔顏色變淺。OD值測(cè)定結(jié)果顯示抗體稀釋度在1∶64k的范圍內(nèi)，多克隆抗體與抗原(重組CP)具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，反應(yīng)孔與陰性對(duì)照OD值之比≥2.5(表1)，判斷為陽性；酶標(biāo)抗體稀釋度達(dá)1∶6 400時(shí)，仍與PVA重組CP具有較強(qiáng)的反應(yīng)活性，該比值≥2.5(表2)，也判斷為陽性反應(yīng)。

重組CP的IgG與IgG-AP分別進(jìn)行1∶100、1∶200與1∶300稀釋，在與PVA重組CP的DAS-ELIS反應(yīng)中目測(cè)結(jié)果為陽性，陰性與空白對(duì)照孔呈陰性反應(yīng)。在波長為405 nm下測(cè)定OD值(表3)，結(jié)果表明，隨著IgG和IgG-AP稀釋度的增大，OD值變小，IgG與IgG-AP稀釋度都為1∶100時(shí)，反應(yīng)孔OD值最大；二者稀釋度都為1∶300時(shí)，反應(yīng)孔OD值最小，與陰性孔OD值的比值小于2.5，判斷為陰性，其余孔都為陽性。

表1 重組CP多克隆抗體(IgG)活性的間接ELISA測(cè)定Tab.1 Activity determination of IgG against recombinant CP by indirect ELISA

表2 重組CP酶標(biāo)抗體(IgG-AP)活性的直接ELISA測(cè)定Tab.2 Activity determination of IgG-AP against recombinant CP by direct ELISA

表3 多克隆抗體及其酶標(biāo)抗體活性的DAS-ELISA測(cè)定Tab.3 Activity determination of IgG against recombinant CP and Its IgG-AP by

2.4 馬鈴薯A病毒的ELISA檢測(cè)

以馬鈴薯A病毒陽性標(biāo)準(zhǔn)物為抗原包被反應(yīng)孔，間接與直接ELISA測(cè)定中反應(yīng)孔的目測(cè)結(jié)果均為陽性。根據(jù)反應(yīng)孔OD值與陰性孔OD值之比≥2.5的標(biāo)準(zhǔn)，多克隆抗體稀釋度達(dá)1∶8 000時(shí)，還能夠與PVA陽性標(biāo)準(zhǔn)物發(fā)生陽性反應(yīng)(表4)；酶標(biāo)抗體(IgG-AP)稀釋度達(dá)1∶800時(shí)，仍能與PVA陽性標(biāo)準(zhǔn)物發(fā)生反應(yīng)(表5)，結(jié)果表明本試驗(yàn)制備的酶標(biāo)抗體具有較高抗原結(jié)合能力與酶活性。

在DAS-ELISA反應(yīng)中，PVA陽性標(biāo)準(zhǔn)物及陽性對(duì)照(重組CP)的反應(yīng)孔都呈現(xiàn)黃色，其余孔無色，目測(cè)判斷PVA標(biāo)準(zhǔn)物和重組CP反應(yīng)孔都為陽性，且重組CP反應(yīng)孔顏色明顯深于病毒陽性物，這是正常表現(xiàn)。OD405測(cè)定結(jié)果表明PVA陽性標(biāo)準(zhǔn)物與重組CP反應(yīng)孔的OD值明顯大于陰性對(duì)照(表6)，依照OD測(cè)≥2.5倍OD陰的標(biāo)準(zhǔn)判斷反應(yīng)都為陽性。另外，檢測(cè)中病毒陽性物反應(yīng)孔有3列，OD測(cè)定值重復(fù)性好，表明DAS-ELISA反應(yīng)穩(wěn)定性強(qiáng)(表6)。

本試驗(yàn)制備的IgG和IgG-AP達(dá)到了馬鈴薯A病毒DAS-ELISA檢測(cè)的要求，為利用重組CP多克隆抗體檢測(cè)PVA或組裝馬鈴薯A病毒DAS-ELISA檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

表4 PVA陽性標(biāo)準(zhǔn)物的間接ELISA檢測(cè)Tab.4 Detection of PVA positive standard by indirect

表5 PVA陽性標(biāo)準(zhǔn)物的直接ELISA檢測(cè)Tab.5 Detection of PVA positive standard by direct

表6 PVA陽性標(biāo)準(zhǔn)物的DAS-ELISA檢測(cè)Tab.6 Detection of PVA positive standard by DAS-ELISA

注：1列、2列與3列分別指第1、第2與第3列反應(yīng)孔。

Note：Column 1，column 2 and column 3 mean the first，the second and the third column of reaction wells respectively.

3 討論

目前，針對(duì)PVA的檢測(cè)方法主要是分子生物學(xué)方法與免疫學(xué)方法，后者應(yīng)用方便、特異性強(qiáng)、要求條件簡單，仍然是最基本的方法，特別是DAS-ELISA檢測(cè)法。利用馬鈴薯A病毒粒子作抗原免疫家兔可制備出PVA特異性抗血清，并可用于ELISA檢測(cè)[20]。我國進(jìn)行PVA檢測(cè)的抗血清(抗體)及ELISA試劑盒依賴進(jìn)口，實(shí)現(xiàn)其國產(chǎn)化意義明顯。

利用CP基因原核表達(dá)產(chǎn)物(重組CP)作抗原制備血清，具有抗原純度高、制備速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn)，值得深入研究。2002年Cerovsk等[18]利用PVA重組CP出了鼠抗血清，但獲得的多克隆抗體用于間接ELISA檢測(cè)有效，用于DAS-ELISA則反應(yīng)信號(hào)弱、噪音信號(hào)(陰性對(duì)照)強(qiáng)，達(dá)不到DAS-ELISA檢測(cè)的要求。

本研究利用pET22b載體實(shí)現(xiàn)了PVA-CP基因的高效率表達(dá)，用重組CP制備出了高效價(jià)抗血清。針對(duì)重組CP多克隆抗體及其酶標(biāo)抗體的活性進(jìn)行了系統(tǒng)比較與研究，結(jié)果表明：在間接、直接與DAS的3種ELISA測(cè)定中，PVA陽性標(biāo)準(zhǔn)物反應(yīng)信號(hào)強(qiáng)、目測(cè)及OD值測(cè)定結(jié)果都呈現(xiàn)陽性；陰性與空白對(duì)照不顯色，前者OD值高于后者，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他反應(yīng)孔；用重組CP作抗原，顯色深度高于PVA陽性標(biāo)準(zhǔn)物；從間接ELISA到直接ELISA、再到DAS-ELISA，抗體的有效使用濃度逐漸降低。這些表現(xiàn)屬于正常，沒有發(fā)現(xiàn)異常。本研究制備的重組CP多克隆抗體及其酶標(biāo)抗體達(dá)到了DAS-ELISA檢測(cè)的要求，這與開始就使用高純度重組CP作抗原，最后使用高純度抗體，整個(gè)過程嚴(yán)格有關(guān)，也可能與抗血清制備方法及ELISA測(cè)定的具體方法不同有關(guān)。本研究室制備的馬鈴薯卷葉病毒重組CP多克隆抗體可用于PLRV的DAS-ELISA檢測(cè)[21]，制備的PVS及PVM重組CP多克隆抗體也達(dá)到了DAS-ELISA檢測(cè)的要求，目前PLRV、PVS、PVM與PVA等4種主要病毒重組CP多克隆抗體都達(dá)到了DAS-ELISA檢測(cè)的要求。

本研究室的目標(biāo)就是制備出6種馬鈴薯主要病毒的重組CP多克隆抗體，都達(dá)到DAS-ELISA的要求，并推進(jìn)其在生產(chǎn)中的利用，針對(duì)PVX與PVY重組CP多克隆抗體的研究正在進(jìn)行中，但抗血清(抗體)的大量制備與應(yīng)用仍是具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。即使利用重組CP作抗原，制備的抗血清(抗體)仍然存在功能單一的問題，有必要研究新型的抗血清(抗體)，以減少檢測(cè)量、降低檢測(cè)成本。Kapoor等[22]利用PVX與PVY嵌合CP基因的原核表達(dá)產(chǎn)物制備出了多克隆抗體，在直接ELISA檢測(cè)中該抗體既與PVX也與PVY有陽性反應(yīng)。這一研究表明用重組CP制備出的1種多克隆抗體可用于2種馬鈴薯病毒的ELISA檢測(cè)，為降低ELISA檢測(cè)成本提供了新的技術(shù)途徑。另外，ELISA檢測(cè)技術(shù)存在步驟多、需要時(shí)間長的問題，改進(jìn)ELISA具體檢測(cè)方法[23]也是非常必要的。