馬輝　張?zhí)稹×蝴惥“ㄖ摇￡愋闾m　孫葉

摘要：研究了春蘭種內(nèi)雜交種和種間雜交種的結(jié)實情況，種子無菌萌發(fā)和植株再生培養(yǎng)技術(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，春蘭種內(nèi)雜交、春蘭與蕙蘭種間正反交結(jié)果率和種子量都比較正常，春蘭種內(nèi)雜交種萌發(fā)率明顯高于種間雜交種；春蘭種內(nèi)雜交種第1年雜交種子萌發(fā)數(shù)大于50的占到1111%，第2年雜交種子萌發(fā)數(shù)大于50組合為24%，第3年雜交種子萌發(fā)數(shù)大于50的占到3827%，春蘭品種自交種、種子萌發(fā)原球莖出現(xiàn)不同程度的白化變異；春蘭和大花蕙蘭種間正反交結(jié)果率差異較大，蒴果種子量少，但種子萌發(fā)數(shù)多，種子培養(yǎng)第1年萌發(fā)數(shù)均大于100；春蘭種內(nèi)雜交種子萌發(fā)后根狀莖增殖和芽誘導液體培養(yǎng)方式的增殖生長量和形成優(yōu)勢數(shù)明顯優(yōu)于固體培養(yǎng)。在“環(huán)球荷鼎×九章梅”雜交種組培小苗根誘導試驗中，當活性炭濃度為1 gL，NAA濃度為05 mgL時，組培苗平均新根數(shù)和平均新根長數(shù)最大。

關(guān)鍵詞：春蘭；人工雜交；無菌萌發(fā)；植株再生

中圖分類號： S6823104+3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0049-03[

[HJ14mm]

收稿日期：2016-05-26

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（13）5071）。

作者簡介：馬輝（1987—），男，江蘇泰州人，研究實習員，主要從事花卉組織培養(yǎng)研究。E-mail：mhhao520@qqcom。

通信作者：孫葉，碩士，副研究員，主要從事花卉育種和組織培養(yǎng)研究。E-mail：sunye9999@126com。

春蘭（Cymbidium goeringii）是蘭科蘭屬地生蘭類多年生草本，是傳統(tǒng)中國蘭的代表種，原產(chǎn)于我國長江流域或西南地區(qū)，日本和朝鮮半島也有分布。春蘭名優(yōu)品種具有很高的觀賞價值和經(jīng)濟價值，在東南亞特別是日本、韓國和臺灣地區(qū)十分受歡迎。春蘭的花期恰逢農(nóng)歷春節(jié)，在年宵花市場有很大的開發(fā)潛力。利用春蘭名優(yōu)品種作為親本，進行種內(nèi)雜交和種間雜交，是豐富春蘭花期、花型、花色性狀，選育春蘭優(yōu)良新種質(zhì)的有效途徑，人工雜交育種和組培快繁技術(shù)對春蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有十分重要的意義。

1材料與方法

11材料

試驗材料春蘭、蕙蘭（C faberi）、大花蕙蘭（C hybrids）由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所“香蘭苑”中國蘭種質(zhì)資源圃提供；無菌播種材料為2009年以來人工雜交獲得的雜交種；增殖培養(yǎng)和芽分化材料為雜交種2012年無菌萌發(fā)后形成的原球莖或根狀莖；根誘導試驗材料為“環(huán)球荷鼎×九章梅”雜交組合雜交種經(jīng)無菌萌發(fā)，增殖培養(yǎng)和芽誘導培養(yǎng)后的 3～4 cm 無根組培苗。

12方法

121人工雜交2009—2015年春，對花期相遇的春蘭、蕙蘭、大花蕙蘭作為親本進行人工授粉雜交。雜交組合主要分為春蘭種內(nèi)品種間雜交、春蘭與蕙蘭的種間雜交、春蘭與大花蕙蘭的種間雜交。授粉時用干凈的鑷子把母本的花粉取下，將父本的花粉塊放入母本的蕊腔中，用記號筆在花盆上和試驗記錄本上寫明雜交組合名稱、雜交時間，3個月后登記結(jié)果率；分別在無菌播種后12、24、36個月統(tǒng)計雜交種萌發(fā)率。

122種子無菌播種及萌發(fā)時間統(tǒng)計采收成熟度為5—7個月、果皮略黃但尚未裂開的蒴果，種子前處理后，播于固體培養(yǎng)基，每個塑果播10瓶，統(tǒng)計相對種子量。培養(yǎng)基配方為12MS+05 mgLNAA+05 gL蛋白胨+20 gL蔗糖+05 gL 活性炭+70 gL瓊脂，pH值51～54。播種后暗培養(yǎng)，室溫為25～28 ℃，種子萌發(fā)后見光培養(yǎng)10～12 hd，3個月后每月統(tǒng)計雜交組合的雜交種子萌發(fā)數(shù)。

123增殖培養(yǎng)、芽分化誘導的基本培養(yǎng)增殖培養(yǎng)、芽分化誘導的基本培養(yǎng)基為12MS+05 gL蛋白胨+20 gL蔗糖+05 gL活性炭，pH值51～54，固體培養(yǎng)基加7 gL瓊脂粉，液體培養(yǎng)基不添加瓊脂粉。3因素隨機區(qū)組試驗，A因素為不同雜交組合，5個材料；B因素為NAA和6-BA濃度配比，5個水平；C因素為培養(yǎng)方式，液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)。每個處理培養(yǎng)4 g根狀莖，10個重復，培養(yǎng)3個月后稱質(zhì)量統(tǒng)計，統(tǒng)計根狀生長量和優(yōu)勢芽數(shù)。

124生根誘導的基本培養(yǎng)生根誘導的基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為12MS+05 gL蛋白胨+20 gL蔗糖+05 gL馬鈴薯粉，pH值51～54。2因素試驗，A因素為活性炭濃度，3個水平，B因素為NAA濃度，3個水平。每個處理接種6株無根小苗，5個重復，培養(yǎng)90 d后測量和統(tǒng)計每處理的平均新根數(shù)和平均新根長。

2結(jié)果與分析

21春蘭人工雜交的結(jié)果率及雜交組合萌發(fā)情況

研究發(fā)現(xiàn)，春蘭種內(nèi)及春蘭、蕙蘭種間雜交的結(jié)果率和種子量都很正常。春蘭種內(nèi)雜交的組合萌發(fā)率為525%，較春蘭種間雜交高；大花蕙蘭作為母本和春蘭雜交不容易獲得蒴果，種子發(fā)育不正常，沒有萌發(fā)的組合；春蘭作為母本與大花蕙蘭雜交結(jié)果率達80%，但種子量較正常雜交種少，但由于蘭花雜交種子總量大，春蘭和大花蕙蘭雜交種種子萌發(fā)后群體仍然很大，并不影響種苗快繁和新品種選育（表1）。

22春蘭品種間雜交種的種子萌發(fā)情況

春蘭和蕙蘭種間雜交部分雜交種能正常萌發(fā)，但種子萌發(fā)時間較長，種子萌發(fā)數(shù)較低，均小于50（表2）。春蘭和大花蕙蘭雜交，雜交組合第1年就能大量萌發(fā)，第2年少量萌發(fā)，第3年基本已不萌發(fā)（表3）。

春蘭種內(nèi)雜交種子第1年萌發(fā)數(shù)大于50的組合占到1111%，第2年雜交種子萌發(fā)數(shù)大于50組合為24%，第3年雜交種子萌發(fā)數(shù)大于50的組合占到3827%。其中第1年[CM（25]萌發(fā)數(shù)較大的組合以種子萌發(fā)大于100為主，第2、第3年

萌發(fā)數(shù)較大的組合以種子萌發(fā)大于50為主。所有萌發(fā)組合中，種子萌發(fā)量較大的組合占到5178%（表4）。endprint

春蘭自交種子3年內(nèi)種子萌發(fā)數(shù)較大的組合占 6364%，但自交種萌發(fā)后出現(xiàn)原球莖白化現(xiàn)象的組合占 7273%，白化率最高達到364%。這些白化材料能正常增殖和芽分化，培養(yǎng)出白化苗，但組培苗成苗率較低，綠色材料能正常培養(yǎng)，組培苗出瓶后生長性狀也比較穩(wěn)定（表5）。

23春蘭品種間雜交種的增殖培養(yǎng)和芽分化誘導

不同雜交組合的雜交種根狀莖在NAA濃度為05 mgL的液體培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)生長量較大，與固體培養(yǎng)基比較，液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)根狀莖增殖生長量大；根狀莖在NAA、6-BA濃度為（0+2） mgL和（1+3） mgL時，優(yōu)勢芽較多，同一激素濃度下，液體培養(yǎng)基較固體培養(yǎng)基平均優(yōu)勢芽多；不同雜交組合的根狀莖生長和芽誘導的最佳培養(yǎng)基配方和最佳培養(yǎng)方

式不同（表6）。

24春蘭品種間雜交種的根誘導

當活性炭濃度為10 gL、NAA濃度為05 mgL時，組培苗平均新根數(shù)和平均新根長最大。NAA濃度相同時，隨著活性炭濃度增加平均新根數(shù)增加，但無顯著影響，活性炭濃度相同時，隨著NAA的濃度增加平均新根數(shù)和平均新根長增加，且影響顯著（表7）。

3結(jié)論與討論

春蘭的品種創(chuàng)新水平嚴重落后于國外蘭科花卉，主要原因是人工雜交選育還未成為中國蘭品種創(chuàng)新的主要途徑。蘭科植物人工雜交選育新品種的主要技術(shù)瓶頸為雜交種子的無菌萌發(fā)和植株再生培養(yǎng)[1-4]，本研究結(jié)果表明，春蘭品種間雜交種結(jié)果率很高，雜交組合萌發(fā)率達525%，種子萌發(fā)時間長達3年左右，1年內(nèi)萌發(fā)，種子萌發(fā)數(shù)大的雜交種僅占58%，這與以往的研究結(jié)果[5]一致。春蘭雜交種的萌發(fā)特點增加了人工雜交育種的難度，因此增加雜交組合的數(shù)量，延長雜交種子的萌發(fā)時間是提高雜交種萌發(fā)率的有效途徑。

春蘭、蕙蘭都屬于蘭屬地生蘭種，親緣關(guān)系較近，大花蕙蘭是通過蘭屬中的大花附生種、小花垂生種以及一些地生蘭經(jīng)過多代人工雜交育成的品種群。本研究發(fā)現(xiàn)春蘭種間雜交組合中，春蘭和蕙蘭正反交結(jié)果率都正常，但雜交種萌發(fā)率低，種子萌發(fā)時間長，種子培養(yǎng)2～3年后才萌發(fā)，且種子萌發(fā)數(shù)也較少，均未超過50個。春蘭和大花蕙蘭的正反交雜交種的結(jié)果率差異明顯，春蘭為母本時能得到雜交蒴果，但雜交種種子量較正常雜交種少，雜交種萌發(fā)時間短，以種子→原球莖→完整植株途徑生長發(fā)育成苗，這是附生蘭種子發(fā)育的特點。以往研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)具有附生蘭血統(tǒng)的大花蕙蘭與地生蘭雜交具有此特點[6-10]，因此推測，春蘭、蕙蘭雜交種的種子萌發(fā)困難、萌發(fā)時間長是由地生蘭的特性決定的，研究相關(guān)內(nèi)容可

能是解決中國蘭雜交種萌發(fā)困難、萌發(fā)時間長問題的關(guān)鍵。

春蘭的組培快繁是實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的重要前提，植物組培用培養(yǎng)基有固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基相對固體培養(yǎng)基組織培養(yǎng)量大，可培養(yǎng)時間長，工序簡單，節(jié)省成本，本研究結(jié)果證明液體培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)和誘芽培養(yǎng)效果優(yōu)于固體培養(yǎng)基，與已有研究報道[11-13]一致，但還未受到廣泛關(guān)注，液體培養(yǎng)方式對于春蘭大規(guī)模組培快繁有很高的應(yīng)用價值，可嘗試推廣。

參考文獻：

[1][ZK（#]李子紅，賈燕 珍品蘭花快速繁殖與養(yǎng)護[M] 上海：上海科學技術(shù)出版社，2006

[2]徐程，詹忠根，張銘 中國蘭的組織培養(yǎng)[J] 植物生理學通訊，2002，38（2）：171-174

[3]黃磊，賀筱蓉，鄭立明 春蘭種子非共生萌發(fā)的研究[J] 種子，2003，132（6）：40-41

[4]孫崇波，劉玫，施季森 蕙蘭種子無菌萌發(fā)及植株再生[J] 浙江農(nóng)業(yè)學報，2008，20（4）：231-235

[5]龐惠仙，楊紅明，馬駿，等 春蘭、豆瓣蘭、蓮瓣蘭和春劍4種國蘭種子萌發(fā)特性研究初報[J] 西部林業(yè)科學，2010，39（3）：56-60

[6]孟英，聞永慧，李慧敏，等 虎雪蘭與朱砂蘭、蕙蘭正反交育種及種子無菌萌發(fā)與增殖研究[J] 安徽農(nóng)業(yè)科學，2014，42（13）：3812-3814

[7]張志勝，何瓊英，傅雪琳，等 中國蘭花遠緣雜交及雜交種子萌發(fā)的研究[J] 華南農(nóng)業(yè)大學學報，2001，22（2）：62-65

[8]朱根發(fā)，王碧青，陳明莉，等 大花蕙蘭與蘭屬植物種間雜交研究[J] 植物學通報，2005，22（4）：445-448

[9]曾碧玉，常強，許傳俊 雜交蘭品種“韓國小姐”與墨蘭品種“企劍黑墨”雜交坐果及無菌播種研究[J] 熱帶作物學報，2015，36（3）：510-515

[10][ZK（#]朱根發(fā)，陳明莉，羅智偉，等 墨蘭與大花蕙蘭種間雜種原球莖的誘導及增殖研究[J] 園藝學報，2004，31（5）：688-690

[11]孫葉，包建忠，劉春貴，等 春蘭雜交種子無菌萌發(fā)及根狀莖增殖的研究[J] 金陵科技學院學報，2012，28（1）：76-79

[12]陳銀龍 國蘭無菌播種技術(shù)研究[J] 安徽農(nóng)業(yè)科學，2006，34（17）：4291

[13]王利民 大花蕙蘭雜交育種研究[D] 北京：北京林業(yè)大學，2007endprint