劉敏　劉鵬冀　趙玉濤　盧紅

摘要：以白背毛木耳為試驗(yàn)材料，采用液體搖瓶培養(yǎng)法，通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)，以菌絲體生物量為主要指標(biāo)，對(duì)白背毛木耳液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，白背毛木耳適宜的液體培養(yǎng)基配方為200%馬鈴薯、20%葡萄糖、15%酵母粉、01% MgSO4·7H2O、02% KH2PO4；白背毛木耳液體培養(yǎng)適宜的條件：培養(yǎng)溫度為25 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為180 rmin、裝液量為100 mL（250 mL三角瓶）、發(fā)酵終點(diǎn)為4 d。

關(guān)鍵詞：白背毛木耳；液體培養(yǎng)基；發(fā)酵條件；菌絲體鮮質(zhì)量；優(yōu)化

中圖分類號(hào)： S646604+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）21-0149-03

收稿日期：2016-09-28

基金項(xiàng)目：河北省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：16237301D-2-10）。

作者簡(jiǎn)介：劉敏（1985—），女，河北石家莊人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事食藥用真菌研究與開發(fā)工作。E-mail：liumin870115@163com。

白背毛木耳（Auricularia polytricha）隸屬于擔(dān)子菌亞門層菌綱木耳目木耳科木耳屬中的毛木耳種。按照背部絨毛層顏色不同，毛木耳分為白背毛木耳和黃背毛木耳2個(gè)商業(yè)化栽培品種。毛木耳口感脆滑，風(fēng)味獨(dú)特，膠質(zhì)含量豐富，素有“樹上海蜇皮”之美稱。毛木耳營(yíng)養(yǎng)豐富，據(jù)分析，100 g毛木耳干品中含有70～91 g粗蛋白質(zhì)、06～ 12 g粗脂肪、646 ～ 692 g碳水化合物、1 2301～1 3347 kJ 熱量、97～143 g粗纖維、21～42 g灰分、001 mg 胡蘿卜素、009～036 mg硫胺素、704～835 mg抗壞血酸以及17～40 mg尼克酸1]。另外，毛木耳還具有較高的藥用價(jià)值，入藥有益氣強(qiáng)身、活血、止血、止痛之功效2-3]。

毛木耳是一種著名的藥食兼用的蕈菌，在我國(guó)栽培的歷史悠久，是極具商業(yè)開發(fā)價(jià)值的木耳品種之一4]。毛木耳是一種高溫腐生型菌類，易栽培，既可鮮銷又可干售，適合高溫季節(jié)栽培，正好可以彌補(bǔ)夏季蔬菜市場(chǎng)上鮮品菇類供應(yīng)的不足，亦可作為食用菌周年栽培生產(chǎn)的一個(gè)配套品種，是當(dāng)前我國(guó)廣泛栽培的食用菌之一。目前，毛木耳生產(chǎn)過程中大多使用的是固體菌種，與固體菌種相比，液體菌種具有菌齡一致、生長(zhǎng)速度快、生產(chǎn)周期短、接種方便、無季節(jié)性、適宜工廠化生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，因此在食用菌生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景5-6]。

目前有關(guān)毛木耳液體發(fā)酵條件尚未見系統(tǒng)的研究，因此，本研究采用液體搖瓶培養(yǎng)法，以菌絲體鮮質(zhì)量為指標(biāo)，通過碳、氮源單因素試驗(yàn)并結(jié)合L9（34）正交試驗(yàn)方法，對(duì)白背毛木耳液體發(fā)酵過程中的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出白背毛木耳最適宜的液體培養(yǎng)基，旨在為白背毛木耳菌種生產(chǎn)、紫外誘變育種以及液體發(fā)酵活性物質(zhì)提取等方面的研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

111供試菌株

白背毛木耳菌株為川耳1號(hào)，由河北大學(xué)食藥用真菌研究所保藏。

112培養(yǎng)基

（1）PDA培養(yǎng)基：20%馬鈴薯、2%葡萄糖、2%瓊脂，pH值自然。

（2）一級(jí)液體培養(yǎng)基、基礎(chǔ)二級(jí)液體培養(yǎng)基：200%馬鈴薯、20%葡萄糖、10%蛋白胨、01%MgSO4·7H2O、01% KH2PO4。

（3）栽培培養(yǎng)基：84%雜木屑，15%麩皮，1%生石灰。

12試驗(yàn)方法

121JP3]白背毛木耳試管母種擴(kuò)繁

按常規(guī)方法制備PDA培養(yǎng)基后，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后，通過無菌操作進(jìn)行接種，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，待試管中菌絲長(zhǎng)滿，備用。

122一級(jí)液體菌種的制備方法

按常規(guī)方法制備一級(jí)液體培養(yǎng)基，分裝于250 mL三角瓶中，裝液量為100 mL，121 ℃高壓滅菌30 min，待冷卻后，取活化的菌種在無菌條件下進(jìn)行接種，接種后放入恒溫?fù)u床中25 ℃、160 rmin恒溫振蕩培養(yǎng)6 d，制得白背毛木耳一級(jí)液體菌種，備用。

123碳源的選擇

固定其他成分不變，分別用蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉代替基礎(chǔ)二級(jí)液體培養(yǎng)基中的葡萄糖作為培養(yǎng)基的碳源，濃度均為20%，250 mL三角瓶中裝液量為 100 mL，121 ℃滅菌30 min，接種量為10%，放入 25 ℃、160 rmin 搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)6 d，測(cè)定菌絲體鮮質(zhì)量，每個(gè)處理3次重復(fù)。菌絲體鮮質(zhì)量測(cè)定方法7]：以80目銅絲網(wǎng)過濾稱質(zhì)量，鮮質(zhì)量的測(cè)定可以實(shí)時(shí)檢測(cè)菌種的發(fā)酵動(dòng)態(tài)，是較干質(zhì)量測(cè)定更為實(shí)用的快速測(cè)定方法。

124氮源的選擇

固定其他成分不變，分別用麩皮、酵母粉、硫酸銨代替基礎(chǔ)二級(jí)液體培養(yǎng)基中的蛋白胨作為培養(yǎng)基的氮源，濃度均為10%，250 mL三角瓶中裝液量為100 mL，121 ℃ 滅菌30 min，接種量為10%，放入25 ℃、160 rmin搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)6 d，測(cè)定菌絲體鮮質(zhì)量，每個(gè)處理3次重復(fù)。

125碳源、氮源正交試驗(yàn)

以葡萄糖、酵母粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平如表1所示，以菌絲體鮮質(zhì)量為指標(biāo)，共計(jì)9個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。

126溫度的選擇

接種菌種后，將三角瓶分別置于19、22、25、28、31 ℃溫度下160 rmin振蕩培養(yǎng)6 d后，測(cè)定菌絲體鮮質(zhì)量。

127搖床轉(zhuǎn)速的選擇

接種菌種后，搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為160、170、180、190、200、210 rmin，在上述試驗(yàn)選出的最佳溫度下振蕩培養(yǎng)6 d后，測(cè)定菌絲體鮮質(zhì)量。endprint

128裝液量的選擇

配制基礎(chǔ)二級(jí)液體培養(yǎng)基時(shí)分別在 250 mL 三角瓶中裝入70、80、90、100、110、120 mL的培養(yǎng)基，接種菌種后，在上述試驗(yàn)選出的最佳溫度及上述試驗(yàn)最佳搖床轉(zhuǎn)速條件下振蕩培養(yǎng)6 d后，測(cè)定菌絲體鮮質(zhì)量。

129發(fā)酵終點(diǎn)的確定

1291白背毛木耳液體發(fā)酵過程中相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

接種后，將三角瓶置于25 ℃、160 rmin的恒溫?fù)u床中，發(fā)酵開始后每隔24 h取出3瓶測(cè)定菌絲體的鮮質(zhì)量和發(fā)酵液pH值，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1292回接試管法萌發(fā)試驗(yàn)

根據(jù)液體發(fā)酵曲線的情況，試驗(yàn)中從液體發(fā)酵的第4天至第7天，每天上午10：00取樣，取樣后接種到斜面培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，記錄回接試管后菌絲的萌發(fā)時(shí)間。以菌絲體鮮質(zhì)量及回接試管后菌絲萌發(fā)情況作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定白背毛木耳液體發(fā)酵終點(diǎn)。

1210液體菌種應(yīng)用比較

分別將白背毛木耳固體菌種和液體菌種接種于栽培培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中觀察并記錄滿袋時(shí)間、菌絲長(zhǎng)勢(shì)、白背毛木耳的子實(shí)體農(nóng)藝性狀和生物學(xué)效率等（每袋裝干料1 000 g）。

13數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS軟件進(jìn)行處理和分析。

2結(jié)果與分析

21碳源對(duì)白背毛木耳液體菌絲體培養(yǎng)的影響

碳源是食用菌培養(yǎng)基的主要營(yíng)養(yǎng)成分之一，碳素是構(gòu)成食用菌細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳架來源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是食用菌的生命活動(dòng)所需要的能源。相關(guān)研究表明，碳源主要對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和活性生物成分的合成有較大的影響8-9]。由表2可知，白背毛木耳對(duì)4種碳源均有不同程度的利用，以菌絲體鮮質(zhì)量為指標(biāo)來看，其中葡萄糖的利用率最高，可溶性淀粉次之，蔗糖最差。在4種供試的碳源中，發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源為葡萄糖，菌絲體鮮質(zhì)量可達(dá)25432 7 g100 mL，并且與其他3種碳源的菌絲體鮮質(zhì)量差異顯著（P<005），其余3個(gè)碳源（可溶性淀粉、蔗糖和玉米粉）盡管在發(fā)酵后菌絲體鮮質(zhì)量有所不同，但是經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并無顯著性差異。因此，選擇葡萄糖作為白背毛木耳液體發(fā)酵的主要碳源并進(jìn)行后續(xù)的碳源、氮源正交試驗(yàn)。

22氮源對(duì)白背毛木耳液體菌絲體培養(yǎng)的影響

氮源是食用菌細(xì)胞合成蛋白質(zhì)和核酸必不可少的主要原料，一般不供作能量來源，通常分為無機(jī)氮和有機(jī)氮2類。由表3可知，氮源對(duì)白背毛木耳菌絲體生物量的影響有一定的差異。在4種供試氮源中，麩皮和酵母粉的發(fā)酵效果較好，發(fā)酵結(jié)束后菌絲體鮮質(zhì)量較高，并且兩者之間無顯著性差異，因此麩皮和酵母粉均可以作為白背毛木耳液體發(fā)酵時(shí)的氮源來使用。由于酵母粉為氮源時(shí)培養(yǎng)白背毛木耳的結(jié)果略優(yōu)于麩皮，此時(shí)菌絲體鮮質(zhì)量最大，可以達(dá)到31098 6 g100 mL，且考慮到培養(yǎng)基制作過程的簡(jiǎn)便易行，選擇酵母粉作為白背毛木耳液體發(fā)酵的主要氮源并進(jìn)行后續(xù)的碳源、氮源正交試驗(yàn)。

23正交試驗(yàn)分析

正交試驗(yàn)中共有9個(gè)處理，由表4可知，白背毛木耳液體培養(yǎng)中的4個(gè)因素對(duì)菌絲體鮮質(zhì)量的影響表現(xiàn)為B>D>A>C，即酵母粉>KH2PO4>葡萄糖>MgSO4·7H2O。從正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果可知，各因素水平的最優(yōu)理論組合為A1B3C1D2，即10%葡萄糖、15%酵母粉、01% MgSO4·7H2O、02% KH2PO4，此時(shí)菌絲體鮮質(zhì)量最大。而試驗(yàn)處理最優(yōu)結(jié)果卻是A2B3C1D2，即20%葡萄糖、15%酵母粉、01% MgSO4·7H2O、02% KH2PO4，因此須要做驗(yàn)證試驗(yàn)。

由表5可知，在A2B3C1D2組合條件下白背毛木耳的菌絲體鮮質(zhì)量達(dá)43631 0 g100 mL，略優(yōu)于A1B3C1D2組合。因此，確定白背毛木耳最佳液體培養(yǎng)基配方組合為A2B3C1D2，即20%葡萄糖、15%酵母粉、01% MgSO4·7H2O、02% KH2PO4。

24培養(yǎng)溫度對(duì)白背毛木耳液體菌絲體培養(yǎng)的影響

CM（24]由圖1可知，溫度過高或過低均會(huì)影響白背毛木耳的生長(zhǎng)，19～25 ℃時(shí)，隨溫度不斷升高菌絲體鮮質(zhì)量逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，菌絲體鮮質(zhì)量達(dá)到最大值，為 42579 8 g100 mL，高于25 ℃時(shí)菌絲體鮮質(zhì)量略有下降。因此，白背毛木耳液體發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)較為適宜。

25搖床轉(zhuǎn)速對(duì)白背毛木耳液體菌絲體培養(yǎng)的影響

由圖2可知，轉(zhuǎn)速過高或過低均會(huì)影響白背毛木耳的生長(zhǎng)，隨著轉(zhuǎn)速的不斷增加，培養(yǎng)基中溶氧量逐漸增大，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為180 rmin時(shí)，菌絲體鮮質(zhì)量達(dá)到最大值，為 43200 7 g100 mL。因此，白背毛木耳液體發(fā)酵的搖床轉(zhuǎn)速以180 rmin較為適宜。

26裝液量對(duì)白背毛木耳液體菌絲體培養(yǎng)的影響

液體發(fā)酵過程中，裝液量也可以直接影響培養(yǎng)基中的溶氧情況。由圖3可知，當(dāng)250 mL的三角瓶中裝液量為 100 mL 時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后菌絲體鮮質(zhì)量達(dá)到最大值，為 43491 3 g100 mL。因此，在進(jìn)行白背毛木耳液體發(fā)酵時(shí)，裝液量以100 mL（250 mL三角瓶）較為適宜。

FK（W10]TPLM11tif]

27發(fā)酵終點(diǎn)試驗(yàn)結(jié)果

由圖4可知，白背毛木耳在整個(gè)液體發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的pH值變化并不大，在54～67之間，總體趨勢(shì)是先上升后下降，培養(yǎng)3 d時(shí)達(dá)到最大值，為67，培養(yǎng)4～5 d達(dá)到穩(wěn)定，均為65，而后開始下降。生物量方面，發(fā)酵開始后的前 4 d，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲體鮮質(zhì)量呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，此時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4 d后開始菌絲體生物量增長(zhǎng)速度變緩，幾乎趨于穩(wěn)定，6 d后開始有所下降。由表6可知，菌齡為4、5 d的液體菌種在斜面培養(yǎng)基上的萌發(fā)時(shí)間最短。綜合考慮菌絲體生物量、回接試管后菌絲萌發(fā)時(shí)間和成本因素，確定白背毛木耳液體菌種的發(fā)酵終點(diǎn)為 4 d。endprint

28液體菌種的應(yīng)用

由表7結(jié)果可知，白背毛木耳液體菌種接入栽培培養(yǎng)基，其菌絲生長(zhǎng)速度比固體菌種快，滿袋時(shí)間較短，比固體菌種滿袋的時(shí)間少了9 d，可明顯縮短生產(chǎn)周期；耳片的顏色均呈現(xiàn)為CM（25]暗褐色，液體菌種的出耳生物學(xué)效率略高于固體菌種。不同菌種應(yīng)用于栽培后的子實(shí)體情況如圖5所示。另外，在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)采用液體菌種污染率較低，主要是因?yàn)橐后w菌種接種后的萌發(fā)點(diǎn)較多，菌絲生長(zhǎng)速度快于固體菌種，因此，白背毛木耳的液體菌種可用于生產(chǎn)實(shí)踐。

3結(jié)論

通過碳源、氮源的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，最終確定了白背毛木耳適宜的液體培養(yǎng)基配方為200%馬鈴薯、20%葡萄糖、15%酵母粉、01% MgSO4·7H2O、02% KH2PO4。本試驗(yàn)還從起始培養(yǎng)溫度、 搖床轉(zhuǎn)速以及裝液量3個(gè)方面對(duì)白背毛木耳的液體培養(yǎng)條件進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，結(jié)果表明，白背毛木耳液體培養(yǎng)適宜的條件：培養(yǎng)溫度為25 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為180 rmin、CM（213]裝液量為100KG3]mL（250KG3]mL三角瓶）、發(fā)酵終點(diǎn)為4 d。JP3]白背毛木耳液體菌種的發(fā)酵速度明顯快于固體菌種，滿袋時(shí)間較短，從而降低了生產(chǎn)成本，生物學(xué)效率也略優(yōu)于固體菌種，且操作簡(jiǎn)便，具有一定的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，可用于生產(chǎn)實(shí)踐。

參考文獻(xiàn)：

1]ZK（#]張丹，鄭有良 毛木耳（Auricularia polytricha）的研究進(jìn)展J] 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004，17（5）：668-673

2]常明昌 食用菌栽培學(xué)M] 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003：220-221

3]清源 毛木耳的價(jià)值及開發(fā)利用現(xiàn)狀J] 西昌學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，26（1）：29-31

4]黃卓忠，陳麗新，韋仕巖，等 葡萄枝屑栽培毛木耳配方篩選試驗(yàn)J] 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，42（8）：961-963

5]徐思煒，張君勝，周雯 香菇液體菌種培養(yǎng)條件優(yōu)化J] 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（12）：290-292

6]劉敏，白志芳，李媛，等 金福菇液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化J] 河北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，34（4）：410-413，420

7]王謙，閆蕾蕾，王永利，等 金頂側(cè)耳的深層液體培養(yǎng)及相關(guān)檢測(cè)J] 菌物系統(tǒng)，2002，21（1）：102-106

8]Zhong J J，Zhu Q XEffect of initial phosphate concentration on cell growth and ginsenoside saponin production by suspended cultures of Panax notoginsengJ] Applied Biochemistry & Biotechnology，1995，55（3）：241-247

9]Hwang H J，Kim S W，Xu C P，et alProduction and molecular characteristics of four groups of exopolysaccharides from submerged culture of Phellinus gilvusJ] Journal of Applied Microbiology，2003，94（4）：708-719endprint