劉洪巖，趙彥華，孫夢玲，薛暉

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

中華絨螯蟹微孢子蟲研究進(jìn)展

劉洪巖，趙彥華，孫夢玲，薛暉

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

微孢子蟲是專性細(xì)胞內(nèi)寄生的真核生物，有著廣泛的宿主。中華絨螯蟹微孢子蟲可以引起中華絨螯蟹微孢子蟲病，因此而受到重視。本文簡要綜述了中華絨螯蟹微孢子蟲的生物學(xué)特性，檢測方法以及中華絨螯蟹微孢子蟲病的研究現(xiàn)狀，以期為有效防治河蟹微孢子蟲病提供參考。

中華絨螯蟹；微孢子蟲；研究進(jìn)展

微孢子蟲是很大的一個(gè)門類，最開始被認(rèn)為是寄生蟲，直至2002年才重新被劃分到真菌界[1]。目前發(fā)現(xiàn)的小孢子蟲目微孢子蟲有1 200個(gè)，分別屬于150個(gè)種[2]。在中國，對微孢子蟲的研究主要集中在昆蟲宿主，特別是蠶[3－4]和蜜蜂[5－6]。目前發(fā)現(xiàn)，只有少數(shù)幾種微孢子蟲，如 Ameson[7]，Nadelspora[8]和 A－belspora[9]是以螃蟹為宿主的。2002年，王文等[10]通過電鏡觀察，確定了江蘇泗洪的螃蟹中含有微孢子蟲，并且確定了微孢子蟲病發(fā)病的不同時(shí)期的特性以及中華絨螯蟹微孢子蟲肝胰腺寄生的特性。2006年，王文等[11]通過透射電鏡和掃描電鏡進(jìn)一步分辨出了河蟹微孢子蟲與Partrick 2002年提出的河蟹微孢子蟲的不同，從而建立了一個(gè)新的分支。2015年，江蘇省河蟹養(yǎng)殖過程中，肝胰腺的白化病大規(guī)模暴發(fā)，丁正峰[12]從病蟹中檢測到大量微孢子蟲18s rDNA。

1 河蟹微孢子蟲的生物學(xué)特性

1.1 河蟹微孢子蟲的超微結(jié)構(gòu)

河蟹微孢子蟲的形狀為橢圓形，短軸長度為0.8～1.2μm，長軸長度為1.5～1.9μm。孢子壁厚度為130 nm，由低電子密度的孢子內(nèi)壁和高電子密度的孢子外壁組成，孢子內(nèi)壁厚度為100～120 nm，孢子外壁厚度為20～30 nm。河蟹微孢子蟲是單核的，核位于極質(zhì)體和后極泡之間，在細(xì)胞中央的位置，由兩到三層內(nèi)質(zhì)網(wǎng)極管以及極管包圍。在孢子的前端，有一個(gè)鐘形的錨定盤，錨定盤前端有凸起；孢子后端則包含這2～3個(gè)后極泡。河蟹微孢子蟲主要特點(diǎn)是：單核，有一個(gè)極絲，一個(gè)極絲盤復(fù)合物，一個(gè)極質(zhì)體以及后極泡形成發(fā)芽裝置；極管圈數(shù)為7圈。見圖1。

1.2 河蟹微孢子蟲生活史

河蟹微孢子蟲寄生于中華絨螯蟹的肝胰腺細(xì)胞內(nèi)，生活史包括四個(gè)階段：裂殖增殖期，孢子增殖期，孢子原細(xì)胞期和感染期。第一個(gè)時(shí)期是從成熟的孢子細(xì)胞質(zhì)由極管進(jìn)入宿主細(xì)胞開始的。孢原質(zhì)進(jìn)入宿主細(xì)胞以后發(fā)育形成橢圓形的裂殖子。接下來就是裂殖增殖期。這個(gè)階段，裂殖子在宿主細(xì)胞內(nèi)不斷分裂，形成多個(gè)新的裂殖子，并且發(fā)育成為成熟的孢子。這兩個(gè)時(shí)期都是在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的。成熟的孢子由發(fā)芽裝置彈射出，繼續(xù)感染新的細(xì)胞[13]，見圖2。

圖1 微孢子蟲模式圖[11]

1.2.1 裂殖增殖期 這個(gè)時(shí)期從微孢子蟲的原生質(zhì)進(jìn)入宿主細(xì)胞便開始了。原生質(zhì)的細(xì)胞核由單核分裂成為雙核，四核，進(jìn)而形成多核，這時(shí)的細(xì)胞是橢圓形的，具有很大的核區(qū)。隨后，原生質(zhì)的質(zhì)膜內(nèi)陷，把細(xì)胞核包裹起來，形成新的原生質(zhì)。微孢子蟲的原生質(zhì)會進(jìn)行多次這樣的分裂，從而形成多個(gè)原生質(zhì)體。這些原生質(zhì)體開始排列成蓮花形，隨后，分裂成為4個(gè)或者8個(gè)新的原生質(zhì)。這種原生質(zhì)體繼續(xù)發(fā)育，在寄生蟲樣空泡中發(fā)育成為單層膜包圍的原生質(zhì)體。這時(shí)的原生質(zhì)體富含游離的核糖體，細(xì)胞核為均勻的顆粒狀，質(zhì)膜周圍富含線粒體。

1.2.2 孢子發(fā)生期 這一階段是由裂殖體向孢子母細(xì)胞發(fā)育的時(shí)期。孢子母細(xì)胞是成熟的、不再繼續(xù)分裂的孢子。孢子母細(xì)胞是單核的，由多核的原生質(zhì)分裂團(tuán)分裂產(chǎn)生。電子顯微鏡觀察顯示，當(dāng)裂殖體的質(zhì)膜外面有一層致密的高電子層時(shí)，就發(fā)育為成熟的孢子，即孢子母細(xì)胞。孢子母細(xì)胞和裂殖體相比，細(xì)胞質(zhì)的電子密度也有所增加，因?yàn)樵阪咦幽讣?xì)胞中，有大量的核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成。

中華絨螯蟹微孢子蟲之所以成為新的一類，是因?yàn)榕c Endoreticulatus wdelis[14]，E.schuberg[15]，E.bombycis[16-17]and Endoreticulatus sp.Taiwan[18]相比，有著以下三點(diǎn)明顯的不同：①中華絨螯蟹微孢子蟲比較小，（1.0±0.2）μm×（1.7±0.2）μm；②孢子成熟和孢子生殖同時(shí)在宿主的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，這與網(wǎng)蟲屬Ocinaralida是不同的，后者表現(xiàn)出不同發(fā)育階段的寄生蟲空泡[17]；③中華絨螯蟹微孢子蟲的極絲，核膜，細(xì)胞核在早期的孢子發(fā)育階段都是可見的，而這些在Endoreticulatus中則是很難發(fā)現(xiàn)的。

2 河蟹微孢子蟲的檢測方法

目前，河蟹微孢子蟲還沒有被提純出來，現(xiàn)階段的檢測方法主要集中在組織病理切片和分子檢測手段上面。

2.1 河蟹微孢子蟲的組織病理學(xué)切片檢測

HE染色是觀察病理的主要方法，可以直觀的看到微孢子蟲的含量以及對組織的破壞程度。目前主要有馬松三色法和HE染色法兩種[12]。前者可以根據(jù)染料滲入程度分辨不同的粒子，后者則是根據(jù)嗜酸性和嗜堿性來區(qū)分不同粒子的。

2.2 電鏡切片觀察

圖2 河蟹微孢子蟲的生活史[13]

圖3 白化肝胰腺組織化學(xué)切片[21]

成熟的河蟹微孢子蟲主要由孢子壁、孢原質(zhì)、發(fā)芽裝置和孢子細(xì)胞器等組成。孢子壁厚而堅(jiān)硬，由3層結(jié)構(gòu)組成，由外向內(nèi)依次為刺突狀外層孢子外壁、透明薄層孢子內(nèi)壁和纖維性內(nèi)層的原生質(zhì)膜。孢子壁厚度為130 nm，其中，孢子內(nèi)壁厚度為100～120 nm，孢子外壁厚度為20～30 nm。孢原質(zhì)的前部是薄膜層疊成的極膜層，孢原質(zhì)的后部有沿孢子短軸方向稍伸長的孢子。發(fā)芽裝置主要由孢子壁內(nèi)側(cè)螺旋狀盤繞的極管、若干疊成片狀的薄膜層、結(jié)構(gòu)相對松散的極膜層和由多層膜包圍成的后極泡構(gòu)成。孢子細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、極膜層結(jié)構(gòu)、高爾基體和線粒體等細(xì)胞器。河蟹微孢子蟲的成熟孢子大小為（1.7±0.2）μm ×（1.0±0.2）μm，呈橢圓形，極管前端與孢子縱軸呈平行狀，后端沿孢子壁與縱軸形成螺旋狀卷曲，極絲的極管圈數(shù)一般為7～8 圈，見圖 4。

2.3 常規(guī)PCR檢測和熒光PCR檢測

圖4 河蟹微孢子蟲縱軸切面的透射電鏡照片[11]

檢測方法目前采用PCR方法，檢測河蟹微孢子蟲時(shí)，主要針對微孢子蟲16sRNA基因來設(shè)計(jì)特異性引物[19]。丁正峰利用巢式PCR擴(kuò)增出931 bp的片段，經(jīng)比對確認(rèn)為河蟹微孢子蟲18sRNA。

常規(guī)PCR的檢測，對于低濃度的微孢子蟲檢出率不高，經(jīng)過筆者實(shí)驗(yàn)，常規(guī)PCR只能檢測到102以上的微孢子蟲。因此，需要更加靈敏的檢測方法。熒光定量PCR滿足了這一需求。熒光定量PCR的檢出線為101，并且能夠確定微孢子蟲的含量，確定微孢子蟲在河蟹體內(nèi)的分布情況。為微孢子蟲的檢測提供了更加靈敏的方法，也為后續(xù)研究提供了一種新途徑。

2.4 原位雜交

原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過程。丁正峰[16]設(shè)計(jì) 了 兩 對 引 物 W3F （50－CTGTGAGGCTATTGTTGGGC－30）and W3R（50－TACTGTGCTCCCTGTCCATT－30），對白化的肝胰腺進(jìn)行了原位雜交。對比HE染色和直接顯微鏡觀察的結(jié)果，原位雜交能夠更加靈敏地顯示出低濃度的微孢子蟲。

3 螃蟹微孢子蟲病

早 在 1970年 ，Sprague就 指 出 ，Ameson michaelis是引起墨西哥灣，亞特蘭大的海蟹肌肉溶解的病因。這種微孢子蟲存在于海蟹的肌肉中，會使螃蟹的肌肉成為棉花樣，并且失去原有的味道，被稱為“棉花蟹”。Ameson michaelis[3]的傳染性很高，但是并沒有引起“棉花蟹”的大規(guī)模傳播。

1987年，另外一種螃蟹微孢子蟲被發(fā)現(xiàn)。Azevedo發(fā)現(xiàn)的這種寄生在岸蟹肝胰腺中的微孢子蟲叫做Abelspora portucalensis，這種微孢子蟲是單核的，以二分式的裂殖方式繁殖的。每個(gè)微孢子蟲可以裂殖為兩個(gè)，兩個(gè)再分為四個(gè)，這一過程是在微孢子蟲囊膜中進(jìn)行的[9]。1994年，Olson等[8]在太平洋大蟹中發(fā)現(xiàn)了微孢子蟲Nadelspora canceri。2007年，Stentiford G D.在寄生蟹中發(fā)現(xiàn)了微孢子蟲Enterospora[20]。

但是，河蟹微孢子蟲和上述的都不是一種。河蟹微孢子蟲的孢子時(shí)期都是單核的，多核的孢子母細(xì)胞原生質(zhì)體以蓮花形式的分裂方式，分為4個(gè)或者8個(gè)單核孢子，這些孢子在寄生蟲樣的空泡中成熟。這種特征跟內(nèi)網(wǎng)蟲屬比較相似，因此2007年，王文[11]建立了Endoreticulatus eriocheir sp.nov這一分支。2015年，江蘇暴發(fā)了嚴(yán)重的河蟹肝胰腺白化病，丁正峰[12]在發(fā)病的河蟹肝胰腺中，發(fā)現(xiàn)了大量的微孢子蟲，經(jīng)過18sRNA的鑒定，確認(rèn)為Endoreticulatus eriocheir sp.nov.。河蟹微孢子蟲病的主要病癥為肝胰腺白化，水化，進(jìn)而消失，不會引起螃蟹的死亡，但是會嚴(yán)重影響螃蟹的品質(zhì)。

目前，對河蟹微孢子蟲和河蟹肝胰腺白化之間的關(guān)系，爭議頗多。2016年，丁正峰[21]利用18sRNA設(shè)計(jì)引物，對白化的肝胰腺進(jìn)行的原位雜交，在熒光顯微鏡下，可以看到陽性雜交信號。并且文中還指出，原位雜交能發(fā)現(xiàn)組織化學(xué)和普通顯微鏡觀察所不能發(fā)現(xiàn)的，早期的、含量低的河蟹微孢子蟲，見圖5。

4 結(jié)語

河蟹微孢子蟲是一種真核生物，內(nèi)蟲網(wǎng)屬，生活史包括四個(gè)階段：裂殖增殖期，孢子增殖期，孢子原細(xì)胞期和感染期。河蟹微孢子蟲為單核，多核的孢子母細(xì)胞原生質(zhì)經(jīng)過蓮花式的分裂，分裂為4個(gè)或者8個(gè)孢子。

河蟹微孢子蟲病可以引起河蟹肝胰腺的白化，水化，最終肝胰腺消失，給螃蟹養(yǎng)殖也造成了很大的損失。目前，對于該病的研究集中在檢測方法的建立上，現(xiàn)在已經(jīng)能夠成熟地利用PCR和熒光PCR檢測河蟹微孢子蟲的含量，用組織化學(xué)的方法直觀地檢測到微孢子蟲，但是，對于感染途徑等流行病學(xué)調(diào)查還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，也沒有特效藥可以治療。

今后，河蟹微孢子蟲病的研究方向應(yīng)主要集中在傳染途徑的確定以及防治特效藥的研究方面。

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Research progress on the Endoreticulatus eriocheir sp.nov.（Microsporidia，Encephalitozoonidae）

Liu Hongyan，Zhao Yanhua，Sun Mengling，Xue Hui
（Freshwater Fishery Research Institute of Jiangsu Province，Nanjing 210017，China）

Microsporidia are an extremely large and diverse group of microbial eukaryotes and have wide host area.For emerging pathogen in Eriocheir sinensis，more attention had been put in it.In order to provide a reference for controlling microsporidian infection effectively，the structure，detecting technology and progress of studying on the Endoreticulatus eriocheir sp.nov.are reviewed in this paper.

Eriocheir sinensis；microsporidia；research progress

S941.5

A

1004－2091（2017）10－0042－06

10.3969/j.issn.1004－2091.2017.10.009

江蘇省科技計(jì)劃現(xiàn)代農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（BE2016392）

劉洪巖（1986－），女，研究實(shí)習(xí)員，主要從事水產(chǎn)病害研究.E－mail：njsfdxliuhongyan@163.com

薛暉（1968－），男，研究員級高級工程師.E－mail：jsxuehui@163.com

圖5 河蟹白化肝胰腺原位雜交

2016-12-26）