王昊盛 宋鑫金 董文強(qiáng) 吳 斌 陳永霞 盧瑋筱 祁鵬志 郭寶英

(浙江海洋大學(xué) 國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 舟山 316022)

厚殼貽貝(Mytilus coruscus)金屬硫蛋白MT-10:cDNA克隆、結(jié)構(gòu)分析及銅離子脅迫下的表達(dá)*

王昊盛 宋鑫金 董文強(qiáng) 吳 斌 陳永霞 盧瑋筱 祁鵬志①郭寶英

(浙江海洋大學(xué) 國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 舟山 316022)

近年來(lái)我國(guó)沿海海域重金屬污染日趨嚴(yán)重, 軟體動(dòng)物尤其是雙殼貝類(lèi)響應(yīng)重金屬污染脅迫的研究發(fā)展成為目前的研究熱點(diǎn)。金屬硫蛋白是一類(lèi)廣泛存在于生物體內(nèi)富含半胱氨酸(Cys)的小分子蛋白, 具有結(jié)合金屬離子的能力, 能有效調(diào)節(jié)生物體細(xì)胞內(nèi)的金屬離子平衡, 具有清除自由基,重金屬解毒的功能, 關(guān)于厚殼貽貝MT蛋白的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文首次利用RT-PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆了厚殼貽貝 MT-10蛋白 cDNA全長(zhǎng)(Mc-MT-10), 其包含 101bp的 5′ UTR區(qū),108bp的3′UTR區(qū)以及222bp的ORF區(qū), 編碼73個(gè)氨基酸。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)Mc-MT-10富含Cys, 且具有9個(gè)軟體動(dòng)物中常見(jiàn)的CXC結(jié)構(gòu)以及CKCXXXCXCX結(jié)構(gòu), 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中同科或?qū)僦蠱T-10聚合成一個(gè)分支, 顯示出高度保守性。采用Q-PCR技術(shù)分析了MT-10 mRNA在Cu2+脅迫下厚殼貽貝外套膜及消化腺中表達(dá)變化, 結(jié)果表明Mc-MT-10mRNA在Cu2+脅迫下兩種組織中的表達(dá)量急劇升高, 說(shuō)明Cu2+能夠誘導(dǎo)Mc-MT-10mRNA的表達(dá), 并且表現(xiàn)出誘導(dǎo)具有閾值性特點(diǎn)。研究結(jié)果可為深入研究厚殼貽貝MT蛋白的功能奠定基礎(chǔ), 為厚殼貽貝抗重金屬污染新品種選育提供數(shù)據(jù)支持。

厚殼貽貝; 金屬硫蛋白基因; 熒光定量PCR; 銅脅迫

厚殼貽貝(Mytilus coruscus), 屬貽貝目(Mytiloida)、貽貝科(Mytilidae)、貽貝屬(Mytilus), 是海洋雙殼貝類(lèi)中生長(zhǎng)速度最快的種類(lèi)之一。主要分布于我國(guó)黃渤海、東海、臺(tái)灣等地, 在日本北海道、韓國(guó)濟(jì)州島等地也有分布。隨著工業(yè)進(jìn)程的不斷深入,給沿海海域環(huán)境帶來(lái)巨大壓力, 工業(yè)廢水、船舶油污、生活污水等造成的海水污染不斷加劇, 許多重金屬?lài)?yán)重超標(biāo)(郭遠(yuǎn)明等, 2012)。重金屬不易降解, 在食物鏈中不斷富集, 人類(lèi)食用富含重金屬的魚(yú)蝦貝等海產(chǎn)品會(huì)產(chǎn)生中毒現(xiàn)象, 對(duì)健康危害極大(Shuaiet al,2001)。雙殼貝類(lèi)對(duì)重金屬具有較強(qiáng)的生物富集能力,且活動(dòng)性低, 是天然的重金屬污染指示物。其在重金屬脅迫下的變化可間接反映在高濃度金屬離子脅迫下生物機(jī)體內(nèi)的氧化反應(yīng)程度, 是指示環(huán)境污染的重要標(biāo)志(Mooreet al, 2004)。貽貝作為重金屬污染指示物在很多國(guó)家已經(jīng)得到應(yīng)用(Miller, 1999), 相關(guān)基礎(chǔ)研究也逐漸得到重視。但現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外對(duì)貽貝的研究主要集中于翡翠貽貝與紫貽貝, 對(duì)厚殼貽貝的研究主要集中在人工育苗養(yǎng)殖(?？姑赖? 2007), 遺傳特異性(Yeet al, 2012)以及營(yíng)養(yǎng)成分比對(duì)分析(Kimet al, 2012)等方面。本研究旨在填補(bǔ)貽貝屬中厚殼貽貝的作為重金屬污染指示物研究, 為今后對(duì)厚殼貽貝進(jìn)行更加全面深入的科研提供基礎(chǔ)。

金屬硫蛋白(metallothioneins, MT)是一種富含半胱氨酸(Cys)及金屬離子的小分子蛋白。通常含有CC、CXC等結(jié)構(gòu), 因?yàn)榘腚装彼?Cys)能與重金屬離子結(jié)合因而取名金屬硫蛋白, 在一定程度上起到重金屬解毒和自由基清除等修復(fù)作用(劉維青等, 2006)。MT蛋白在生物體內(nèi)的的表達(dá)水平通常也反映了該生物對(duì)重金屬的應(yīng)激及自我修復(fù)能力, 同時(shí)也能作為環(huán)境中重金屬濃度的指示物。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外已經(jīng)出現(xiàn)了許多關(guān)于生物體內(nèi)MT的報(bào)道(Wanget al, 2011), 主要集中于各種魚(yú)類(lèi)(Olssonet al, 1998; Roevaet al,1999)和水生無(wú)脊椎動(dòng)物(Roesijadiet al, 1991), 以及大量的軟體動(dòng)物(Isaniet al, 1997; Langstonet al, 1998)和甲殼動(dòng)物(Roesijadiet al, 1997; Engelet al, 1993;Barka, 2000)。但厚殼貽貝 MT基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò) RACE技術(shù)克隆了厚殼貽貝 MT-10全長(zhǎng)cDNA序列, 通過(guò)銅離子脅迫, 模擬當(dāng)前海洋環(huán)境重金屬污染現(xiàn)狀, 通過(guò)對(duì)厚殼貽貝細(xì)胞內(nèi) MT-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定及分析, 論證厚殼貽貝遭遇重金屬污染之后的應(yīng)激行為及對(duì)重金屬的自我修復(fù)能力, 為厚殼貽貝今后作為海洋環(huán)境中重金屬濃度指示物提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)也為解決當(dāng)前厚殼貽貝養(yǎng)殖業(yè)面對(duì)海洋重金屬污染的困境提供一定建議。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本次實(shí)驗(yàn)所用的厚殼貽貝(Mytilus coruscus)于2016年10月采集于舟山東極青浜島附近海域, 外殼平均長(zhǎng)度為(9.25±0.43)cm, 殼寬(4.51±0.3)cm, 殼高(3.05±0.20)cm, 濕重(60.18±6.45)g。清污后置于藍(lán)色養(yǎng)殖桶內(nèi)暫養(yǎng), 每天換取經(jīng)過(guò)過(guò)濾的海水, 10d之后選擇生命特征明顯的個(gè)體進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 銅離子脅迫 將選擇后的厚殼貽貝隨機(jī)分為兩組, 每組 40只。實(shí)驗(yàn)組海水中加入硫酸銅作為銅離子源, 使 Cu2+終濃度為 20μg/L。每天換水一次,更新一半并在實(shí)驗(yàn)組中添加硫酸銅維持Cu2+濃度。

1.2.2 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 處理后2d、5d、10d、15d、21d、28d進(jìn)行取樣。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取出4個(gè)的厚殼貽貝, 解剖得到外套膜及消化腺存放于–80°C冰箱內(nèi)暫存。采集厚殼貽貝腮、性腺、消化腺、血細(xì)胞、腎臟、肌肉及外套膜組織, 存放于–80°C冰箱內(nèi)暫存。待樣品全部采集完成之后帶回實(shí)驗(yàn)室提取總RNA。RNA提取采用常規(guī)TRIzol RNA提取方法進(jìn)行, RNA提取完成后立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄, 逆轉(zhuǎn)錄步驟參考RevertAidTMFirst StrandcDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及Mc-MT-10全長(zhǎng)cDNA克隆 通過(guò)NCBI查找并下載已知的雙殼貝類(lèi)MT蛋白氨基酸序列并進(jìn)行序列比對(duì), 在保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物MT-F: ATGSCTGCACCTTGTAACTGYATY, MT-R:TCAYTTGCAGGARCANCCAGRTKC, 克隆Mc-MT-10基因部分 cDNA片段, 并送武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物科技有限公司進(jìn)行Race測(cè)序。

1.2.4Mc-MT-10熒光定量分析 逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板稀釋后作為Q-PCR的模板, 以厚殼貽貝β-actin為內(nèi)參, MT-F、MT-R為引物進(jìn)行Q-PCR實(shí)驗(yàn), 分析Mc-MT-10組織表達(dá)譜及銅離子脅迫下的表達(dá)變化。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及分析 運(yùn)用最小二乘法 2–ΔΔCt法(Livaket al, 2001)處理Q-PCR數(shù)據(jù), 以溶解曲線(xiàn)判定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性, 利用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 采用單因子方差分析顯著性差異。通過(guò)Oligin軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并導(dǎo)出柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mc-MT-10基因分析

經(jīng)Race測(cè)序獲得Mc-MT-10基因cDNA全長(zhǎng)序列(圖 1), 注冊(cè)序列號(hào)為 KX987251。該序列全長(zhǎng)為431bp, 包含 101bp的 5′-UTR 區(qū), 108bp的 3′-UTR區(qū),ORF區(qū)全長(zhǎng)為 222bp, 推導(dǎo)其編碼 73個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)其分子量為72.81kDa, 等電點(diǎn)為7.24。其分子式為C274H460N86O101S22, 含 943個(gè)原子。預(yù)測(cè)分子量大小和等電點(diǎn)分別為76.11kDa和9.027, 原子總數(shù)10747,分子式 C3365H5400N950O1005S27, 不穩(wěn)定系數(shù) 44.34。用Clustal W 軟件將Mc-MT-10氨基酸序列與其他物種MT-10序列進(jìn)行比對(duì)(圖2), 發(fā)現(xiàn)19個(gè)保守的Cys, 其中9對(duì)Cys與其相鄰的氨基酸構(gòu)成9個(gè)CXC結(jié)構(gòu)。另外, CKCXXXCXCX結(jié)構(gòu)也是軟體動(dòng)物金屬硫蛋白常見(jiàn)的保守結(jié)構(gòu), 在Mc-MT-10蛋白序列中也發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)類(lèi)似結(jié)構(gòu)域。

圖1 厚殼貽貝MT-10基因cDNA及氨基酸序列Fig.1 The whole sequence of cDNA and deduced amino acid sequence of Mc-MT-10

圖2 MT-10蛋白氨基酸多序列比對(duì)Fig.2 The multiple alignments of amino acid sequences of MT-10s

構(gòu)建了基于Neighbor-joining的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), boot值為5000(圖3)。在進(jìn)化樹(shù)中,Mc-MT-10首先與同屬物種M.galloprovincialis的MT-10聚合在一起, 通過(guò)單序列比對(duì),Mc-MT-10與Mg-MT-10核苷酸相似度為93.15%。而后與同屬或科中的同源物聚合成一個(gè)大的分支, 與脊椎動(dòng)物的相距較遠(yuǎn)。厚殼貽貝MT-10的進(jìn)化地位與厚殼貽貝的生物學(xué)分類(lèi)地位基本一致, 顯示了較強(qiáng)的保守性。

2.2 Mc-MT-10基因組織表達(dá)分析

用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了Mc-MT-10基因在厚殼貽貝腮、肌肉、消化腺、外套膜、血細(xì)胞、性腺和腎臟等組織中的表達(dá)情況, 結(jié)果表明Mc-MT-10基因在各組織中均有表達(dá), 在消化腺中的表達(dá)量最高, 其次為腮、血細(xì)胞和腎臟, 在肌肉、外套膜和性腺中的表達(dá)量最低(圖4)。

2.3 銅離子脅迫下Mc-MT-10基因表達(dá)分析

用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了厚殼貽貝外套膜和消化腺M(fèi)c-MT-10基因在Cu2+脅迫下的表達(dá)情況(圖5, 圖6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 銅離子脅迫下, 外套膜和消化腺M(fèi)c-MT-10基因呈現(xiàn)類(lèi)似的表達(dá)模式。處理 2d時(shí),Mc-MT-10基因表達(dá)量顯著升高, 5d時(shí), 表達(dá)量達(dá)到峰值, 而后逐漸下降, 處理15d時(shí), 消化腺M(fèi)c-MT-10基因表達(dá)量已回落至正常水平, 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(28d),外套膜Mc-MT-10基因表達(dá)量回落至接近正常水平。但兩種組織Mc-MT-10基因表達(dá)量變化并不完全相同,外套膜中Mc-MT-10基因表達(dá)量變化顯著高于消化腺。

3 討論

金屬硫蛋白一類(lèi)廣泛存在于生物界的低分子量蛋白, 富含半胱氨酸, 由于Cys巰基能共價(jià)結(jié)合金屬離子, 是金屬結(jié)合位點(diǎn), 因此其對(duì)多種重金屬, 如銅、鎘及鋅具有高度親和性, 可參與生物體中對(duì)金屬元素的解毒過(guò)程(Coyleet al, 2002)。本研究中, 厚殼貽貝MT-10蛋白含有19個(gè)Cys殘基, 含量達(dá)26.0%,顯示其發(fā)達(dá)的金屬結(jié)合能力, 這與在其他軟體動(dòng)物的報(bào)道相一致(Engelkenet al, 1999; 呂達(dá)等, 2012)。CXC結(jié)構(gòu)是軟體動(dòng)物MT蛋白的顯著特征, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)厚殼貽貝MT-10蛋白含有9個(gè)CXC結(jié)構(gòu), 經(jīng)序列比對(duì), 發(fā)現(xiàn)此類(lèi) CXC結(jié)構(gòu)在軟體動(dòng)物 MT蛋白中的高度保守。有研究認(rèn)為, 軟體動(dòng)物MT蛋白還存在保守的CKCXXXCXCX結(jié)構(gòu)(Imagawaet al, 1990), 本研究發(fā)現(xiàn)厚殼貽貝 MT-10蛋白也存在一個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)域, 同大部分軟體動(dòng)物的發(fā)現(xiàn)相一致, 但在海灣扇貝(Argopecten irradians)MT蛋白中卻存在兩個(gè)類(lèi)似結(jié)構(gòu), 而且其包含145個(gè)氨基酸, Cys含量高達(dá)27.6, 顯示了更強(qiáng)的重金屬結(jié)合能力, 可能是兩物種進(jìn)化過(guò)程所處環(huán)境差異造成的,A.irradians在進(jìn)化過(guò)程中所面對(duì)的重金屬環(huán)境壓力更大(劉維青等, 2006)?；贜eighbor-joining的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明厚殼貽貝 MT-10的進(jìn)化地位與厚殼貽貝的生物學(xué)分類(lèi)地位基本一致,顯示了較強(qiáng)的保守性。

圖3 基于Neighbor Joining的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 The phylogenetic tree constructed based on Neighbor Joining method

厚殼貽貝MT-10的組織表達(dá)譜表明, MT-10在各組織中是廣泛存在的, 顯示其廣泛參與各類(lèi)生命活動(dòng)。而在消化腺以及腮、血細(xì)胞和腎臟中的表達(dá)量較高, 在軟體動(dòng)物中此類(lèi)組織均為重要的免疫組織, 參與對(duì)外界刺激的應(yīng)急、防御及免疫調(diào)控等, 進(jìn)一步表明MT-10蛋白在厚殼貽貝中發(fā)揮重要的防御作用。

一些學(xué)者認(rèn)為, 生物體內(nèi)MT蛋白響應(yīng)重金屬脅迫呈現(xiàn)倒“U”型模式(Hermeszet al, 2001; Chanet al,2004; Wuet al, 2006), MT蛋白適應(yīng)重金屬脅迫有一個(gè)劑量閾值, 即當(dāng)重金屬達(dá)到某一濃度時(shí), 金屬硫蛋白會(huì)隨重金屬劑量增加而上升, 一旦超出該濃度閾值, 重金屬就會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生不可逆的毒性, 金屬硫蛋白水平就會(huì)隨重金屬水平增加而降低。本研究發(fā)現(xiàn),隨著處理時(shí)間的不斷延長(zhǎng), MT-10蛋白的表達(dá)量逐漸升高, 到達(dá)峰值后逐步回落。在組織細(xì)胞吸收的銅離子劑量不斷增加的情況下, 確實(shí)出現(xiàn)了典型的倒“U”型模式。研究結(jié)果表明, 在20μg/L銅離子脅迫下, 厚殼貽貝細(xì)胞內(nèi)銅離子濃度閾值出現(xiàn)的時(shí)間在 5d, 5d后MT-10蛋白的表達(dá)量就逐漸下降, 15d后其表達(dá)量回落至正常水平。

圖4 厚殼貽貝MT-10 mRNA組織表達(dá)譜Fig.4 The tissues distributions of MT-10 mRNA in M.coruscus

圖5 銅離子脅迫下厚殼貽貝外套膜組織MT-10 mRNA表達(dá)變化Fig.5 The expression analysis of MT-10 mRNA in mantle of M.coruscus under Cu2+ stress

圖6 銅離子脅迫下厚殼貽貝消化腺組織MT-10 mRNA表達(dá)變化Fig.6 The expression analysis of MT-10 mRNA in digestive glands of M.coruscus under Cu2+ stress

4 結(jié)論

厚殼貽貝作為一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋雙殼貝類(lèi), 其作為環(huán)境指示生物的作用近年來(lái)也逐漸引起人們重視。本研究首次克隆了厚殼貽貝 MT-10蛋白全長(zhǎng)cDNA序列, 分析其結(jié)構(gòu)特征, 并對(duì)其響應(yīng)重金屬脅迫的 mRNA表達(dá)變化進(jìn)行了初步研究。研究結(jié)果可為深入研究厚殼貽貝 MT蛋白的功能奠定基礎(chǔ), 為厚殼貽貝抗重金屬污染新品種選育提供數(shù)據(jù)支持, 為降低貽貝養(yǎng)殖業(yè)風(fēng)險(xiǎn)提供了重要依據(jù)。

劉維青, 倪多嬌, 宋林生等, 2006.海灣扇貝(Argopecten irradians)金屬硫蛋白基因的克隆與分析.海洋與湖沼,37(5): 444—449

呂 達(dá), 羅凱婭, 潘寶平等, 2012.青蛤(Cyclina sinensis)金屬硫蛋白及硫氧還蛋白基因的克隆與表達(dá)分析.海洋與湖沼, 43(1): 47—51

郭遠(yuǎn)明, 劉 琴, 顧 捷等, 2012.4種海洋貝類(lèi)對(duì)海水中銅(Cu)的富集能力.水產(chǎn)學(xué)報(bào), 36(5): 708—713

?？姑? 吳劍鋒, 2007.厚殼貽貝人工繁殖技術(shù)的研究.南方水產(chǎn), 3(3): 26—30

Barka S, 2000.Processus de détoxication et localisation tissulaire des métaux traces (cuivre, zinc, nickel, cadmium, argent et mercure) chez un crustacé marinTigriopus brevicornis(Müller).Etude du biomarqueur “protéines type métallothionéines”, de la bioaccumulation des métaux et des conséquences sur le transfert trophique.Paris: Université de Paris

Chan P C, Shiu C K M, Wong F W Yet al, 2004.Common carp metallothionein-1 gene: cDNA cloning, gene structure and expression studies.Biochimica et Biophysica Acta-Gene Structure and Expression, 1676(2): 162—171

Coyle P, Philcox J C, Carey L Cet al.2002.Metallothionein: The multipurpose protein.Cellular and Molecular Life Sciences,59(4): 627—647

Engel D W, Brouwer M, 1993.Crustaceans as models for metal metabolism: I.Effects of the molt cycle on blue crab metal metabolism and metallothionein.Marine Environmental Research, 35(1—2): 1—5

Engelken J, Hildebrandt A, 1999.cDNA cloning and cadmium-induced expression of metallothionein mRNA in the zebra musselDreissena polymorpha.Biochemistry and Cell Biology, 77(3): 237—241

Hermesz E, ábrahám M, Nemcsók J, 2001.Tissue-specific expression of two metallothionein genes in common carp during cadmium exposure and temperature shock.Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology & Pharmacology, 128(3): 457—465

Imagawa M, Onozawa T, Okumura Ket al, 1990.Characterization of metallothionein cDNAs induced by cadmium in the nematodeCaenorhabditis elegans.Biochemical Journal, 268(1): 237—240

Isani G, Serra R, Cattani Oet al, 1997.Adenylate energy charge and metallothionein as stress indices inMytilus galloprovincialisexposed to cadmium and anoxia.Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom,77(4): 1187—1197

Kim E K, Joung H J, Kim Y Set al, 2012.Purification of a novel anticancer peptide from enzymatic hydrolysate ofMytilus coruscus.Journal of Microbiology and Biotechnology,22(10): 1381—1387

Langston W J, Bebianno M J, Burt G R, 1998.Metal handling strategies in molluscs.In: Langston W J, Bebianno M J eds.Metal Metabolism in Aquatic Environments.Dordrecht:Springer, 219—283

Livak K J, Schmittgen T D, 2001.Analysis of relative gene expression data using Real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod.Methods, 25(4): 402—408

Miller B S, 1999.Mussels as biomonitors of point and diffuse sources of trace metals in the clyde sea area, Scotland.Water Science and Technology, 39(12): 233—240

Moore M N, Depledge M H, Readman J Wet al, 2004.An integrated biomarker-based strategy for ecotoxicological evaluation of risk in environmental management.Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 552(1—2): 247—268

Olsson P E, Kling P, Hogstrand C, 1998.Mechanisms of heavy metal accumulation and toxicity in fish.In: Langston W J,Bebianno M J eds.Metal Metabolism in Aquatic Environments.Dordrecht: Springer, 321—350

Roesijadi G, Fowler B A, 1991.Purification of invertebrate metallothioneins.Methods in Enzymology, 205: 263—273

Roesijadi G, Brubacher L L, Unger M Eet al, 1997.Metallothionein mRNA induction and generation of reactive oxygen species in molluscan hemocytes exposed to cadmium in vitro.Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Pharmacology, Toxicology and Endocrinology, 118(2):171—176

Roeva N N, Sidorov A V, Yurovitskii Y G, 1999.Metallothioneins,proteins binding heavy metals in fish.Biology Bulletin, 26(6):617—622

Shuai J S, Wang L, 2001.Discussion about the health impact of heavy metal and the countermeasure.Environment and Exploitation, 16(4): 62

Wang Q, Ning X X, Chen L Let al, 2011.Responses of thioredoxin1 and thioredoxin-related protein 14 mRNAs to cadmium and copper stresses inVenerupis philippinarum.Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology & Pharmacology, 154(3): 154—160

Wu S M, Jong K J, Lee Y J, 2006.Relationships among metallothionein, cadmium accumulation, and cadmium tolerance in three species of fish.Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 76(4): 595—600

Ye Y Y, Li J, Wu C Wet al, 2012.Genetic analysis of mussel(Mytilus coruscus) populations on the coast of East China Sea revealed by ISSR-PCR markers.Biochemical Systematics and Ecology, 45: 1—6

THE CDNA CLONING AND CHARACTERIZATION OFMYTILUS CORUSCUSMETALLOTHIONEIN 10 AS WELL AS ITS MRNA EXPRESSION UNDER THE CU2+STRESS

WANG Hao-Sheng, SONG Xin-Jin, DONG Wen-Qiang, WU Bin,CHEN Yong-Xia, LU Wei-Xiao, QI Peng-Zhi, GUO Bao-Ying
(Zhejiang Ocean University,National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture,Zhoushan316022,China)

In this paper, a 413bp full-length cDNA sequence of metallothionein 10 from thick shell mussel was obtained with RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends (RACE) technique (so called ‘Mc-MT-10’ thereafter).It consists of a 101bp 5′untranslated region (UTR), an 222bp open reading frame (ORF) and a 108bp 3′UTR.The translated protein is composed of 73 amino acids.The multiple alignments showed the abundant Cys residues, 9 conserved CXC domains and one CKCXXXCXCX domain, in addition, theMc-MT-10cluster into one branch with the counterparts from congeneric species in the phylogenetic tree, suggesting the high evolutionary conservation.The Q-PCR assays were employed to assess the relative expressive changes ofMc-MT-10mRNA in mantle and digestive gland under the stress of copper ions.The results showed that the expression levels ofMc-MT-10mRNA rose sharply under the stress of Cu2+,implying that theMc-MT-10could involve in the regulation of thick hell mussel against Cu2+stress.

Mytilus coruscus; metallothionein; Real-time fluorescence quantitative PCR; Cu2+stress

Q789; Q955

10.11693/hyhz20170300056

*浙江省公益項(xiàng)目, 2017C32009號(hào); 浙江海洋大學(xué)科研啟動(dòng)資金項(xiàng)目, 21105013615號(hào)。王昊盛, E-mail: wanghaosheng1234@163.com

① 通訊作者: 祁鵬志, 博士, 助理研究員, E-mail: qpz2004@sina.com

2017-03-15, 收修改稿日期: 2017-04-03