葉盛 夏武杰 張新民 陳鵬

葉酸對(duì)阿霉素所致心肌損傷的保護(hù)作用研究

葉盛 夏武杰 張新民 陳鵬

目的 探討葉酸對(duì)阿霉素所致心肌損傷的保護(hù)作用。方法 將24只小鼠隨機(jī)分成4組：對(duì)照組，葉酸組，阿霉素組，阿霉素+葉酸組，每組6只。阿霉素組：采用腹腔內(nèi)注射阿霉素（每次2.5mg/kg，每周3次，共6次，總量15mg/kg），建立小鼠阿霉素心臟毒性模型，常規(guī)喂養(yǎng)4周；葉酸組：以等量0.9%氯化鈉溶液代替阿霉素作腹腔內(nèi)注射，并給予葉酸灌胃[10mg/（kg·d），共4周]；阿霉素+葉酸組：按上兩組方法和劑量給予阿霉素和葉酸。對(duì)照組：以等量0.9%氯化鈉溶液代替阿霉素做腹腔內(nèi)注射，常規(guī)喂養(yǎng)4周。4周后B超測(cè)定小鼠心臟功能，TUNEL法測(cè)定小鼠心肌細(xì)胞凋亡率，并利用Western blot法分析凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果 阿霉素組各項(xiàng)心功能指標(biāo)、心肌細(xì)胞凋亡率、Bax/Bcl-2比值與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）；而阿霉素+葉酸組各項(xiàng)心功能指標(biāo)、心肌細(xì)胞凋亡率、Bax/Bcl-2比值與阿霉素組比較均有明顯改善（均P＜0.05）。結(jié)論 葉酸對(duì)小鼠阿霉素心肌損傷有明顯的保護(hù)作用。

阿霉素 葉酸 心臟毒性

腫瘤化療藥物的發(fā)展盡管已經(jīng)顯著改變了許多惡性腫瘤的進(jìn)程，但卻可能導(dǎo)致心血管、血栓或代謝方面的并發(fā)癥[1]。阿霉素是一種傳統(tǒng)、有效、廣泛應(yīng)用于治療實(shí)體腫瘤或者血液系統(tǒng)疾病的化療藥物,其具有一定的心臟毒性，可引起一系列的心臟損害癥狀，導(dǎo)致患者預(yù)后不良，再住院率及病死率升高。阿霉素的心臟毒性可導(dǎo)致心肌病變，因而使其使用劑量和療程收到限制。葉酸具有間接抗氧化、降低活性氧物質(zhì)生成、穩(wěn)定DNA、抗心肌細(xì)胞凋亡及改善線粒體功能的作用，而這些作用正是對(duì)抗阿霉素心臟毒性的可能作用機(jī)制[2-9]。對(duì)此我們進(jìn)一步開(kāi)展了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以探討葉酸對(duì)阿霉素所致心肌損傷的保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠24只，均為雄性，體重22~26g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，所作研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 阿霉素由深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司提供；葉酸由天津力生制藥有限公司提供；TUNEL試劑盒購(gòu)自瑞士Roche Molecular Biochemicals公司；Bax、Bcl-2、GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司。

1.3 分組和方法 24只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組，每組6只。阿霉素組：采用腹腔內(nèi)注射阿霉素（每次2.5mg/kg，每周 3次，共 6次，總量 15mg/kg），建立小鼠阿霉素心臟毒性模型，常規(guī)喂養(yǎng)4周；葉酸組：以等量0.9%氯化鈉溶液代替阿霉素作腹腔內(nèi)注射，并給予葉酸灌胃[10mg/（kg·d），共4周]；阿霉素+葉酸組：按上兩組方法和劑量給予阿霉素和葉酸。對(duì)照組：以等量0.9%氯化鈉溶液代替阿霉素作腹腔內(nèi)注射，常規(guī)喂養(yǎng)4周。

1.4 心臟超聲檢測(cè)各組小鼠心功能情況 4周后小鼠稱(chēng)重，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定，充分暴露前胸部，用8%硫化鈉脫去前胸部的毛。測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）和左室舒張末期容積（LVEDV），并計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左室短軸縮短率（LVFS）。所有檢測(cè)指標(biāo)取3個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期的平均值，測(cè)量工作均由有經(jīng)驗(yàn)的超聲科醫(yī)師在同一彩超儀上完成。

1.5 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)，取各組小鼠左心室心肌組織作石蠟切片，依次予以脫水、染色，利用寡核苷酸末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記凋亡的心肌細(xì)胞，最后熒光顯微鏡下觀察陽(yáng)性心肌細(xì)胞并計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡百分率（每張切片選取10個(gè)不重復(fù)視野（×100倍），細(xì)胞核呈綠色熒光為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)的比值）。

1.6 Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 4周后取小鼠左心室心肌組織液氮碾磨，加入裂解液，勻漿離心后取上清液以BCA法測(cè)定蛋白濃度。取各組蛋白60μg，以10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 37℃封閉1h，加入一抗 Bax、Bcl-2（1∶1 000）多克隆抗體，以 GAPDH 作為內(nèi)參照標(biāo)化Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)。4℃冰箱孵育過(guò)夜，TBST 洗滌 3次，加入二抗（HRP標(biāo)記 IgG，1∶1 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL發(fā)光法顯色，曝光、顯影、定影。膠片掃描后用Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

圖1 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡的比較（TUNEL染色法）

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，測(cè)得計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 周后各組小鼠心功能的比較 見(jiàn)表1。

表1 4周后各組小鼠心功能的比較

由表1可見(jiàn)，阿霉素組LVEDD、LVEDV較對(duì)照組明顯升高，而LVEF、LVFS較對(duì)照組明顯降低（均P＜0.05）；而阿霉素+葉酸組各項(xiàng)心功能指標(biāo)與阿霉素組比較均有明顯改善（均P＜0.05）。2.2 葉酸對(duì)阿霉素致小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色顯示，對(duì)照組及葉酸組中未見(jiàn)凋亡心肌細(xì)胞，阿霉素組可見(jiàn)大量凋亡心肌細(xì)胞（綠色熒光），阿霉素+葉酸組可見(jiàn)少量凋亡心肌細(xì)胞，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比，阿霉素組心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），而阿霉素+葉酸組心肌細(xì)胞凋亡率與阿霉素組比較有明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖 2。

圖2 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率的比較（注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與阿霉素組比較，△P＜0.05）

2.3 葉酸對(duì)阿霉素致小鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Bax、Bcl-2各組之間的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖3。各組組間比較顯示，阿霉素組凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2比

圖3 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較（電泳圖）

3 討論

對(duì)于阿霉素所致的心臟毒性及其機(jī)制的研究已持續(xù)了數(shù)十年。盡管近年來(lái)有許多不同的研究結(jié)果均顯示阿霉素可導(dǎo)致不同程度的心臟損害，但是其潛在機(jī)制卻尚未明確。阿霉素所致心臟毒性在患者治療惡性腫瘤的同時(shí)卻又帶來(lái)了心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)，增加病死率及再住院率，嚴(yán)重影響腫瘤患者的預(yù)后，也同時(shí)限制了阿霉素作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用。

如果能夠在化療初始或早期階段針對(duì)阿霉素所致心臟毒性進(jìn)行干預(yù)，減少自由基及線粒體損傷，降低心肌細(xì)胞凋亡，那么將為廣大腫瘤患者帶來(lái)福音。目前已有多種藥物被證實(shí)可用于治療阿霉素所致的心臟毒性，如抗氧化劑H2S[10]。另外，細(xì)胞因子促紅細(xì)胞生成素及集落刺激因子可以拮抗阿霉素導(dǎo)致的心肌細(xì)胞MHC、Troponin I和Desmin 3種蛋白表達(dá)的下降，減少炎癥介質(zhì)如CD45的表達(dá)，從而減輕阿霉素所致的心肌細(xì)胞萎縮和心肌纖維化，顯著增強(qiáng)阿霉素所致心肌損傷小鼠的左心室收縮功能，發(fā)揮顯著的保護(hù)作用[11-12]。臨床應(yīng)用廣泛的卡維地洛是一種腎上腺素受體阻斷藥，目前發(fā)現(xiàn)其兼有抗氧化活性，能阻止阿霉素誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡，對(duì)阿霉素所致的心肌損傷發(fā)揮顯著的保護(hù)作用[13]，然而卡維地洛作為一種β受體阻滯劑，若應(yīng)用于本身無(wú)心血管疾病的腫瘤患者卻可能帶來(lái)低血壓、心率減慢等不良反應(yīng)。因此我們亟需發(fā)現(xiàn)一種臨床應(yīng)用廣泛，對(duì)腫瘤患者的血流動(dòng)力學(xué)影響小，經(jīng)濟(jì)費(fèi)用低的藥物來(lái)抑制阿霉素引起的心臟毒性。

近年研究表明，葉酸的缺乏與心血管疾病的發(fā)生存在著密切的關(guān)系。其在治療心血管疾病的機(jī)制可能源于其使同型半胱氨酸向蛋氨酸轉(zhuǎn)化有關(guān)[14]。當(dāng)葉酸攝入不足或者代謝通路受干擾的時(shí)候,可影響細(xì)胞DNA正常值較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）；而而阿霉素+葉酸組凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2的比值較阿霉素組明顯下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖 4。合成，也可使得體內(nèi)同型半胱氨酸水平升高。多項(xiàng)研究表明，葉酸具有間接抗氧化、降低活性氧物質(zhì)生成、穩(wěn)定DNA、抗心肌細(xì)胞凋亡及改善線粒體功能的作用。

圖4 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2比值的比較（注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與阿霉素組比較，△P＜0.05）

本研究結(jié)果顯示，葉酸能抑制阿霉素所致的心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白BAX/BCL-2的表達(dá)，改善小鼠心臟功能，對(duì)阿霉素所致的心臟損傷具有顯著地保護(hù)作用；且葉酸臨床容易獲得，價(jià)格低廉，藥物不良反應(yīng)小，值得在臨床上推廣使用，但其對(duì)使用阿霉素治療腫瘤患者的心功能有何影響，尚需進(jìn)一步研究。

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Folic acid protects against doxorubicin-induced cardiotoxicity

YE Sheng，XIA Wujie，ZHANG Xinming，et al.Department of Cardiology,the Second Affiliated Hospital and Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China

Objective To investigate the protective effects of folic acid(FA)in the pathogenesis of doxorubicin(DOX)-induced cardiotoxicity. Methods Twenty four mice were randomly divided into 4 groups:control group,folic acid group,doxorubicin group and doxorubicin+folic acid group with 6 mice in each group.Mice in doxorubicin group

doxorubicin(2.5 mg/kg,i.p,3/wk for 2 wks,);mice in folic acid group received FA 10 mg/d by gavage for 4 wks;mice in doxorubicin+folic acid group received FA10 mg/d by gavage from the day of DOX administration for 4 wks;mice in control group received injections of saline.After 4 weeks,left ventricular(LV)function was measured by echocardiography,cardiomyocyte apoptosis were assessed by TUNEL staining;the expression of bax/bcl-2 was detected by Western blot. Results Doxorubicin induced left ventricular dysfunction and remolding(P＜0.05),increased cardiomyocyte apoptosis(P＜0.05),and up-regulated of bax/bcl-2 levels(P＜0.05).FA ameliorated DOX-induced left ventricular dysfunction and remolding(P＜0.05),attenuated cardiomyocyte apoptosis(P＜0.05),and down-regulated bax/bcl-2 expression(P＜0.05). Conclusion Folic acid has a protective effect against DOX-induced cardiotoxicity in mice.

doxorubicin(DOX) folic acid(FA) cardiotoxicity

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.22.2017-2010

325027 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、溫州醫(yī)科大學(xué)育英兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科

葉盛，E-mail：YVLX88227737@163.com

2017-08-22）（本文編輯：沈昱平）