茍小蘭，蘇艷秋,3，黃 丹，李駿程，吳立鋒，羅國強(qiáng)

( 1．通威股份有限公司，四川 成都 610041； 2. 成都通威水產(chǎn)科技有限公司，四川 成都 610081； 3.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610065 )

生態(tài)調(diào)控技術(shù)對異育銀鯽養(yǎng)殖池底泥菌群多樣性的影響

茍小蘭1,2，蘇艷秋1,2,3，黃 丹1,2，李駿程1,2，吳立鋒1,2，羅國強(qiáng)1,2

( 1．通威股份有限公司，四川 成都 610041； 2. 成都通威水產(chǎn)科技有限公司，四川 成都 610081； 3.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610065 )

為探討菌藻調(diào)控技術(shù)、底質(zhì)改良技術(shù)及投餌區(qū)微孔增氧技術(shù)對異育銀鯽養(yǎng)殖池塘底泥微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響，在江蘇大豐地區(qū)選擇3口總面積約42.93 hm2的異育銀鯽精養(yǎng)池塘實(shí)施以上技術(shù)，同時兩口總面積約30 hm2的池塘作為對照池，采用PCR-DGGE方法比較分析4—7月池塘底泥中的細(xì)菌多樣性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)塘底泥細(xì)菌多樣性指數(shù)為3.15～3.52，明顯高于對照塘的2.20～2.74，表明了三大技術(shù)的實(shí)施有利于提高底泥中細(xì)菌多樣性指數(shù)，同時底泥菌群多樣性指數(shù)的平均值與異育銀鯽的損失率呈正相關(guān)，一定程度上反應(yīng)了三大技術(shù)的聯(lián)用有利于提高精養(yǎng)池塘生態(tài)穩(wěn)定能力，間接增加養(yǎng)殖效益。

菌藻調(diào)控技術(shù)；底質(zhì)改良技術(shù)；微孔增氧技術(shù)；異育銀鯽；菌群多樣性

自2012年春季，由鯉科皰疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpes virus Ⅱ，CyHV-2)引起的異育銀鯽病毒性鰓出血病在江蘇鹽城地區(qū)爆發(fā)以來，已造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。Wang等[3]分析了鯉魚皰疹病毒Ⅱ型感染異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)的病例，發(fā)現(xiàn)其死亡率極高，部分池塘高達(dá)100%。由于是新發(fā)現(xiàn)的病毒性病害，目前尚未篩選出有效的治療藥物和疫苗[4]。有報道指出，防控這種病毒性疾病的出發(fā)點(diǎn)在于建設(shè)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的生態(tài)屏障，即通過底質(zhì)改良、均衡增氧及菌藻調(diào)控等技術(shù)改善養(yǎng)殖環(huán)境、維持養(yǎng)殖環(huán)境生態(tài)穩(wěn)定，減少或避免養(yǎng)殖魚類的應(yīng)激性刺激，然后再定時給予機(jī)體免疫增強(qiáng)劑，增強(qiáng)異育銀鯽自身免疫力，使魚體的免疫機(jī)能在與病毒搏擊過程中處于優(yōu)勢地位[5]。

為減緩或控制異育銀鯽鯉科皰疹病毒Ⅱ型病毒病的進(jìn)一步擴(kuò)大，通威股份有限公司在江蘇異育銀鯽主養(yǎng)區(qū)采取了一系列生態(tài)屏障建設(shè)工作，包括菌藻調(diào)控、底質(zhì)改良、均衡增氧、底排污等生態(tài)調(diào)控技術(shù)，取得了良好效果。筆者采用PCR-DGGE比較分析江蘇大豐市異育銀鯽養(yǎng)殖生態(tài)屏障建設(shè)試驗(yàn)塘和對照塘底泥的微生物多樣性，探討生態(tài)調(diào)控技術(shù)對異育銀鯽養(yǎng)殖池塘底泥細(xì)菌多樣性的影響，為防控異育銀鯽鯉科皰疹病毒Ⅱ型出血病提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2015年4—7月在江蘇大豐斗龍港區(qū)異育銀鯽精養(yǎng)池塘進(jìn)行。選取5口土質(zhì)魚塘，池塘水面積約為30～43 hm2，水深1.6～1.7 m。將5口池塘隨機(jī)分為試驗(yàn)組(3個)與對照組(2個)。試驗(yàn)組在養(yǎng)殖期間實(shí)施通威菌藻調(diào)控、底質(zhì)改良及微孔增氧三大技術(shù)，對應(yīng)產(chǎn)品分別為通威調(diào)水寶1號，通威活水寶1號、通威底改Ⅰ號及微孔增氧盤。試驗(yàn)組分別為A(面積14.67 hm2，放魚量約為36.6萬尾)、B(面積14.87 hm2，放魚量約47.20萬尾)、C(面積12.73 hm2，放魚量約42.84萬尾)；對照組按正常的養(yǎng)殖管理進(jìn)行，分別為D(面積14.67 hm2，放魚量約為37.85萬尾)、E(面積15.33 hm2，放魚量約為40.03萬尾)。試驗(yàn)所用養(yǎng)殖動物均為健康的異育銀鯽幼苗，體質(zhì)量約50 g/尾，隨機(jī)分配至各試驗(yàn)池塘中。

1.2 產(chǎn)品使用方法

1.2.1 通威光合菌的使用

通威光合菌(商品名通威調(diào)水寶1號)在池塘完成所有化學(xué)消毒處理3～4 d后使用，按照14.9～22.4 kg/(hm2·m)直接潑灑，水質(zhì)較差時則按22.4～37.3 kg/(hm2·m)潑灑，每隔10～15 d使用1次，使用時注意觀察水色及浮游動、植物生物量，最佳使用時間為晴天上午。

1.2.2 通威乳酸菌的使用

通威乳酸菌(商品名通威活水寶1號)在池塘完成所有化學(xué)消毒處理3～4 d后使用，將產(chǎn)品直接使用池塘水稀釋100倍后按照14.9 kg/(hm2·m)直接潑灑全池，養(yǎng)殖中、后期酌情加大用量，每隔10～15 d使用一次，使用時注意觀察水色及浮游動、植物生物量，最佳使用時間為10:00至16:00。當(dāng)遇到養(yǎng)殖動物攝食不好，可按照20 mL/kg直接拌服飼料，以緩解養(yǎng)殖動物攝食不好的癥狀。

1.2.3 通威底改產(chǎn)品的使用

通威底改產(chǎn)品(商品名通威底改Ⅰ號)在下雨或倒藻前后使用，按照2985～3731 g/(hm2·m)均勻拋撒池底，當(dāng)出現(xiàn)底質(zhì)嚴(yán)重惡化如發(fā)黑、發(fā)臭、底熱等現(xiàn)象可根據(jù)情況加量、連續(xù)或隔天使用。

1.2.4 通威微孔增氧的使用

在投餌區(qū)域安置微孔增氧設(shè)施，增氧盤按照養(yǎng)殖實(shí)際情況設(shè)置在直徑約20～30 cm，在投料前0.5 h至投料后0.5 h開啟，增加水體中溶解氧，緩解因魚群聚集搶食造成的缺氧。

1.3 樣品采集

底泥樣品來源于江蘇大豐縣斗龍港，生態(tài)調(diào)控技術(shù)試驗(yàn)塘泥樣編號為8#～18#，分別為試驗(yàn)組A、B、C池塘4—7月期間底泥樣品；對照組泥樣編號為1#～7#，分別為對照組D、E池塘4—7月底泥樣品，每月固定于約20 d取樣1次，取樣位置為料臺底部5 cm深處泥樣，取3個不同的點(diǎn)泥樣混合均勻，于-20 ℃保藏，并運(yùn)送至成都通威科技水產(chǎn)有限公司微生物工程研究室。

1.4 樣品總DNA提取

樣本基因組提取稱取約0.6 g樣品，采用Soil DNA kit提取微生物總DNA。操作步驟參考試劑盒使用說明書。

1.5 變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)分析

采用細(xì)菌通用引物序列[6]:GC338f 和518r擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)片段，具體PCR擴(kuò)增程序參考Darawan等[7]方法進(jìn)行。擴(kuò)增結(jié)束取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將具有清晰條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳分析。DGGE條件為：凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，變性劑為40%～60%，60 ℃在1×TAE緩沖液中200 V、10 min，然后轉(zhuǎn)100 V，12 h。采用熒光染料染色后，在凝膠成像儀中拍照，用BIO-RAD Quantity One軟件對DGGE指紋圖譜進(jìn)行聚類分析，通過Biodap軟件對樣品泳道灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算不同樣品微生物多樣性指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以提取的底泥微生物總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出16S rDNA的V3區(qū)片段(圖1)，從擴(kuò)增檢測結(jié)果，目的片段約240 bp，擴(kuò)增特異性很好。

圖1 16S rDNA V3區(qū)片段PCR擴(kuò)增圖譜

2.2 池塘底泥微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 菌群DGGE圖譜分析

江蘇大豐地區(qū)異育銀鯽精養(yǎng)試驗(yàn)組與對照組池塘底泥細(xì)菌群落多樣性的DGGE圖譜見圖2和圖3。比較DGGE各條帶相對光密度發(fā)現(xiàn)，對照組底泥樣品共產(chǎn)生了27條可鑒別的條帶，而試驗(yàn)組池塘泥樣產(chǎn)生了多達(dá)52條可鑒別的條帶。由圖2、3及表1可知，在4—7月份養(yǎng)殖周期中，試驗(yàn)組底泥電泳條帶數(shù)為25～36，而對照組電泳條帶數(shù)為14～18，與對照組相比，試驗(yàn)組底泥樣品中的電泳條帶數(shù)明顯較多。同時，對照組底泥樣品圖譜條帶數(shù)在不同月份平均得到條帶數(shù)為12～18，而試驗(yàn)組圖譜條帶數(shù)在不同月份平均得到條帶數(shù)為27～34，顯著高于對照組，表明了三大技術(shù)的實(shí)施有利于提高精養(yǎng)池塘底泥微生物區(qū)系的多樣性。此外，通過DGGE分離圖譜顯示，各異育銀鯽精養(yǎng)池塘隨養(yǎng)殖時間增加，底泥微生物群落呈現(xiàn)遞減趨勢。

圖2 對照組D、E池塘底泥中細(xì)菌DGGE圖譜及模式圖

1，1#；2，2#；3，3#；4，4#；5，5#；6，6#；7，7#；1#～4#，4—7月對照組D底泥樣品；5#～7#，5—7月對照組E底泥樣品.

圖3 生態(tài)調(diào)控技術(shù)試驗(yàn)組底泥細(xì)菌DGGE圖譜及模式圖

1，8#；2，9#；3，10#；4，11#；5，12#；6，13#；7，14#；8，15#；9，16#；10，17#；11，18#；8#～11#，4—7月試驗(yàn)組A池塘底泥樣品；12#～15#，4—7月試驗(yàn)組B池塘底泥樣品，16#～18#為5—7月試驗(yàn)組C池塘底泥樣品.

2.2.2 菌群Shannon指數(shù)分析

在實(shí)施三大技術(shù)的異育銀鯽精養(yǎng)池塘整個試驗(yàn)周期內(nèi)(4—7月份)底泥樣品微生物群落Shannon指數(shù)平均為3.35，而對照組底泥樣品微生物群落Shannon指數(shù)平均為2.46。在各個月份底泥樣品中，試驗(yàn)組(A、B、C)Shannon指數(shù)均值分別為3.29、3.43、3.33，而對照組(D、E)Shannon指數(shù)均值分別為2.57、2.28(表1)?？傮w趨勢是試驗(yàn)組微生物群落多樣性高于對照組，其中試驗(yàn)組B多樣性最高，對照組E最低，表明了菌藻調(diào)控技術(shù)、底質(zhì)改良技術(shù)及微孔增氧技術(shù)的利用有利于提高異育銀鯽養(yǎng)殖池塘底泥中微生物群落的多樣性。

表1 試驗(yàn)組與對照組DGGE圖譜條帶及細(xì)菌多樣性指數(shù)

注：H′為Shannon指數(shù).

2.3 異育銀鯽死亡率分析

本研究統(tǒng)計(jì)了試驗(yàn)期間(4—7月)各組異育銀鯽的死亡率，以探究精養(yǎng)池塘底泥微生物群落結(jié)構(gòu)豐度差異對養(yǎng)殖效果的影響(表2)。A、B、C 3組底泥微生物群落區(qū)系多樣化的池塘，異育銀鯽死亡率分別為5.65%、1.26%、3.90%，而D、E菌群多樣性豐度較低的對照組魚體死亡率分別達(dá)到了33.38%、12.20%，明顯高于試驗(yàn)組。此外，從重大疾病的發(fā)生情況分析，底泥菌群豐富的池塘在養(yǎng)殖周期中未爆發(fā)重大疾病，而對照組池塘觀察到了鯉科皰疹病毒Ⅱ型鰓出血疾病及細(xì)菌性出血病。

表2 養(yǎng)殖期間試驗(yàn)組及對照組異育銀鯽死亡情況

3 討 論

“養(yǎng)魚先養(yǎng)水，養(yǎng)水先養(yǎng)泥”，在水生生態(tài)系統(tǒng)中，池塘底泥是最活躍與最具影響力的組成成分之一，與養(yǎng)殖動物、養(yǎng)殖水環(huán)境間關(guān)系密切[8]。底泥不僅承擔(dān)水體豐富營養(yǎng)物質(zhì)的提供、環(huán)境劇烈變化的緩沖等作用，同時還提供種類繁多的益生菌和底棲生物活動、棲息場所，與養(yǎng)殖動物生長息息相關(guān)[9-10]。

李越蜀等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)，底泥中豐富的微生物是池塘自凈能力的主要組成部分，對養(yǎng)殖過程中的物質(zhì)循環(huán)和資源再利用起著關(guān)鍵作用，尤其在選擇大量投餌的精養(yǎng)模式下，注重底泥微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的搭建，有利于營養(yǎng)與能量的充分利用，減少相關(guān)病害的發(fā)生。本研究通過DGGE 圖譜中條帶數(shù)目變化可知，異育銀鯽精養(yǎng)池塘底泥中實(shí)施了菌藻調(diào)控、均衡增氧等生態(tài)調(diào)控技術(shù)的試驗(yàn)組細(xì)菌豐度在整個試驗(yàn)期間與對照組相比差異較大，表現(xiàn)出試驗(yàn)組細(xì)菌豐度整體高于對照組。結(jié)合最終養(yǎng)殖結(jié)果發(fā)現(xiàn)，底泥微生物群落多樣性高的異育銀鯽精養(yǎng)池塘，其發(fā)生鯉科皰疹病毒Ⅱ型疾病的概率顯著低于菌群多樣性低的池塘，因此可將豐富池塘底泥細(xì)菌多樣性作為防控異育銀鯽鯉科皰疹病毒Ⅱ型出血病的一項(xiàng)重要工作。此外，本研究發(fā)現(xiàn)了精養(yǎng)池塘底泥微生物群落隨養(yǎng)殖進(jìn)程的推移，其細(xì)菌多樣性減少，目前尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報告該現(xiàn)象，推測原因可能為：(1)在養(yǎng)殖后期投餌量增加，層積在底部的殘餌、糞便及動物尸體等有機(jī)物超出了自凈能力，一方面阻礙了營養(yǎng)物質(zhì)向微生物群落輸入，另一方面有害物質(zhì)增加，抑制了微生物的生長；(2)隨著飼料持續(xù)性加入，可能在一定程度上對菌群進(jìn)行了定向性馴化，從而導(dǎo)致了菌群多樣性的衰減。針對菌群多樣性減少的機(jī)理方面仍需要大量研究證實(shí)。

雖然目前利用DGGE技術(shù)對異育銀鯽養(yǎng)殖池塘底泥微生物群落多樣性有了初步認(rèn)識，但底泥環(huán)境中微生物組成較為復(fù)雜，尚未對微生物群落組成進(jìn)行測序分析，在后期研究工作中，將會基于現(xiàn)階段的研究成果，針對性地利用高通量測序技術(shù)分析底泥中的微生物群落組成及其代謝途徑，為鯉科皰疹病毒Ⅱ型疾病的防控提供更具體的理論與技術(shù)支撐。

4 結(jié) 論

(1)菌藻調(diào)控技術(shù)、底質(zhì)改良技術(shù)及微孔增氧技術(shù)的實(shí)施有利于提高異育銀鯽精養(yǎng)池塘底泥微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性。

(2)精養(yǎng)池塘底泥豐富的微生物區(qū)系有助于減少或延緩異育銀鯽的發(fā)病或死亡，直接增加養(yǎng)殖收益。

(3)建立異育銀鯽養(yǎng)殖過程中池塘底泥微生物群落多樣性的監(jiān)測，對鰓出血或細(xì)菌性疾病的爆發(fā)具有一定程度上的預(yù)警功能。

[1] 劉文枝,曾令兵,張輝，等. 異育銀鯽感染鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)后血液生理生化指標(biāo)變化的研究[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報,2013,22(6):928-933.

[2] Xu J, Zeng L, Zhang H, et al. Cyprinid herpesvirus 2 infection emerged in cultured gibel carp,Carassiusauratusgibelioin China[J]. Veterinary Microbiology, 2013, 166(1):138-144.

[3] Wang L, He J, Liang L, et al. Mass mortality caused by Cyprinid Herpesvirus 2 (CyHV-2) in Prussian carp (Carassiusgibelio) in China[J]. Bull Eur Assoc Fish Pathol, 2012, 32(5):164-173.

[4] He J, Shi X, Yu L, et al. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for diagnosis of Cyprinid herpesvirus 2[J]. Journal of Virological Methods, 2013, 194(1):206-210.

[5] 陳昌福,陳輝,胡明，等. 異育銀鯽皰疹病毒病及其防控對策(下)[J]. 當(dāng)代水產(chǎn),2015(5):77-79.

[6] Svanevik C S, Lunestad B T. Characterisation of the microbiota of Atlantic mackerel (Scomberscombrus) [J]. International Journal of Food Microbiology, 2011, 151(2):164-170.

[7] Ruamkuson D, Tongpim S, Ketudat-Cairns M. A model to develop biological probes from microflora to assure traceability of tilapia[J]. Food Control, 2011, 22(11):1742-1747.

[8] 林文輝, 黃志斌, 林明輝, 等. 飼料、底泥、水質(zhì)與水產(chǎn)病害防控關(guān)系研究[J]. 廣東飼料, 2014, 23(8):48-52.

[9] 林文輝, 王亞軍, 陳總會, 等. 池塘底質(zhì)及其修復(fù)與管理(上)[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚, 2015(6):29-30.

[10] 林文輝, 王亞軍, 陳總會, 等. 池塘底質(zhì)及其修復(fù)與管理(下)[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚, 2015(7):23-24.

[11] 李越蜀.南美白對蝦生態(tài)綜合養(yǎng)殖池塘底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能多樣性研究[D]. 寧波:寧波大學(xué)：2014.

[12] 李曉, 李冰, 朱健, 等. 精養(yǎng)團(tuán)頭魴池塘沉積物微生物群落的結(jié)構(gòu)特征及組成多樣性分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2014, 38(2):218-227.

EffectofEcologicalRegulationTechniquesonMicrobialDiversityinSedimentsinAllogyogeneticSilverCrucianCarpCarassiusauratusgibelioCulturePonds

GOU Xiaolan1,2，SU Yanqiu1,2,3，HUANG Dan1,2， LI Juncheng1,2，WU Lifeng1,2， LUO Guoqiang1,2

( 1.Tongwei Group Co.， Ltd.，Chengdu 610041，China; 2.Chengdu Tongwei Aquatic Science and Technology Co., Ltd.，Chengdu 610081，China; 3.College of Life Science,Sichuan University，Chengdu 610065, China )

The effects of synergistic bacteria and algae regulation, sediment improvement and balance aeration on water quality factors and microbial diversity in sediments in allogyogenetic silver crucian carpCarassiusauratusgibelioculture ponds were studied in three allogyogenetic silver crucian carp culture ponds (a total area of about 42.93 hm2), and the other two ponds(a total area of about 30.00 hm2) without the methods mentioned above as the control in Dafeng county in Jiangsu province. The PCR-DGGE method was used to analyse the bacterial diversity in sediments in the ponds from April to July. The results showed that there was significantly higher bacterial diversity index (3.15-3.52) in the experimental pond sediments than that in the control pond sediments (2.20-2.74), indicating that the three technicals were helpful to improve the microbial diversity index. Meanwhile, average bacterial diversity index in experimental pond sediments were positively correlated with the fish-loss. That is, the better work was, the higher microbial diversity index in sediment was. To some degree, it infers that the linkage of the three technologies will help improve intensive pond ecological stability and increase feeding efficiency.

synergistic bacteria and algae regulation; sediment improvement ; balance aeration ;Carassiusauratusgibelio; bacterial diversity

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.005

2015-12-24；

2016-05-23.

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD13B03).

茍小蘭(1987—)，女，碩士研究生；研究方向：水產(chǎn)益生菌應(yīng)用.E-mail：394391796@qq.com.通訊作者：蘇艷秋(1984—)，女，博士研究生；研究方向：資源微生物. E-mail：745564373@qq.com.

S917.1

A

1003-1111(2017)02-0148-05