李曉穎+侯增淼+史瑾+翟寧寧+楊金芳+楊小琳+趙金禮

摘 要：目的：建立重組人膠原蛋白原料的微生物限度檢測方法及控制菌檢測方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，用于重組人膠原蛋白原料的質(zhì)量控制。方法：依據(jù)《中國藥典》2015版四部通則1105和1106，對(duì)重組人膠原蛋白原料需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)進(jìn)行檢測，并對(duì)控制菌進(jìn)行檢測。結(jié)果：連續(xù)3批重組人膠原蛋白原料回收率范圍在0.8-1.2之間，符合規(guī)定；控制菌檢測方法符合規(guī)定。結(jié)論：重組人膠原蛋白需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)檢測采用直接接種法，控制菌檢測采用常規(guī)法。

關(guān)鍵詞：人膠原蛋白；微生物限度；方法建設(shè)；方法學(xué)驗(yàn)證。

中圖分類號(hào)：S961.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-2945（2017）35-0098-02

前言

重組人膠原蛋白是通過生物技術(shù)手段構(gòu)建的工程菌株，經(jīng)發(fā)酵，分離純化制備的器械原料，其主要成分為重組人膠原蛋白。根據(jù)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)以及控制菌檢查，根據(jù)中國藥典2015版四部通則1105，1106規(guī)定[1]，建立重組人膠原蛋白原料的微生物限度檢查方法，驗(yàn)證培養(yǎng)基靈敏度，并進(jìn)行方法適用性檢查，為重組人膠原蛋白原料建立符合質(zhì)量控制要求的檢測方法。

1 設(shè)備材料

1.1 材料

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，麥康凱液體培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基均購自陜西標(biāo)普，氯化鈉，聚山梨酯80。

高壓滅菌鍋（上海申安），超凈工作臺(tái)（蘇凈凈化），分析天平（萬分之一，奧豪斯），生化培養(yǎng)箱（上海博泰），水浴鍋。

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）44102]，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]，大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]，黑曲霉[CMCC（F）98003]均購自陜西標(biāo)普，各菌種的工作菌種均傳至第3代。

1.2 供試品

本公司按規(guī)定工藝生產(chǎn)的連續(xù)3批重組人膠原蛋白凍干海綿，批號(hào)分別為：201704010，201704011，201704012。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，大腸埃希菌，枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20～25℃培養(yǎng)48小時(shí)，培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌孢子懸液。

2.2 供試品制備

稱取供試品1g，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10ml，配制成1：10供試品溶液。

2.3 直接接種法方法適用性檢查

2.3.1 供試品組制備

取90mm無菌平皿6塊，每塊加入1ml供試品溶液，3塊平皿注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，待凝固，33℃倒置培養(yǎng)3天，逐日觀察；3塊平皿注入15-20ml的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，待凝固，25℃倒置培養(yǎng)5天，逐日觀察。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)組制備

取90mm無菌平皿15塊，每塊加入1ml供試品溶液，再各吸取1ml小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉至3塊平皿，注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，待凝固，33℃倒置培養(yǎng)3天，逐日觀察；取90mm無菌平皿6塊，每塊平皿加入1ml供試品溶液，再各吸取1ml小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉至3塊平皿，注入15-20ml的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，待凝固，25℃倒置培養(yǎng)5天，逐日觀察。

2.3.3 陽性組制備

取90mm無菌平皿15塊，各吸取1ml小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉至3塊平皿，均注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，待凝固后，33℃倒置培養(yǎng)3天，逐日觀察；取90mm無菌平皿6塊，各吸取1ml小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉至3塊平皿，均注入15-20ml的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，待凝固后，25℃倒置培養(yǎng)3天，逐日觀察。

2.3.4 陰性組制備

各吸取1ml稀釋劑至6塊平皿，3塊注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，3塊注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，待凝固，于對(duì)應(yīng)溫度倒置培養(yǎng)，作為陰性對(duì)照，逐日觀察。

2.4 控制菌檢查方法適用性驗(yàn)證

2.4.1 實(shí)驗(yàn)組制備

取1：10供試品溶液10ml，接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，加入小于100cfu/ml大腸埃希菌菌懸液，35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，取1ml接種于100ml麥康凱液體培養(yǎng)基，44℃培養(yǎng)18-24h，后劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，35℃倒置培養(yǎng)18-24小時(shí)[2]；取1：10供試品溶液10ml，接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，加入小于100cfu/ml金黃色葡萄球菌菌懸液，35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，后劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上，35℃倒置培養(yǎng)18-24小時(shí)；取1：10供試品溶液10ml，接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，加入小于100cfu/ml銅綠假單胞菌菌懸液，33℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，后劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基上，35℃倒置培養(yǎng)18-24小時(shí)。endprint

2.4.2 供試品組制備

取1：10供試品溶液10ml，接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，后劃線接種于相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基上，35℃倒置培養(yǎng)，觀察生長狀況。

2.4.3 陽性組制備

各吸取小于100cfu/ml的大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌接種于100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，后劃線接種于相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基上，35℃倒置培養(yǎng)，觀察生長狀況。

2.4.4 陰性組制備

吸取10ml的0.9%無菌氯化鈉，分別接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，后劃線接種于相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基上，35℃倒置培養(yǎng)，觀察生長狀況。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 菌液稀釋級(jí)確定

通過對(duì)不同菌懸液進(jìn)行稀釋培養(yǎng)，最終確定各菌懸液稀釋級(jí)，結(jié)果如表1：

3.2 直接接種法方法適用性檢查

根據(jù)《中國藥典》2015版四部通則1105規(guī)定，回收率等于試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品組菌落數(shù)的值與菌液陽性組菌落數(shù)的比值，回收率在0.5-2.0范圍內(nèi)時(shí)，可照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)，結(jié)果如表2。

金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌，黑曲霉回收率在0.8-1.2之間。符合規(guī)定。表明重組人膠原蛋白原料的檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，可以照此檢查方法和檢查條件進(jìn)行供試品的微生物限度檢查。

連續(xù)3批重組人膠原蛋白凍干海綿需氧菌總數(shù)分別為120cfu/g，110cfu/g，90cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)分別為<10cfu/g，<10cfu/g，<10cfu/g，符合《中國藥典》2015版四部通則1105規(guī)定的需氧菌總數(shù)不得超過200cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)不得超過20cfu/g。

3.3 控制菌檢查

根據(jù)《中國藥典》2015版四部通則1106規(guī)定試驗(yàn)組和陽性組應(yīng)檢出試驗(yàn)菌，供試品組，陰性對(duì)照組應(yīng)不得檢出，即該試驗(yàn)方法成立。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌控制菌檢查結(jié)果如表3。

實(shí)驗(yàn)組和陽性組大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌在相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基上均生長良好；陰性組無菌生長；符合《中國藥典》2015版四部控制菌檢查驗(yàn)證要求。

連續(xù)3批重組人膠原蛋白凍干海綿控制菌未檢出，符合規(guī)定。

4 結(jié)束語

從上述結(jié)果來看，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌，黑曲霉回收率在0.8-1.2之間，說明樣品對(duì)金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌，黑曲霉均沒有抑菌作用，可采用直接接種法進(jìn)行需氧菌、霉菌和酵母菌的檢查?？刂凭鷻z查方法學(xué)驗(yàn)證符合規(guī)定，可用于進(jìn)行樣品的控制菌檢查。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會(huì).中國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：140-149.

[2]李敏，申國慶，龔春燕.復(fù)方土茯苓膠囊微生物限度檢查方法驗(yàn)證[J].藥學(xué)與臨床研究，2017，25（1）：33-35.endprint