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重組人膠原蛋白微生物限度檢查方法的建設(shè)及驗(yàn)證

2017-12-19 12:11李曉穎侯增淼史瑾翟寧寧楊金芳楊小琳趙金禮
科技創(chuàng)新與應(yīng)用 2017年35期

李曉穎+侯增淼+史瑾+翟寧寧+楊金芳+楊小琳+趙金禮

摘 要:目的:建立重組人膠原蛋白原料的微生物限度檢測方法及控制菌檢測方法,并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,用于重組人膠原蛋白原料的質(zhì)量控制。方法:依據(jù)《中國藥典》2015版四部通則1105和1106,對(duì)重組人膠原蛋白原料需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)進(jìn)行檢測,并對(duì)控制菌進(jìn)行檢測。結(jié)果:連續(xù)3批重組人膠原蛋白原料回收率范圍在0.8-1.2之間,符合規(guī)定;控制菌檢測方法符合規(guī)定。結(jié)論:重組人膠原蛋白需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)檢測采用直接接種法,控制菌檢測采用常規(guī)法。

關(guān)鍵詞:人膠原蛋白;微生物限度;方法建設(shè);方法學(xué)驗(yàn)證。

中圖分類號(hào):S961.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):2095-2945(2017)35-0098-02

前言

重組人膠原蛋白是通過生物技術(shù)手段構(gòu)建的工程菌株,經(jīng)發(fā)酵,分離純化制備的器械原料,其主要成分為重組人膠原蛋白。根據(jù)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn),應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)以及控制菌檢查,根據(jù)中國藥典2015版四部通則1105,1106規(guī)定[1],建立重組人膠原蛋白原料的微生物限度檢查方法,驗(yàn)證培養(yǎng)基靈敏度,并進(jìn)行方法適用性檢查,為重組人膠原蛋白原料建立符合質(zhì)量控制要求的檢測方法。

1 設(shè)備材料

1.1 材料

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基,麥康凱液體培養(yǎng)基,麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基,溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基均購自陜西標(biāo)普,氯化鈉,聚山梨酯80。

高壓滅菌鍋(上海申安),超凈工作臺(tái)(蘇凈凈化),分析天平(萬分之一,奧豪斯),生化培養(yǎng)箱(上海博泰),水浴鍋。

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003],銅綠假單胞菌[CMCC(B)44102],枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501],大腸埃希菌[CMCC(B)44102],白色念珠菌[CMCC(F)98001],黑曲霉[CMCC(F)98003]均購自陜西標(biāo)普,各菌種的工作菌種均傳至第3代。

1.2 供試品

本公司按規(guī)定工藝生產(chǎn)的連續(xù)3批重組人膠原蛋白凍干海綿,批號(hào)分別為:201704010,201704011,201704012。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌,大腸埃希菌,枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,30~35℃培養(yǎng)18~24小時(shí),培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中,20~25℃培養(yǎng)48小時(shí),培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液;接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)5~7天,加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。然后,采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi),用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌孢子懸液。

2.2 供試品制備

稱取供試品1g,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10ml,配制成1:10供試品溶液。

2.3 直接接種法方法適用性檢查

2.3.1 供試品組制備

取90mm無菌平皿6塊,每塊加入1ml供試品溶液,3塊平皿注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固,33℃倒置培養(yǎng)3天,逐日觀察;3塊平皿注入15-20ml的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固,25℃倒置培養(yǎng)5天,逐日觀察。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)組制備

取90mm無菌平皿15塊,每塊加入1ml供試品溶液,再各吸取1ml小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉至3塊平皿,注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固,33℃倒置培養(yǎng)3天,逐日觀察;取90mm無菌平皿6塊,每塊平皿加入1ml供試品溶液,再各吸取1ml小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉至3塊平皿,注入15-20ml的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固,25℃倒置培養(yǎng)5天,逐日觀察。

2.3.3 陽性組制備

取90mm無菌平皿15塊,各吸取1ml小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉至3塊平皿,均注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固后,33℃倒置培養(yǎng)3天,逐日觀察;取90mm無菌平皿6塊,各吸取1ml小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉至3塊平皿,均注入15-20ml的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固后,25℃倒置培養(yǎng)3天,逐日觀察。

2.3.4 陰性組制備

各吸取1ml稀釋劑至6塊平皿,3塊注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,3塊注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固,于對(duì)應(yīng)溫度倒置培養(yǎng),作為陰性對(duì)照,逐日觀察。

2.4 控制菌檢查方法適用性驗(yàn)證

2.4.1 實(shí)驗(yàn)組制備

取1:10供試品溶液10ml,接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,加入小于100cfu/ml大腸埃希菌菌懸液,35℃培養(yǎng)18-24小時(shí),取1ml接種于100ml麥康凱液體培養(yǎng)基,44℃培養(yǎng)18-24h,后劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上,35℃倒置培養(yǎng)18-24小時(shí)[2];取1:10供試品溶液10ml,接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,加入小于100cfu/ml金黃色葡萄球菌菌懸液,35℃培養(yǎng)18-24小時(shí),后劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上,35℃倒置培養(yǎng)18-24小時(shí);取1:10供試品溶液10ml,接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,加入小于100cfu/ml銅綠假單胞菌菌懸液,33℃培養(yǎng)18-24小時(shí),后劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基上,35℃倒置培養(yǎng)18-24小時(shí)。endprint

2.4.2 供試品組制備

取1:10供試品溶液10ml,接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,于35℃培養(yǎng)18-24小時(shí),后劃線接種于相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基上,35℃倒置培養(yǎng),觀察生長狀況。

2.4.3 陽性組制備

各吸取小于100cfu/ml的大腸埃希菌,金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌接種于100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,于35℃培養(yǎng)18-24小時(shí),后劃線接種于相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基上,35℃倒置培養(yǎng),觀察生長狀況。

2.4.4 陰性組制備

吸取10ml的0.9%無菌氯化鈉,分別接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,于35℃培養(yǎng)18-24小時(shí),后劃線接種于相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基上,35℃倒置培養(yǎng),觀察生長狀況。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 菌液稀釋級(jí)確定

通過對(duì)不同菌懸液進(jìn)行稀釋培養(yǎng),最終確定各菌懸液稀釋級(jí),結(jié)果如表1:

3.2 直接接種法方法適用性檢查

根據(jù)《中國藥典》2015版四部通則1105規(guī)定,回收率等于試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品組菌落數(shù)的值與菌液陽性組菌落數(shù)的比值,回收率在0.5-2.0范圍內(nèi)時(shí),可照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù),結(jié)果如表2。

金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌,枯草芽孢桿菌,白色念珠菌,黑曲霉回收率在0.8-1.2之間。符合規(guī)定。表明重組人膠原蛋白原料的檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì),可以照此檢查方法和檢查條件進(jìn)行供試品的微生物限度檢查。

連續(xù)3批重組人膠原蛋白凍干海綿需氧菌總數(shù)分別為120cfu/g,110cfu/g,90cfu/g,霉菌和酵母菌總數(shù)分別為<10cfu/g,<10cfu/g,<10cfu/g,符合《中國藥典》2015版四部通則1105規(guī)定的需氧菌總數(shù)不得超過200cfu/g,霉菌和酵母菌總數(shù)不得超過20cfu/g。

3.3 控制菌檢查

根據(jù)《中國藥典》2015版四部通則1106規(guī)定試驗(yàn)組和陽性組應(yīng)檢出試驗(yàn)菌,供試品組,陰性對(duì)照組應(yīng)不得檢出,即該試驗(yàn)方法成立。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌控制菌檢查結(jié)果如表3。

實(shí)驗(yàn)組和陽性組大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌在相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基上均生長良好;陰性組無菌生長;符合《中國藥典》2015版四部控制菌檢查驗(yàn)證要求。

連續(xù)3批重組人膠原蛋白凍干海綿控制菌未檢出,符合規(guī)定。

4 結(jié)束語

從上述結(jié)果來看,金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌,枯草芽孢桿菌,白色念珠菌,黑曲霉回收率在0.8-1.2之間,說明樣品對(duì)金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌,枯草芽孢桿菌,白色念珠菌,黑曲霉均沒有抑菌作用,可采用直接接種法進(jìn)行需氧菌、霉菌和酵母菌的檢查??刂凭鷻z查方法學(xué)驗(yàn)證符合規(guī)定,可用于進(jìn)行樣品的控制菌檢查。

參考文獻(xiàn):

[1]國家藥典委員會(huì).中國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:140-149.

[2]李敏,申國慶,龔春燕.復(fù)方土茯苓膠囊微生物限度檢查方法驗(yàn)證[J].藥學(xué)與臨床研究,2017,25(1):33-35.endprint

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