唐 潔 熊麗丹 綜述,李 利,3 審校

(1.四川大學華西醫(yī)院化妝品評價中心 四川 成都 610041；2.四川省化妝品工程技術研究中心 四川 成都 610041；3.四川大學華西醫(yī)院皮膚科 四川 成都 610041)

?綜 述?

組織工程皮膚概況及其在化妝品檢測中的應用進展

唐 潔1,2熊麗丹1,2綜述,李 利1,2,3審校

(1.四川大學華西醫(yī)院化妝品評價中心 四川 成都 610041；2.四川省化妝品工程技術研究中心 四川 成都 610041；3.四川大學華西醫(yī)院皮膚科 四川 成都 610041)

組織工程皮膚是通過培養(yǎng)功能細胞,將其與細胞外基質和適當?shù)闹Ъ懿牧舷嗷プ饔?，構成的具有生物活性的人工皮膚替代物。本文簡要介紹了構成組織工程皮膚的種子細胞及支架材料，并對其在化妝品腐蝕性安全性，化妝品刺激性安全性，化妝品成分的經(jīng)皮吸收及致突變性，化妝品光毒性和化妝品抗衰老功效等檢測應用方面的研究進展進行綜述。

組織工程皮膚；種子細胞；支架材料；化妝品檢測應用

組織工程(Tissue Engineering)是指結合生命科學與工程學兩門學科的原理與技術，建立在認識哺乳動物的正常及病理兩種狀態(tài)的組織結構的基礎上，研究開發(fā)組織或器官的生物替代物的一門新興學科[1-3]。利用此類方法構建的皮膚模型則稱為組織工程皮膚。目前系列化組織工程皮膚主要包含：表皮替代物模型，真皮替代物模型，含黑素瘤細胞皮膚替代物模型，全層皮膚替代物模型[4-6]，后來推廣到僅有細胞組成的或僅有支架材料組成的組織工程化皮膚[3]。本文就組織工程皮膚應用于化妝品安全性檢測的研究進展綜述如下。

1 構建組織工程皮膚的種子細胞

目前，對于組織工程皮膚的種子細胞的選擇主要有：來源于自體和異體的角質形成細胞[7-8]，成纖維細胞[9-10]，血管內皮細胞[10-11]，由于供體細胞的穩(wěn)定性得不到保障，后來又添加了各類干細胞[7,12-13]等，這些組織工程皮膚中的種子細胞一般具有以下幾個特征：①易獲??；②增殖能力強；③能在體外進行擴增；④具有生物可降解性等特征。具體的種子細胞，見表1。

常見的用于組織工程皮膚的支架材料有膠原、殼聚糖、透明質酸及明膠等天然提取物。目前，侯亮等[17]對比了人骨髓間充質干細胞復合在聚四氟乙烯和硅膠兩種材料中的生物相容性，楊榮強等[18]對通過物理、化學及生物方法去除動物皮膚組織中的表皮細胞及真皮層內細胞后，保留的低抗原性的膠原等細胞外基質蛋白和基質膜在組織工程支架材料上也進行了綜述，這些都豐富了能夠用于組織工程的支架材料。通過將種子細胞和支架材料合理的結合，各大化妝品公司或生物公司都提出了許多商品化的組織工程皮膚，具體如表2所示[3,5]。

表1 種子細胞應用舉例

表2 部分目前商品化的體外表皮皮膚和全層皮膚替代物

2 組織工程皮膚在化妝品體外檢測中的應用

目前，化妝品毒理學安全性評價方法主要采用豚鼠、家兔等作為受試動物，實驗過程中，給這些動物帶來巨大傷害和痛苦。于是禁止使用動物進行化妝品的測試于2009年被歐盟提出，同時歐盟組織也不允許其成員國進口經(jīng)過動物實驗檢驗的產(chǎn)品。因此，組織工程皮膚的出現(xiàn)，為化妝品安全性評價若干皮膚毒性替代實驗方法研究起到了極大的推動作用，同時也為開展化妝品原料或成品毒理學方法研究，以及制定安全性評價替代實驗方法技術指南提供了更為精準的實驗模型。

2.1 建立化妝品腐蝕性安全性實驗：2000年，歐萊雅公司下的EpiDerm和EpiSkin兩款皮膚替代物產(chǎn)品得到歐委會正式的授權，作為活體兔皮膚的替代物，成為皮膚腐蝕性檢測的工具，并在歐盟國范圍內推行。緊接著，Mattek公司旗下EpiDerm皮膚替代物也獲得了美國的批準，成為皮膚腐蝕性檢測的工具。隨后，組織工程皮膚在化妝品腐蝕性檢測上取得了快速發(fā)展。張兆清等[19]利用組織工程學方法，采用Ⅰ型膠原為支架，種入人表皮角質形成細胞和真皮成纖維細胞構建組織工程皮膚模型，檢測了8種化學品的腐蝕性。劉珍等[20]采用包皮組織提取的原代細胞，鼠尾膠原為生物支架構建組織工程皮膚，通過組織細胞活性驗證，快速滲透試驗驗證構建的皮膚模型，驗證合格后，選用歐盟推薦檢測使用的3種化學腐蝕性物質(正辛酸，10％KOH，丙烯酸)，非腐蝕性物質2種(四氯乙烯，丁香酚)進行測試。根據(jù)建立的方法，檢測了39種化妝品進行皮膚腐蝕性、刺激性檢測。使用組織工程皮膚進行腐蝕性實驗，方法簡單快速，減少了對動物的傷害，但該模型的準確性不夠，需要進一步提高。

2.2 建立化妝品刺激性安全性實驗：相較于化妝品的皮膚腐蝕性實驗，皮膚刺激性實驗不僅僅需要測量毒理，同時需要測定細胞因子和酶釋放等代謝指標。據(jù)此，歐盟給出了檢測指南TG431，推薦使用MTT法檢測組織細胞毒理。后來在實際研究過程中，發(fā)現(xiàn)MTT方法雖然特異性好，但靈敏度不夠高，為了提高受試物的刺激性檢測結果的可靠性，又添加了炎癥介質IL-1，IL-8，TNF-α，IL-10和PGF-2等檢測指標，采用這類多通道多指標檢測為化妝品刺激性實驗提供更為可靠的數(shù)據(jù)。這些指標的合用，為之后ECVAM第26屆歐洲委員會大會提出對于待測物刺激性評價指標的判定標準(EEC/R38)提供了前期的數(shù)據(jù)和研究支持。在一系列規(guī)范化的判定標準出臺后，國內許多科研工作者都在化妝品刺激性檢測領域做出了進一步的驗證。劉珍等[20]采用鼠尾膠原為支架，人包皮組織分離的表皮和真皮后的原代細胞為種子細胞，共同培養(yǎng)建立皮膚模型，并應用于39種化妝品的刺激性安全檢測，所得到的結果與采用歐盟標準方法得到的結果一致。張廣靜等[21]使用了兩種細胞為種子細胞，分別為原代培養(yǎng)的細胞及永生化的細胞構建組織工程皮膚模型，對比采用這兩種不同種子細胞的皮膚模型對20種化妝品配方常用物質及化學常用物質進行皮膚刺激性檢測的相關研究，通過IC50和IL-1α兩個指標的評定，同時與EpiDerm和Episkin評價的結果對比，表明構建的兩種模型都能很好地檢測出物質的刺激性和非刺激性。諸多實驗結果表明，組織工程皮膚用于化妝品刺激性檢測能得到可靠結果，同時大量減少了用于化妝品刺激性實驗的動物數(shù)目。Casas等[22]使用EpiDerm皮膚模型替代動物模型進行刺激性實驗。

2.3 研究化妝品成分的經(jīng)皮吸收和致突變性：目前化妝品市場有很大一個份額為藥妝品牌市場，這類化妝品成分中的許多功效性成分能否透過皮膚達到作用的目標靶點以及透過的準確量仍然沒有一個準確的體外實驗方法。因此，對于體外實驗中組織工程皮膚的出現(xiàn)就引起了許多化妝品研究從業(yè)人群的極大關注。Gabbanini等[23]使用組織工程皮膚SkinEthic?對化妝品中常見的8種成分：茴香腦、香芹酮、薄荷酮、薄荷醇、芳樟醇、側柏酮、桉葉素及卡波分別進行透皮實驗，然后通過動力學分析結果，并與GC/HPLC-MS儀器結果做對比，結果可靠。目前，納米化妝品在市場上吸引了廠家和消費者的注意，但原料達到納米尺寸，其許多物理和化學性質，諸如納米尺寸效應等，則與常規(guī)尺度的原料有很大的區(qū)別。許多化妝品，諸如防曬劑等，正是看中了納米材料的這個物理性質，有不同濃度的添加。劉珍等[20]利用重組人皮膚模型，在皮膚模型下層設置一層靶細胞(L5178Y)，通過一個間接實驗，測定納米TiO2材料的經(jīng)皮吸收和其致突變性。Pfuhler等[24]也采用EpiDerm皮膚模型和化妝品接觸一段時間后，分析細胞DNA的損傷情況，從而將其應用到化妝品的遺傳毒性的檢測中。

2.4 研究化妝品光毒性：正常皮膚長時間暴露于潛在的有害照射下，可能會導致某些皮膚疾病，對于暴露于光照下的皮膚細胞，人體黑素細胞將產(chǎn)生黑素，并通過樹突傳到周圍的角質細胞內，因此，用于體外化妝品的組織工程皮膚的種子細胞大多具有黑素細胞以及角質細胞的存在。而化妝品的體外光毒性(Phototoxicity)是指皮膚接觸到某些化妝品內的化學品后，在太陽光或紫外線的照射下，發(fā)生的急性毒性反應。目前，光毒性檢測的體外替代方法主要是利用細胞、組織或者器官模型進行篩選[25]，例如3T3中性紅攝入法等。Bernerd等[26]將自建的組織工程皮膚暴露于不同波段的UVB及UVA輻照，實驗結果顯示，在體外模擬人皮膚環(huán)境下，UVA和UVB對于皮膚的不同結構層的傷害是不一樣的，同時能夠模擬防曬化妝品涂抹皮膚的實驗過程。總得來說，組織工程皮膚應用于化妝品光毒性檢測具有以下優(yōu)點[27]：①可以模擬皮膚局部用藥；②具有角質層屏障，光照后產(chǎn)生的化合物和分子吸收劑滲透結果更為接近人體正常皮膚，結果更為可靠。

2.5 研究化妝品抗衰老功效：將化妝品涂于組織工程皮膚模型上，通過檢測相關指標，如清除自由基能力，抗氧化能力和膠原蛋白含量等指標，可以考察化妝品對細胞增殖分化及抗氧化能力的影響。Grazul等[28]將保濕面霜涂于EpiDerm模型上，進行了氧自由基吸收能力的測定。Santa-Maria等[29]采用組織工程皮膚作為模型，發(fā)現(xiàn)米糠原料中水溶性酶類具有降低脂質過氧化值的作用。相對于直接使用皮膚細胞進行實驗，組織工程皮膚模型上進行抗衰老的功效性評價更能反映生物體的真實狀態(tài)。

3 總結和展望

組織工程皮膚在化妝品體外評價領域具有良好的應用前景，但也存在著多細胞共培養(yǎng)技術不成熟，組織結構相對真實皮膚結構較為簡單，各細胞層分化不良以及部分標志物不規(guī)則表達的缺點，因此還需要進一步的調整三維細胞培養(yǎng)技術。目前，組織工程皮膚的臨床應用有望在口腔、皮膚等各類疾病的治療上得到更廣泛的應用。

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Overview of Tissue Engineering Skin and It′s Application in Cosmetics Test

TANG Jie1,2,XIONG Li-dan1,2,LI Li1,2,3
(1.Center of Cosmetic Safety and Ef fi cacy Evaluation,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan,China;2.Engineering Technology Research Center of Cosmetic in Sichuan,Chengdu 610041,Sichuan,China;3.Department of Dermatology,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan,China)

Tissue engineered skin is a biologically active arti fi cial skin substitute,which is formed by the interaction of the extracellular matrix and the appropriate scaffold materials with the functional cells. This paper briefly introduces several composition speccies of seed cells and scaffold materials of tissue engineering skin,Besides,this article also reviews the application progress of tissue engineering skin in cosmetic corrosion safety,cosmetic irritant safety,cosmetic percutaneous absorption and mutagenicity of cosmetics,light toxicity and cosmetic anti-aging ef fi cacy testing.

tissue engineered skin; seed cells; scaffold; cosmetic testing

R456

A

1008-6455(2017)11-0132-03

李利,四川大學華西醫(yī)院皮膚科/化妝品評價中心教授、主任醫(yī)師；研究方向：損容性皮膚病(色素性、血管性皮膚病、痤瘡等)，皮膚老化及光老化，皮膚保健與美容，皮膚美容激光等；E-mail:lily_hxyy@163.com

2017-08-08

2017-10-23

編輯/李陽利