陳宗桂，張玉榮，劉 歡，羅 曼，王 琦，李發(fā)琪(重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 省部共建國家重點實驗室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點實驗室 重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點實驗室 重慶市微無創(chuàng)醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400016)

·基礎(chǔ)與實驗研究·

一種新型相變納米微球增強高強度聚焦超聲消融的實驗研究

陳宗桂，張玉榮，劉 歡，羅 曼，王 琦，李發(fā)琪*
(重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 省部共建國家重點實驗室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點實驗室 重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點實驗室 重慶市微無創(chuàng)醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400016)

目的探討脂質(zhì)包裹1，1，2-三氯三氟乙烷相變納米微球?qū)Ω邚姸染劢钩?HIFU)消融效果的影響。方法采用薄膜水化法制備脂質(zhì)包裹1，1，2-三氯三氟乙烷相變納米微球并檢測其理化性質(zhì)。通過離體及在體實驗驗證其對HIFU的增效作用。離體實驗采用250 W、10 s的連續(xù)波輻照離體牛肝組織。在體實驗采用200 W、5 s的連續(xù)波輻照活體新西蘭大白兔的肝臟組織。測量、計算HIFU輻照后靶區(qū)的凝固性壞死體積、能效因子(EEF)及強回聲區(qū)體積，并進行統(tǒng)計分析。結(jié)果相變納米微球在溶液中呈球狀、均勻分布，粒徑均一。離體實驗顯示，注射有納米微球的牛肝組織HIFU輻照后凝固性壞死體積、EEF及強回聲區(qū)體積均大于未經(jīng)處理的牛肝組織(t=28.80、19.55、14.30，P=0.01、0.02、0.02)。在體實驗顯示，注射有納米微球的新西蘭大白兔肝組織HIFU輻照后凝固性壞死體積、EEF及強回聲區(qū)體積均大于對照組(t=9.41、13.52、15.67，P=0.02、0.01、0.01)。結(jié)論脂質(zhì)包裹1，1，2-三氯三氟乙烷相變納米微球可明顯提高HIFU消融效率。

聲液滴汽化；聲空化；生物學(xué)效應(yīng)；1，1，2-三氯三氟乙烷

作為一種無創(chuàng)消融腫瘤技術(shù)[1-4]，高強度聚焦超聲(high intensity focused ultrasound， HIFU)具有廣泛應(yīng)用前景。但HIFU消融體積較大或位置深在腫瘤所需時間較長，明顯增加了HIFU治療的風(fēng)險。改變組織的聲環(huán)境可明顯增強HIFU消融[5-6]。鑒于此，有學(xué)者[7-9]采用超聲微泡造影增強HIFU消融。然而，微泡在人體內(nèi)循環(huán)的半衰期較短(<10 min)，消融較大的腫瘤時需多次注射超聲微泡造影劑，可增加多重感染的風(fēng)險，且微泡可能對組織造成不可預(yù)測的損傷。有研究[10-12]表明，脂質(zhì)包裹相變納米微球可明顯增強HIFU消融效果。然而，傳統(tǒng)的氟碳增效劑仍存在不足，如全氟戊烷的沸點低、性質(zhì)不穩(wěn)定、易造成血管栓塞，而全氟己烷沸點太高，增強HIFU消融效果不理想等。1，1，2-三氯三氟乙烷無毒、穩(wěn)定性高，沸點47.57 ℃，介于全氟戊烷與全氟己烷之間。本研究將脂質(zhì)包裹1，1，2-三氯三氟乙烷組成相變微球，探討其對HIFU消融效果的影響。

1 材料與方法

1.1 相變納米微球制備 將10 mg棕櫚酰磷脂酰膽堿(1,2-dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholine， DPPC；Avanti公司)、4 mg二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine， DSPE；Avanti公司)、3 mg 1,2-棕櫚酰磷脂酰甘油[1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol)， DPPG；Avanti公司]、3 mg膽固醇及10 ml氯仿均勻混合后，采用RE-52B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化公司)對盛有混勻溶液的燒瓶置于低壓加熱蒸發(fā)，直至有均勻的脂質(zhì)薄膜生成。然后向燒瓶中加入4 ml磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline， PBS；pH值7.4)，搖勻。當(dāng)脂質(zhì)薄膜完全溶解后，將溶液倒入試管，并將試管置于盛有碎冰的燒杯中。將200 μl液態(tài)1，1，2-三氯三氟乙烷加入試管中。采用Sonics VCX 150型超聲處理器(聲功率130 W，處理時間120 s，超聲頻率20 kHz，占空比70%)對溶液進行乳化后制得脂質(zhì)包裹相變納米微球，并將相變納米微球溶液于4℃冰箱中保存、備用。

1.2 相變納米微球性質(zhì)檢測 以PBS稀釋相變納米微球溶液后，采用Olympus CKX-41型倒置熒光顯微鏡觀察其形態(tài)、大小及分布。采用Malvern激光粒徑測量儀檢測相變納米微球的平均粒徑。

1.3 HIFU輻照

1.3.1 離體實驗 選用新鮮的離體牛肝，在8 h內(nèi)進行離體實驗。將注射1 ml相變納米微球的新鮮離體牛肝作為實驗組(離體實驗組)，未做任何處理的新鮮離體牛肝作為空白對照組(離體空白對照組)。HIFU輻照前，將兩組牛肝組織放入真空泵中脫氣約1 h。將牛肝組織的包膜正對HIFU換能器，采用海扶JC-200型HIFU治療儀，以250 W、10 s的連續(xù)波對牛肝組織進行輻照，換能器的幾何焦點距離牛肝包膜約20 mm。輻照結(jié)束后，通過Jupiter F軟件測量牛肝組織凝固性壞死體積，并計算EEF。EEE=P×T/V，其中P為聲功率，T為輻照時間，V為凝固性壞死體積。并通過HIFU治療儀自帶的軟件對比分析輻照前后離體牛肝組織回聲變化。

1.3.2 在體實驗 選用新西蘭大白兔8只(重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供)，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，平均(2.25±0.75)kg。整個實驗過程經(jīng)本院動物倫理委員會批準(zhǔn)通過(批準(zhǔn)號：SCXK 2012-0001)。實驗前對所有動物停飼24 h，停飲6 h。隨機分為2組，每組4只。對實驗組(在體實驗組)經(jīng)耳緣靜脈注射1 ml納米微球，空白對照組(在體空白對照組)不做任何處理。將3 g戊巴比妥鈉加入100 ml生理鹽水中用于麻醉，劑量1 ml/kg體質(zhì)量。經(jīng)兔耳緣靜脈注射納米微球。對在體實驗組于注射納米微球后5 min通過B超確定其肝臟位置，并以200 W、5 s的連續(xù)波進行HIFU輻照。對在體空白對照組于相應(yīng)時間以相同輻照條件進行HIFU輻照。輻照結(jié)束后4天處死實驗兔，取出兔肝組織。通過Jupiter F軟件測得兔肝組織凝固性壞死體積并計算EEF。并通過HIFU治療儀自帶的軟件對比分析輻照前后在體兔肝組織的回聲變化。

圖1 相變納米微球的理化性質(zhì) A.倒置熒光顯微鏡下觀察相變納米微球形態(tài)(×400); B.激光粒徑測量儀檢測納米微球粒徑

圖2 HIFU輻照后凝固性壞死情況 A、B.以250 W、10 s輻照注射有相變納米微球(A)及未經(jīng)任何處理(B)的離體牛肝組織； C、D.以200 W、5 s輻照注射有相變納米微球(C)及未經(jīng)任何處理(D)的在體兔肝組織

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料以±s表示。采用獨立樣本t檢驗比較離體及在體實驗中各組凝固性壞死體積、EEF和強回聲區(qū)體積的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

采用薄膜水化法制得的相變納米微球，其溶液呈乳白色。靜置約1 h后分層，上層為透明液體，下層為乳白色沉淀。熒光顯微鏡下觀察，微球成球狀均勻分布在溶液中(圖1A)。Malvern激光粒徑測量儀測得脂質(zhì)包裹1,1,2-三氯三氟乙烷微球粒徑為(268.25±50.69)nm(圖1B)。

2.1 離體實驗結(jié)果 HIFU輻照結(jié)束后，沿聲軸方向切開牛肝組織，肉眼可見牛肝組織的壞死區(qū)域成橢球形，邊界清晰，且離體實驗組壞死區(qū)域大于空白對照組、壞死程度高于空白對照組(圖2A、2B)。離體實驗組牛肝組織凝固性壞死體積為空白對照組的2.41倍，EEF為空白對照組2.30倍；離體實驗組牛肝組織凝固性壞死體積及EEF[(747.05±215.08)mm3、(3.53±0.72)J/mm3]均明顯大于空白對照組[(310.50±22.69)mm3、(8.09±0.57)J/mm3；(t=28.80、19.55，P=0.01、0.02)]，見圖3。HIFU輻照結(jié)束后，離體實驗組及空白對照組均出現(xiàn)強回聲區(qū)(圖4)。離體實驗組牛肝組織強回聲區(qū)體積為空白對照組的1.95倍；離體實驗組強回聲區(qū)體積[(144.85±19.99)mm3]明顯大于空白對照組[(74.00±15.17)mm3；t=14.30，P=0.02]，見圖5。

圖4 HIFU輻照前后離體牛肝組織B超圖像 A、B.未經(jīng)任何處理的離體牛肝組織HIFU輻照前(A)和輻照后(B)B超圖像； C、D.注射納米微球的離體牛肝組織HIFU輻照前(C)和輻照后(D)B超圖像 圖5 HIFU輻照后B超顯示強回聲區(qū)體積 (黑色表示離體牛肝組織強回聲區(qū)體積；紅色表示在體兔肝組織強回聲區(qū)體積；*：P<0.05) 圖6 HIFU輻照后在體兔肝組織凝固性壞死體積及EEF (黑色表示兔肝組織凝固性壞死體積；紅色表示兔肝組織EEF；*：P<0.05)

圖3 HIFU輻照后離體牛肝組織凝固性壞死體積及EEF (黑色表示牛肝組織凝固性壞死體積；紅色表示牛肝組織EEF；*：P<0.05)

2.2 在體實驗結(jié)果 兔肝組織損傷情況見圖2C、2D。在體實驗組兔肝組織凝固性壞死體積為空白對照組的5.26倍，EEF為空白對照組的5.08倍；在體實驗組兔肝組織凝固性壞死體積及能效因子[(355.99±82.45)mm3、(2.95±0.72)J/mm3]均明顯大于空白對照組[(67.67±7.98)mm3、(14.98±1.98)J/mm3；(t=9.41、13.52，P=0.02、0.01)]，見圖6。HIFU輻照結(jié)束后，在體實驗組及空白組兔肝組織均出現(xiàn)強回聲區(qū)(圖7)。在體實驗組兔肝組織強回聲區(qū)體積為空白對照組的2.67倍；在體實驗組強回聲區(qū)體積[(44.73±7.94)mm3]明顯大于空白組[(16.75±2.22)mm3；(t=15.67，P=0.01)]，見圖5。

3 討論

HIFU消融治療體積較大的實體腫瘤時常采用大輻照劑量和長輻照時間，但在HIFU治療過程中易引起皮膚灼傷等一系列并發(fā)癥。如何有效提高HIFU的治療效率一直是HIFU研究的熱點問題[13-14]。超聲微泡造影劑對提高HIFU療效具有重要作用[15-16]。作為一種空化核，超聲微泡造影劑能夠明顯降低靶區(qū)組織的空化閾值，增加組織凝固性壞死體積。但微泡粒徑過大、穿透性差、血液循環(huán)時間短和損傷體積不可控等缺點限制了HIFU在臨床的進一步應(yīng)用。而脂質(zhì)包裹相變微球具有強穿透性、高穩(wěn)定性，存在時間較長等優(yōu)點。本研究制備脂質(zhì)包裹1，1，2-三氯三氟乙烷相變納米微球，相變溫度為47.57 ℃，粒徑為(268.25±50.69)nm。腫瘤血管壁的空隙為380～780 nm，且腫瘤組織淋巴回流受阻；因此，相變納米微球可自由通過血管積聚在腫瘤組織。HIFU輻照時，脂質(zhì)包裹相變微球只在換能器的焦點處相變，微球與聲波的相互作用加劇了能量的沉積，從而使組織的損傷形狀在空間上可控。本研究在實驗過程中，為降低水溫和溶氧量對實驗結(jié)果造成的影響，每隔30 min自動換水，并通過水處理器對水進行脫氣。

圖7 HIFU輻照前后在體兔牛肝組織B超圖像 A、B.未經(jīng)任何處理的新西蘭大白兔HIFU輻照前(A)及輻照后(B)B超圖像； C、D.注射納米微球的新西蘭大白兔HIFU輻照前(7C)及輻照后(7D)B超圖像

本實驗以脂質(zhì)包裹1,1,2-三氯三氟乙烷組成的相變微球作為增效劑，通過離體及在體實驗對其增強HIFU輻照效果的作用進行驗證，結(jié)果表明該相變微球具有良好的生物安全性及穩(wěn)定性。離體實驗和在體實驗中，實驗組HIFU輻照后的凝固性壞死體積均大于空白對照組。但在離體實驗中，發(fā)現(xiàn)實驗組個別牛肝組織發(fā)生凝固性壞死的體積明顯不同于組中其他離體牛肝組織，分析原因可能包括：①將納米微球注射進離體牛肝組織時，在組織中留下針孔，HIFU輻照過程中輻射力推動納米微球沿針孔外流，造成靶區(qū)納米微球的濃度分布不均，導(dǎo)致靶區(qū)能量沉積不均勻、損傷范圍不一致；②靶區(qū)附近存在毛細(xì)血管而B超未顯示，微球沿毛細(xì)血管流失，導(dǎo)致HIFU消融效果不明顯。

總之，本實驗通過薄膜水化法制備粒徑為(268.25±50.69)nm的相變微球。通過離體和在體實驗，初步證實脂質(zhì)包裹1,1,2-三氯三氟乙烷對HIFU具有增效作用，有助于提高HIFU介導(dǎo)消融效率，縮短治療時間。

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Experimentalstudyofanovelphasechangenanodropletsenhancedhighintensityfocusedultrasoundablation

CHENZonggui,ZHANGYurong,LIUHuan,LUOMan,WANGQi,LIFaqi*
(StateKeyLaboratoryofUltrasoundEngineeringinMedicineCo-foundedbyChongqingandtheMinistryofScienceandTechnology,ChongqingKeyLaboratoryofUltrasoundinMedicineandEngineering,CollegeofBiomedicalEngineering,ChongqingMedicalUniversity,ChongqingCollaborativeInnovationCenterforMinimally-invasiveandNoninvasiveMedicine,Chongqing400016,China)

ObjectiveTo investigate the effect of lipid encapsulated 1,1,2- trichlorotrifluoroethane phase change nanodroplets for high intensity focused ultrasound (HIFU) ablation.MethodsThe lipid encapsulated 1,1,2- trichlorotrifluoroethane phase change nanodroplets was prepared with membrane hydration method， and its physicochemical properties were examined. The synergistic effect of HIFU ablation was verified with experiments in vitro and in vivo experiments. For in vitro experiment, the isolated bovine liver tissues were irradiated with HIFU (250 W, 10 s， continuous wave). For in vivo experiment, the livers of New Zealand rabbits were irradiated with HIFU (200 W, 5 s, continuous wave). The volume of coagulative necrosis, energy efficiency factors (EEF) and the volume of the hyperechoic area after HIFU radiation were measured. And the statistical analysis was performed.ResultsPhase change nanoparticles were spherical in solution and uniform in size. For in vitro experiment, the coagulative necrosis volume, EEF and hyperechoic area of bovine liver tissue injected with nanodroplets were significantly higher than those of untreated bovine liver tissue (t=28.80， 19.55， 14.30；P=0.01，0.02，0.02) after HIFU. For in vivo experiment, the coagulative necrosis volume, EEF and hyperechoic area of rabbit liver tissue injected with nanodroplets were significantly higher than those of untreated rabbit liver tissue (t=9.41， 13.52， 15.67；P=0.02， 0.01， 0.01) after HIFU.ConclusionThe lipid encapsulated 1,1,2- trichlorotrifluoroethane phase change nanodroplets can significantly improve the efficiency of HIFU ablation significantly.

Acoustic droplet vaporization； Acoustic cavitation； Bioeffects； 1,1,2- trichlorotrifluoroethane

國家自然科學(xué)基金(11574039、11274404)。

陳宗桂(1989—)，男，福建莆田人，在讀碩士。研究方向：超聲生物學(xué)效應(yīng)。E-mail： zonggui1129@163.com

李發(fā)琪，重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 省部共建國家重點實驗室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點實驗室 重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點實驗室 重慶市微無創(chuàng)醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，400016。E-mail： lifaqi70@163.com

2017-07-04

2017-08-18

10.13929/j.1672-8475.201707005

R-332; R445.1

A

1672-8475(2017)12-0757-06