郭紅剛，李莉，周生來，盧領(lǐng)群，李坤，杜江濤，石巧娟，金秀清，李長(zhǎng)龍，薩曉嬰，應(yīng)華忠，褚曉峰*

(1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 杭州 310013； 2.杭州市疾病預(yù)防控制中心，杭州 3100212； 3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部， 沈陽(yáng) 110001； 4.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 北京 100069)

研究報(bào)告

長(zhǎng)爪沙鼠體外受精與早期胚胎體外培養(yǎng)體系的初步建立

郭紅剛1，李莉2，周生來3，盧領(lǐng)群1，李坤1，杜江濤1，石巧娟1，金秀清1，李長(zhǎng)龍4，薩曉嬰1，應(yīng)華忠1，褚曉峰1*

(1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 杭州 310013； 2.杭州市疾病預(yù)防控制中心，杭州 3100212； 3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部， 沈陽(yáng) 110001； 4.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 北京 100069)

目的探討自配的獲能液和受精液用于長(zhǎng)爪沙鼠體外受精的可行性，為長(zhǎng)爪沙鼠的胚胎保種提供參考。方法用自配的獲能液和受精液對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠進(jìn)行體外受精，并用改良后的KSOM培養(yǎng)液對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠的2細(xì)胞胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果長(zhǎng)爪沙鼠體外受精率在60%以上，沙鼠2細(xì)胞胚胎能夠在體外進(jìn)一步發(fā)育。結(jié)論初步建立了長(zhǎng)爪沙鼠體外受精和胚胎發(fā)育體系，但需要進(jìn)一步優(yōu)化。

長(zhǎng)爪沙鼠；體外受精；體外培養(yǎng)

長(zhǎng)爪沙鼠 (Mongolian gerbil,Merionesunguiculatus)是研究神經(jīng)學(xué)、寄生蟲學(xué)、病毒學(xué)、細(xì)菌學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、遺傳學(xué)、血液學(xué)、脂類、糖代謝、腫瘤學(xué)、藥理學(xué)、放射生物學(xué)、生殖和毒理學(xué)的良好模型動(dòng)物，具有很高的科研價(jià)值和應(yīng)用前景，有望成為一個(gè)有中國(guó)特色的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新品系[1-5]。采用傳統(tǒng)的保種方法，消耗大量人力物力資源，而且自然災(zāi)害、意外微生物污染都可能使這些寶貴品系毀于一旦，特殊的表型在繁育過程中也可能由于遺傳漂變而喪失，因此對(duì)其胚胎進(jìn)行冷凍保存是未來沙鼠資源保種的主要方式，這就需要有大量的胚胎，體外受精正是獲得大量胚胎的有效途徑。因?yàn)殚L(zhǎng)爪沙鼠精子與胚胎體外培養(yǎng)的特殊性，相關(guān)研究一直進(jìn)展緩慢,迄今為止，仍未找到適合于長(zhǎng)爪沙鼠精子體外獲能、體外受精和胚胎體外發(fā)育的培養(yǎng)液。

我們采用計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)(computer-assisted sperm analysis,CASA)對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠精子在自配的獲能液中不同時(shí)間精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)進(jìn)行測(cè)量，最終確定獲能時(shí)間大致在4～5 h，隨后的體外受精結(jié)果也支持這一結(jié)論，在改良后的KSOM培養(yǎng)液中，部分胚胎可以發(fā)育到桑葚胚。我們初步建立了長(zhǎng)爪沙鼠體外受精和體外發(fā)培養(yǎng)體系，為長(zhǎng)爪沙鼠的冷凍保種提供了有力的支持，但該體系需要進(jìn)一步完善。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雌性長(zhǎng)爪沙鼠，2～3月齡，雄性長(zhǎng)爪沙鼠5月齡，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(浙)2008-0033】，實(shí)驗(yàn)在浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行【SYXK(浙)2008-0113】，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施光照周期為7：00-19：00光照，19：00-7：00黑暗。長(zhǎng)爪沙鼠飼喂輻照料，飲用超濾水，籠器具、墊料等均經(jīng)121℃高壓滅菌，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25℃,濕度40%～60%。

1.1.2 主要試劑和藥品

體外獲能液(實(shí)驗(yàn)室自配)，組成成分為：NaCl、 KCl、 NaHCO3、葡萄糖、丙酮酸鈉、 ?；撬?、 腎上腺素、 BSA、 MgCl2·6H2O、 NaH2PO4·2H2O、 CaCl2·2H2O、 酚紅(0.5%)、 青霉素G、 硫酸鏈霉素及DL-乳酸鈉溶液，pH值為(7.35±0.10)，滲透壓為(315±5)mOsm/kg。

體外受精液(實(shí)驗(yàn)室自配)，組成成分除BSA加倍外,其余同體外獲能液。M2培養(yǎng)基(M7167,Sigma)，石蠟油(lotD357A,SAGE),孕馬血清(PMSG,寧波),絨促性腺素 (HCG,寧波)。

1.1.3 儀器

CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(CASA,Microptic,Barcelona,Spain)，解剖顯微鏡(Leica,S8APO)，洗卵管(自制),35 mm培養(yǎng)皿 (Corning,USA),100 mm培養(yǎng)皿(Corning,USA)。

1.2 方法

1.2.1 液滴平衡

取獲能液和受精液在35 mm 培養(yǎng)皿中分別作獲能液滴(300 μL/d)和受精液滴 (200 μL/d)，用礦物油覆蓋液滴，在使用前30 min平衡。

1.2.2 精子的獲取、培養(yǎng)及長(zhǎng)爪沙鼠精子獲能時(shí)間確定

早上8:00，取4月齡有繁育能力的雄鼠，頸椎脫臼處死，腹部75%酒精消毒，打開腹腔，取附睪尾，用眼科剪將附睪尾周圍的脂肪剝離，在滅菌濾紙上去除血跡和脂肪，用拇指和食指輕輕擠壓附睪尾，同時(shí)用1 mL注射器針頭刺破附睪尾，待破口處涌出乳白色的精子團(tuán)后用1 mL注射器針頭挑出約30 μL精子團(tuán)，置于預(yù)先平衡好的液滴中,在5% CO2、飽和濕度100%、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、2.5、4.5、5.5 h。

我們采用計(jì)算機(jī)輔助精子質(zhì)量分析系統(tǒng)對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠精子在自配的獲能液中不同時(shí)間精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)進(jìn)行測(cè)量(參數(shù)設(shè)定見圖1)，精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)包括直線運(yùn)動(dòng)速度VSL(straight-line velocity,μm/s)是觀察時(shí)間內(nèi)精子從運(yùn)動(dòng)起點(diǎn)到運(yùn)動(dòng)終點(diǎn)的直線距離對(duì)觀察時(shí)間的比；曲線速度VCL(curvilinear-velocity,μm/s)是精子在觀察時(shí)間內(nèi)所經(jīng)過的實(shí)際運(yùn)動(dòng)軌跡距離總和對(duì)觀察時(shí)間的比；平均運(yùn)動(dòng)路徑速度VAP (average path velocity,μm/s)是精子在觀察時(shí)間內(nèi)的平均軌跡距離總和對(duì)觀察時(shí)間的比；直線性LIN(linearity,LIN=VSL/VCL，)表征精子實(shí)際所走路徑的曲折程度,值越大表示路徑越直，值越小表示越彎，并且取值范圍在0-1之間；前向性STR(straightness，STR=VSL/VAP)，表征精子向前運(yùn)動(dòng)的程度，值越大表示精子前向能力越好，值越小表示精子可能在原地打轉(zhuǎn)，取值范圍在0-1之間；側(cè)擺幅度ALH (lateral amplitude，μm):精子在運(yùn)動(dòng)過程中實(shí)際運(yùn)動(dòng)軌跡相對(duì)其平均移動(dòng)軌跡的偏移幅度；鞭打頻率BCF(beat cross frequency)精子曲線運(yùn)動(dòng)軌跡越過其平均路徑軌跡的次數(shù)對(duì)觀察時(shí)間的平均，各參數(shù)的幾何意義如圖1中CELL TRACK REFERENCE所示。照相速度60幀/秒，數(shù)據(jù)為6幀連續(xù)照片的平均值。

1.2.3 卵子的超排與獲取

第0天下午5點(diǎn)取雌鼠，腹腔注射PMSG,劑量為每只40 IU,第4天下午8點(diǎn)取雌鼠，腹腔注射HCG，劑量為每只40 IU，HCG注射后16 h，將雌鼠用頸椎脫臼法處死,75%乙醇消毒腹部，打開腹腔，取出輸卵管置于液滴培育皿的礦物油內(nèi)，于顯微鏡下劃破輸卵管膨大部，收集卵丘團(tuán)于液滴內(nèi)。

1.2.4 體外受精

取8 μL精子加入受精皿內(nèi),37℃培養(yǎng)箱中受精8～9 h。

1.2.5 受精結(jié)果檢查

受精培養(yǎng)8～9 h后將卵子移出，置于受精液中洗3遍，移入預(yù)先平衡的發(fā)育液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后觀察2-細(xì)胞發(fā)育率。

1.2.6 胚胎的體外培養(yǎng)

我們改變KSOM培養(yǎng)液中BSA的濃度和滲透壓，觀察2細(xì)胞在其中的發(fā)育情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 11.0軟件中的One-Way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 超排卵結(jié)果

超數(shù)排卵時(shí)我們一般不考慮其性周期，每只用40 IU的激素進(jìn)行超排，二次激素間隔在96～100 h,每只沙鼠平均采卵數(shù)約20枚。

如果考慮性周期,我們數(shù)據(jù)表明,在發(fā)情后期進(jìn)行超排效果較好，見表1。在激素間隔為96 h條件下，孕馬血清和促絨毛膜性腺激素劑量分別為60 IU和80 IU，我們選用5月齡長(zhǎng)爪沙鼠，在孕馬血清注射前做了陰道涂片來判斷激素注射時(shí)動(dòng)物的發(fā)情狀況，長(zhǎng)爪沙鼠發(fā)情周期判定標(biāo)準(zhǔn)見圖2。

2．2 長(zhǎng)爪沙鼠精子的獲能培養(yǎng)

沙鼠精子獲能前運(yùn)動(dòng)軌跡呈之字形，獲能后運(yùn)動(dòng)軌跡呈8字形，超激活前后的運(yùn)動(dòng)軌跡見圖3～4。除了觀察沙鼠運(yùn)動(dòng)方式外，我們用金霉素?zé)晒馊旧夹g(shù)對(duì)沙鼠精子獲能狀態(tài)進(jìn)行了觀察， CTC染色后所有精子尾部均染上黃綠色熒光，未獲能精子頂體完整，整個(gè)精子頭部呈強(qiáng)烈的黃綠色熒光(圖5)，獲能后熒光顯著減弱甚至消失(圖6)。

計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)(CASA)結(jié)果表明，在我們實(shí)驗(yàn)室條件下沙鼠精子獲能時(shí)間為4～5 h，平均曲線速度(VCL)最快，為(300.2±9.19)μm/s，因此我們把長(zhǎng)爪沙鼠獲能時(shí)間確定為4～5 h,結(jié)果見表2。

表1 5月齡長(zhǎng)爪沙鼠不同性周期超排結(jié)果Tab.1 Results of superovulation of the 5-month old gerbils

2．3 長(zhǎng)爪沙鼠體外受精

2.3.1 長(zhǎng)爪沙鼠體外受精過程中雄原核和雌原核的觀察

體外受精后8～9 h在清洗胚胎時(shí)可以看到雄原核和雌原核，見圖7～8。

2.3.2 長(zhǎng)爪沙鼠體外受精結(jié)果

體外受精48 h后觀察2-細(xì)胞發(fā)生率 (圖9),實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次,2細(xì)胞發(fā)育率從65%到85%。

2.4 長(zhǎng)爪沙鼠2-細(xì)胞胚胎的體外發(fā)育

2.4.1 體內(nèi)受精后獲得的2-細(xì)胞在體外發(fā)育

我們選用無BSA的KSOM培養(yǎng)基作沙鼠胚胎體外發(fā)育的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，在其中添加不同濃度的BSA，觀察胚胎在其中的發(fā)育。沙鼠超排后與雄鼠合籠，10只動(dòng)物中4只(體重分別55、60、65、66 g)見栓，見栓后第2天取卵，在BSA分別為0、1、4、8 mg/mL 的KSOM液中培養(yǎng)，結(jié)果見表3，圖10。

長(zhǎng)爪沙鼠體內(nèi)受精后在滲透壓分別為260、290、300 mOsm/k的KSOM中培養(yǎng)，培養(yǎng)第0天和第4天結(jié)果見表4,在滲透壓為290 mOsm/kg的KSOM液中胚胎發(fā)育見圖11。

注：A.發(fā)情間期；B.發(fā)情前期；C.發(fā)情期；D.發(fā)情后期。圖2 長(zhǎng)爪沙鼠發(fā)情周期Note.A.Dioestrus phase; B.Pre-estrus phase; C.Estrus phase; D.Metaestrus phase.Fig.2 The Mongolian gerbil estrus cycle

表2 利用計(jì)算機(jī)輔助分析技術(shù)對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠精子在自配的獲能液中不同時(shí)間運(yùn)動(dòng)參數(shù)分析Tab.2 Analysis of the time motion parameters of gerbil sperm in the self-prepared liquid detected by computer-assisted analysis

圖3 沙鼠精子超激活前Fig.3 Before sperm hyperactivation

圖5 獲能前精子Fig.5 A sperm before capacitation

圖6 獲能后精子Fig.6 A sperm after capacitation

圖7 長(zhǎng)爪沙鼠體外受精8～9 h雄原核和雌原核Fig.7 In vitro fertilization of Mongolian gerbils for 8-9 hours,male and female pronuclei

圖8 長(zhǎng)爪沙鼠體外受精8～9 h雄原核和雌原核Fig.8 In vitro fertilization of Mongolian gerbils for 8-9 hours,male and female pronuclei

注：沙鼠2細(xì)胞發(fā)育率分別為A.65%；B.71%；C.73%；D.85%。圖9 沙鼠2細(xì)胞發(fā)育率Note.Crowth rates of gerbils two cells were A.65%,B.71%,C.73%,D.85%Fig.9 Gerbil two-cell growth rates

表3 長(zhǎng)爪沙鼠體內(nèi)受精后胚胎體外發(fā)育Tab.3 In vitro embryo development of the gerbils after in vivo fertilization

表4 體內(nèi)受精后2-cell在不同滲透壓的KSOM液中發(fā)育Tab.4 Development of 2-cells in different osmotic KSOM medium after fertilization in vivo

注：A.BSA-0 mg/mL組，培養(yǎng)第0天，見栓第2天；B.BSA-0 mg/mL組，培養(yǎng)第4天，3個(gè)桑葚胚；C.BSA-1 mg/mL組，培養(yǎng)第0天，見栓第2天;D.BSA-1 mg/mL組，培養(yǎng)第4天，4個(gè)桑葚胚；E.BSA-4 mg/mL組，培養(yǎng)第0天，見栓第2天；F.BSA-4 mg/mL組，培養(yǎng)第4天，2個(gè)囊胚；G.BSA-8 mg/mL組，培養(yǎng)第0天，見栓第2天；H.BSA-8 mg/mL組，培養(yǎng)第4天，2個(gè)桑葚胚。圖10 長(zhǎng)爪沙鼠體內(nèi)受精后在不同BSA濃度的KSOM液中發(fā)育Note.A:BSA-0 mg/mL group,Culture at day 0,twenty 2-cells;B:BSA-0 mg/mL group， culture at day 4,three morulas; C: BSA-1 mg/mL group,culture at day 0,twenty-one 2-cells;D: BSA-1 mg/mL group,culture at day 4,four morulas; E: BSA-4 mg/mL group,culture at day 0,twenty-four 2-cells; F: BSA-4 mg/mL group,culture at day 4,two blastulas); G: BSA-8 mg/mL group,culture at day 0,twenty-six 2-cells;H: BSA-8 mg/mL group,culture at day 4,two morulas).Fig.10 Development of 2-cells in different concentrations of BSA in KSOM medium after fertilization in vivo

2．4．2 體外受精后體外培養(yǎng)

長(zhǎng)爪沙鼠體外受精后在BSA濃度分別為4、8、 20 mg/mL 的KSOM液培養(yǎng)，培養(yǎng)第0天和第3天結(jié)果見表5。

注：A.培養(yǎng)第0天；B.培養(yǎng)第2天；C.培養(yǎng)第4天。圖11 滲透壓為290 mOsm/kg的KSOM中胚胎發(fā)育Note.A.Culture day 0;B.Culture day 2;C.Culture day 4.Fig.11 Development of 2-cells in the 290 mOsm/kg KSOM culture medium after fertilization in vivo

表5 體外受精后2-cell在改良后的KSOM中發(fā)育Tab.5 Development of 2-cells in the modified KSOM culture medium after in vitro fertilization

3 討論

3．1 實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)爪沙鼠的超數(shù)排卵

超數(shù)排卵技術(shù)是利用促性腺激素刺激卵泡,卵巢中的優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)目增加,從而增加排卵數(shù)，超排處理是保證體外受精卵源的重要條件。正常長(zhǎng)爪沙鼠性周期4～7 d[6]，長(zhǎng)爪沙鼠的超排不像小鼠那樣穩(wěn)定集中，且不同發(fā)情周期的長(zhǎng)爪沙鼠對(duì)激素的感應(yīng)性不同，導(dǎo)致成年長(zhǎng)爪沙鼠的超排個(gè)體間差異顯著。對(duì)于長(zhǎng)爪沙鼠的超排，我們實(shí)驗(yàn)室使用寧波第二激素廠生產(chǎn)的孕馬血清和促絨毛膜性腺激素，激素劑量為40 IU,體內(nèi)受精間隔為96 h，體外受精激素間隔為100 h，平均超排卵20枚左右?？紤]性周周期的話，我們數(shù)據(jù)表明發(fā)情后期開始激素處理效果較好。一般情況下，3月齡左右，體重50 g的雌性沙鼠即可達(dá)到性成熟，在雄性沙鼠的誘導(dǎo)下，即可進(jìn)入發(fā)情周期。發(fā)情期的沙鼠陰道口大開，陰門紅腫，有時(shí)發(fā)紫，陰道口濕潤(rùn)，有時(shí)陰道口可見白色分泌物，愿接受雄鼠爬跨，陰道涂片觀察可見角質(zhì)細(xì)胞很多，有時(shí)夾雜有核細(xì)胞，另有很多梭狀黏液混雜其中；而間情期的雌鼠陰道口關(guān)閉或開口很小，涂片中有少量的白細(xì)胞及有核細(xì)胞；發(fā)情前期陰道口開，粉紅色，陰道口有時(shí)濕潤(rùn)，涂片中有很多有核細(xì)胞、少量角質(zhì)細(xì)胞，有時(shí)有梭狀黏液；發(fā)情后期陰道口開，有消腫跡象，發(fā)情后期的早期角質(zhì)細(xì)胞很多，成塊，晚期白細(xì)胞多，角質(zhì)細(xì)胞少，有死亡的有核細(xì)胞(圖2)。

3．2 實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)爪沙鼠精子的獲能

哺乳動(dòng)物精子在受精前其運(yùn)動(dòng)方式發(fā)生了很大的變化。剛射出的精子不具備受精能力，需在雌性生殖道內(nèi)或在合適的體外培養(yǎng)環(huán)境下完成獲能，從而順利受精。在此期間精子經(jīng)歷了復(fù)雜的生理變化，運(yùn)動(dòng)方式發(fā)生了很大的改變，運(yùn)動(dòng)更為激烈，呈“鞭打”、“小環(huán)形拋物”等形式，此過程稱為超激活。一般認(rèn)為精子超激活的意義主要在于有利于精子通過輸卵管粘稠介質(zhì)和穿越放射冠的彈性基質(zhì)，增加精子擺脫輸卵管上皮的能力，促使精子順利地在輸卵管中運(yùn)行。沙鼠精子獲能前運(yùn)動(dòng)軌跡呈“之”字形，獲能后運(yùn)動(dòng)軌跡呈“8”字形。

我們使用計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)爪沙鼠精子在自配的獲能液中不同時(shí)間精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)進(jìn)行測(cè)量，初步發(fā)現(xiàn)精子獲能時(shí)間在本實(shí)驗(yàn)室自配的獲能液中4～5 h后運(yùn)動(dòng)速度最大，之后速度變小，提示我們?cè)谖覀儗?shí)驗(yàn)室條件下，沙鼠精子獲能時(shí)間為4～5 h。精子獲能的目的最終還是為了受精，所以IVF和人工受精也許是最令人信服的評(píng)價(jià)精子獲能情況以及受精后胚胎的發(fā)育能力，但是卵母細(xì)胞的質(zhì)量、培養(yǎng)系統(tǒng)、實(shí)驗(yàn)條件、雌性動(dòng)物的健康狀況、生理特征等都可以影響到體外受精的結(jié)果，因此實(shí)驗(yàn)中一定要消除這些不穩(wěn)定因素的影響，另外還要結(jié)合其他指標(biāo)才能對(duì)精子功能做出客觀的評(píng)價(jià)。

3．3 實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)爪沙鼠的體外受精

目前長(zhǎng)爪沙鼠胚胎來源主要是超排后體內(nèi)受精,體外受精技術(shù)國(guó)內(nèi)未見報(bào)道。Mochida等[7]比較沙鼠的體外受精和顯微注射的效果，其體外受精率11%，后來選擇顯微注射，提高為63%，但是顯微注射需要昂貴的儀器。Kimura等[8]沙鼠體外受精率最高為29.8%，我們課題組在前期工作基礎(chǔ)上，研發(fā)了長(zhǎng)爪沙鼠體外受精的獲能液和受精液及細(xì)化了體外受精方法，初步建成長(zhǎng)爪沙鼠體外受精體系，該體系包括長(zhǎng)爪沙鼠的超排、長(zhǎng)爪沙鼠精子獲能、體外受精等步驟，使用該體系，長(zhǎng)爪沙鼠體外受精率可達(dá)到60%以上。

3．4 長(zhǎng)爪沙鼠胚胎的體外發(fā)育

目前小鼠胚胎體外發(fā)育一般使用KSOM或者M(jìn)16,我們選KSOM液作為基礎(chǔ)發(fā)育培養(yǎng)液，在此基礎(chǔ)上調(diào)整BSA的濃度和滲透壓來觀察長(zhǎng)爪沙鼠胚胎的體外發(fā)育情況，在我們實(shí)驗(yàn)室條件下長(zhǎng)爪沙鼠體外胚胎可以發(fā)育到桑葚胚，個(gè)別可以發(fā)育到囊胚，目前長(zhǎng)爪沙鼠體外胚胎體外發(fā)育的培養(yǎng)液還未成熟，還需要進(jìn)一步的研究。

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Establishmentofamodifiedinvitromongoliangerbiloocytefertilizationandembryoculturesystem

GUO Hong-gang1,LI Li2,ZHOU Sheng-lai3,LU Ling-qun1,LI Kun1,DU Jiang-tao1,SHI Qiao-juan1,JIN Xiu-qing1,LI Chang-long4,SA Xiao-ying1,YING Hua-zhong1,CHU Xiao-feng1*

(1.Zhejiang Academy of Medical Sciences,Zhejiang Experimental Animal and Safety Research Laboratory,Hangzhou 310013,China； 2.Hangzhou Disease Prevention and Control Center,Hangzhou 3100212； 3.Experimental Animal Department of China Medical University,Shenyang 110001； 4.Capital Medical University Basic Medical College,Beijing 100069)

ObjectiveTo investigate the feasibility of self-made capacitation liquid forinvitrofertilization of Mongolian gerbils,and to provide a reference for gerbil embryo cryopreservation.MethodsInvitrofertilization of Mongolian gerbil was performed with the self-prepared capacitation solution and semen,and the 2-cell embryos of Mongolian gerbils were culturedinvitrousing an improved KSOM culture medium.ResultsTheinvitrofertilization rate of gerbils was over 60%,and some gerbil 2-cell embryos could develop furtherinvitro.ConclusionsAninvitrofertilization and embryo development system of Mongolian gerbil has been established,but it needs further optimization.

Mongolian gerbil;Invitrofertilization;Invitroculture

CHU Xiao-feng.E-mail: sydw@zjinfo.gov.cn

國(guó)家科技支撐計(jì)劃子課題(No.2015BA109B01-02)；浙江省級(jí)公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃(No.2015C37119)；浙江省衛(wèi)生廳課題(No.2015KYB093)。

郭紅剛(1976-)男，助理研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail: sxguohonggang@163.com

褚曉峰 (1952-)，男，副研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail: sydw@zjinfo.gov.cn

Q95-33

A

1005-4847(2017) 06-0624-08

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.06.007

2017-06-07