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(1.南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001；2.湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

野菊花抗腫瘤活性部位篩選研究

全文婕1,史曉欣1,2,熊潤德1,張開2,喻翠云1,2,賀冬秀1,2*

(1.南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001；2.湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心)

目的篩選野菊花的抗腫瘤活性部位并初步探討其機(jī)制。方法利用形態(tài)觀察、CCK-8、Hoechst染色和劃痕實(shí)驗(yàn)評價(jià)野菊花總提取物(CIE)及其石油醚部位(PEE)、乙酸乙酯部位(EAE)、正丁醇部位提取物(NAE)對人肺癌細(xì)胞A549、人慢性骨髓性白血病細(xì)胞K562、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人肝癌細(xì)胞HepG2的抗腫瘤活性。結(jié)果CIE及PEE、EAE、NAE>150 μg/mL對A549、K562和MCF-7細(xì)胞形態(tài)影響明顯且CIE及PEE、EAE、NAE(150～250 μg/mL)對上述三種細(xì)胞增殖抑制作用呈量效相關(guān)性，PEE對MCF-7細(xì)胞抑制效果最顯著；EAE對MCF-7細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用和遷移抑制作用相對較好。結(jié)論野菊花具有抗腫瘤活性，抗腫瘤活性較強(qiáng)的部位為石油醚和乙酸乙酯部位，其抗腫瘤機(jī)制可能與抑制細(xì)胞增殖、遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，這為進(jìn)一步研究開發(fā)野菊花提供基礎(chǔ)。

野菊花； 腫瘤細(xì)胞； 抗腫瘤活性； 抗腫瘤活性部位

野菊花為菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)的干燥頭狀花序，別名為野黃菊花、苦薏、山菊花、甘菊花。中國藥典記載，野菊花性苦、辛、微寒，具有清熱解毒，瀉火平肝之功效。有學(xué)者認(rèn)為在中醫(yī)辨證論治的指導(dǎo)下，野菊花可用于治療熱毒內(nèi)盛所致的胰腺癌、鼻咽癌、肝癌、淋巴瘤和肺癌等[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，野菊花具有廣譜抗菌、消炎、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老和增強(qiáng)免疫等多種藥理活性[2-3]，有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值和研發(fā)潛力。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，野菊花提取物能抑制髓原白血病細(xì)胞HL60和成骨肉瘤Saos-2等細(xì)胞增殖[4-5]，同時(shí)可聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡[6]。近年研究還發(fā)現(xiàn)，野菊花不同極性部位提取物的藥理活性不同[7-8]。有關(guān)野菊花抗腫瘤作用報(bào)道少，對野菊花抗腫瘤活性部位的篩選也鮮有研究。因此，本文通過形態(tài)觀察法、CCK-8法、Hoechst染色和劃痕實(shí)驗(yàn)評價(jià)野菊花不同極性部位提取物對人肺癌細(xì)胞株A549、人慢性骨髓性白血病細(xì)胞株K562、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和人肝癌細(xì)胞株HepG2的抗腫瘤活性，并篩選出野菊花的最佳抗腫瘤活性部位，為進(jìn)一步開發(fā)野菊花奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1藥材與試劑野菊花購自湖南省長沙市藥材公司；Gibco DMEM培養(yǎng)基購自美國Thermo Fisher科技公司；胎牛血清(FBS)、胰酶細(xì)胞消化液、青鏈霉素雙抗和CCK-8 試劑盒均購自浙江天杭生物公司；MTT購自美國Amresco生物公司；Hoechst 33342 染色試劑盒購于萬類生物科技公司；其它實(shí)驗(yàn)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1 野菊花總提取物(chrysanthemum indicum extract，CIE)、石油醚部位 (Petroleum ether extract，PEE)、乙酸乙酯部位(Ethyl acetate extract，EAE)、正丁醇部位提取物(N-butyl alcohol extract，NAE) 的制備 野菊花干燥，粉碎成粉，過40目藥篩。野菊花粉先以15倍量的70%乙醇浸泡65 ℃加熱回流提取1次、后以12倍量的70%乙醇提取1次，每次2 h。合并兩次濾液，減壓濃縮，冷凍干燥得野菊花總提物CIE。CIE加適量水使之分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(水飽和)萃取，所得萃取物分別減壓蒸干，凍干得野菊花PEE、EAE及NAE。CIE、PEE、EAE及NAE以DMSO復(fù)溶制成0.1 g/mL(以提取物計(jì))原液，0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃避光密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用DMEM+10%FBS+100 U/mL青鏈霉素雙抗培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞處于對數(shù)生長期即用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 取對數(shù)生長期的各腫瘤細(xì)胞，制成濃度1.5×105個(gè)/mL懸液接種至6孔板，每孔2 mL。 培養(yǎng)24 h后加藥處理，使CIE、PEE、EAE及NAE的終濃度為150 μg/mL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 CCK-8法評價(jià)細(xì)胞增殖抑制作用 取對數(shù)生長期的各腫瘤細(xì)胞，制成濃度5×105個(gè)/mL懸液接種至96孔板，每孔100 μL。CIE、PEE、EAE及NAE制備5個(gè)濃度: 250、200、150、100、50 μg/mL，同時(shí)設(shè)陰性對照組和空白對照組，每組復(fù)孔5個(gè)。培養(yǎng)24 h后加藥，藥物處理24 h，每孔加入CCK-8試劑 20 μL，孵育4 h，水平搖床振蕩10 min，酶標(biāo)儀450 nm波長測定OD值。實(shí)驗(yàn)平行3次,根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(Cell Inhibition Rate, IR):

1.2.5 Hoechst染色法觀察MCF-7細(xì)胞凋亡 取MCF-7細(xì)胞按1.2.3中方案接種并培養(yǎng)。PEE、EAE及NAE制備2個(gè)濃度: 150、50 μg/mL。加藥繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出，PBS洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定并使用Hoechst染色試劑染色5 min，再次洗滌，置熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)評價(jià)MCF-7細(xì)胞遷移 取MCF-7細(xì)胞制成濃度為3×105個(gè)/mL懸液，每孔2 mL接種至6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿孔底面積的80%～90%，用200 μL移液槍頭在孔底均勻劃線，PBS洗凈細(xì)胞碎片，加入含PEE、EAE或NAE 50 μg/mL的低血清濃度培養(yǎng)基(2%FBS)，培養(yǎng)24 h后PBS洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，置熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示， SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 各實(shí)驗(yàn)組結(jié)果與陰性對照組的比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 CIE、PEE、EAE和NAE對各腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響A549、MCF-7和K562細(xì)胞經(jīng)CIE處理后細(xì)胞皺縮、破碎，密度降低，但HepG2細(xì)胞經(jīng)CIE處理后，細(xì)胞形態(tài)和密度變化不明顯。由圖1可見， A549、MCF-7和K562經(jīng)由PEE和EAE處理24 h后均出現(xiàn)明顯的皺縮、破碎、胞體暗淡、邊緣粗糙、數(shù)目稀少等情況；而由NAE處理24 h后的三種細(xì)胞形態(tài)與密度較陰性對照組變化不大。

2.2 CIE、PEE、EAE及NAE對各腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用

2.2.1 CIE對A549、K562、MCF-7和HepG2細(xì)胞的作用 如圖 2 所示，與陰性對照相比，CIE在150～250 μg/mL濃度范圍對A549、K562和MCF-7細(xì)胞增殖均有抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中， CIE對MCF-7細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng)但不呈濃度相關(guān)性；對A549及K562細(xì)胞增殖抑制強(qiáng)度次之并呈現(xiàn)較好的濃度相關(guān)性。CIE對HepG2細(xì)胞無增殖抑制效果，反而呈與劑量相關(guān)的促增殖作用。

圖1 野菊花PEE、EAE、NAE對腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響(24 h，100×)

圖2 CIE對腫瘤細(xì)胞增殖抑制作(24 h后與陰性對照組相比，*P<0.05，n=3)

2.2.2 PEE、EAE及NAE對A549、K562和MCF-7細(xì)胞的作用 如圖3所示，與陰性對照相比， 濃度為50～250 μg/mL的PEE與EAE對MCF-7和K562細(xì)胞增殖呈劑量依賴性強(qiáng)抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而對A549細(xì)胞的作用較弱；NAE對A549及K562細(xì)胞的抑制效果不明顯，對MCF-7細(xì)胞具有一定的增殖抑制作用，但其強(qiáng)度明顯弱于PEE和EAE，且非濃度依賴。

2.3 PEE、EAE及NAE對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

MCF-7細(xì)胞經(jīng)過兩個(gè)不同濃度PEE、EAE和 NAE處理后的Hoechst33342染色結(jié)果如圖4所示。與50 μg/mL處理組相比，100 μg/mL PEE、EAE處理后的MCF-7細(xì)胞密度明顯變小，形成致密濃染的細(xì)胞核數(shù)目更多。結(jié)果表明，PEE、EAE對MCF-7細(xì)胞有一定的凋亡誘導(dǎo)作用。

圖3 PEE、EAE及NAE對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用 24 h后與陰性對照組相比，*P<0.05，n=3A：對A549細(xì)胞增殖抑作用；B：對K562細(xì)胞增殖抑制作用；C：對MCF-7細(xì)胞增殖抑制作用

圖4 PEE、EAE及NAE對MCF-7細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用(24 h，Hoechst染色，100×)

2.4 PEE、EAE及NAE對MCF-7細(xì)胞遷移的影響MCF-7細(xì)胞經(jīng)PEE、EAE及NAE處理24 h后，細(xì)胞向劃痕空白部位遷移情況如圖5所示。與陰性對照相比，EAE處理組細(xì)胞向劃痕空白處遷移數(shù)目極少，而其它處理組均有較多細(xì)胞遷移；提示EAE對MCF-7細(xì)胞的遷移的抑制效果最好，而PEE和NAE作用次之。

圖5 PEE、EAE及NAE對MCF-7細(xì)胞遷移的影響(24 h，40×)

3 討 論

野菊花提取實(shí)驗(yàn)選擇乙醇為提取溶劑的原因在于，乙醇提取效果好，易于回收和處理，且更加安全低毒[9]。采用單因素輪換法對影響野菊花提取物的提取效率的因素(乙醇水溶液的濃度、加入料液比例、提取時(shí)間和提取次數(shù)等)進(jìn)行優(yōu)化，加入12倍量的70%乙醇(考慮干燥藥材粉末需吸水溶脹，第一次加入15倍量)，65 ℃提取2次，每次2h，提取效果較好，所得CIE產(chǎn)物相對較高，方法亦較為簡便經(jīng)濟(jì)。

CIE對HepG2細(xì)胞增殖不抑反促，很可能由于CIE中含有對HepG2細(xì)胞產(chǎn)生營養(yǎng)和促進(jìn)生長作用的某些成分，而并不含能對其產(chǎn)生抑制作用的成分；或產(chǎn)生抑制作用的成分尚達(dá)不到有效濃度。另外，三個(gè)極性部位中僅有NAE對MCF-7細(xì)胞的作用不呈濃度依賴，因此我們推測，CIE對MCF-7細(xì)胞作用沒有濃度相關(guān)性，可能與存在于NAE中的某些成分的作用有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示野菊花抗腫瘤活性較強(qiáng)的部位為石油醚(PEE)和乙酸乙酯部位(EAE)，這與文獻(xiàn)報(bào)道野菊花的乙酸乙酯部位提取物具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的作用相一致[10]。已有研究證明，野菊花醇提物的石油醚和乙酸乙酯萃取部位主要含萜類及黃酮類化合物[11]；且萜類及黃酮類化合物的抗腫瘤作用近來已有諸多報(bào)道，如從野菊花中分離得到的三萜類能抑制小鼠皮膚腫瘤的活性[12]，黃酮類成分芹菜素通過抑制STAT3信號誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[13]，木犀草素具有一定的抗乳腺癌活性[14]。本文推測，野菊花中的抗腫瘤的活性成分可能為萜類、黃酮和脂類生物堿。本研究為后期分離獲得單個(gè)或一系列抗腫瘤活性的單體化合物提供研究方向。

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ScreeningofantitumoractivefractionsofChrysanthemumIndicum

QUAN Wenjie, SHI Xiaoxin, XIONG Runde, et al

(InstituteofPharmacy&Pharmacology,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo evaluate the antitumor activity and screen the antitumor activity fractions of Chrysanthemum Indicum.MethodsMorphological observation,CCK-8,Hoechst nuclei staining and wound healing assay were used to evaluate the antitumor activity of CIE，PEE，EAE and NAE in tumor cells including human lung cancer cells (A549), human erythroleukemia cells (K562), human breast cancer cells (MCF-7), and human liver cancer cells (HepG2).ResultsShrinkage and fragmentation of cells could be seen obviously under the fluorescent inverted microscope when A549, K562 and MCF-7 cells were treated with CIE，PEE，EAE，NAE when their concentrations were above 150μg/mL. The proliferation of A549,K562 and MCF-7 cells can be inhibited by CIE，PEE，EAE，NAE in a dose-dependent manner in the concentration from 150μg/mL to 250μg/mL, PEE showed the best inhibition effects in MCF-7. EAE showed the best apoptosis-inducing effect in MCF-7, and did the best in resisting MCF-7 cell migration .ConclusionChrysanthemum indicum has antitumor activity and its mechanism might be associated with induction of apoptosis and inhibition of migration; the antitumor activity sites were the petroleum ether and ethyl acetate fractions, which provides the basis for further study in single compounds isolation.

Chrysanthemum indicum; tumor cells; antitumor activity; screening of antitumor activity fractions

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.007

2016-12-31；

2017-03-23

湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(201412)；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(16K079).

*通訊作者，E-mail：1025165380@qq.com.

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蔣湘蓮)