陳修報(bào)，劉洪波，蘇彥平，姜 濤，楊 健

鎘對(duì)“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌的急性毒性及脂質(zhì)過氧化和DNA損傷的影響

陳修報(bào)，劉洪波，蘇彥平，姜 濤，楊 健*

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)和資源養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214081）

為了探究“淡水貝類觀察”研究體系的專用指示生物“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌（Anodonta woodiana）對(duì)鎘（Cd2+）的毒性效應(yīng)，研究了Cd2+對(duì)鉤介幼蟲（＜24 h，平均殼長(zhǎng)0.25 mm）、稚蚌（＜5 d，平均殼長(zhǎng) 0.27 mm）和幼蚌（6 months，平均殼長(zhǎng) 50 mm）的急性毒性，并針對(duì)Cd2+積累的靶器官——鰓，分析了幼蚌脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）、成蚌（48 months，平均殼長(zhǎng)85 mm）DNA損傷（OTM）對(duì)Cd2+的響應(yīng)特征。結(jié)果表明：Cd2+對(duì)鉤介幼蟲 24 h半效應(yīng)濃度（EC50）為 0.001 8 mg·L-1，對(duì)稚蚌和幼蚌 96 h EC50分別為0.004 7、4.5 mg·L-1；Cd2+濃度0.05 mg·L-1和0.5 mg·L-1暴露組MDA含量隨時(shí)間延長(zhǎng)呈降低的趨勢(shì)，MDA含量變化與Cd2+濃度之間不相關(guān)（P＞0.05）；OTM隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高的趨勢(shì)，OTM變化和Cd2+濃度之間表現(xiàn)為顯著的線性正相關(guān)（p＜0.05）。研究認(rèn)為，鉤介幼蟲和稚蚌有作為Cd2+的靈敏受試物種的潛力，幼蚌和成蚌適于Cd2+污染的監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)，OTM可作為Cd2+污染預(yù)警的生物標(biāo)志物。

“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌；生活史階段；鎘；急性毒性；生物標(biāo)志物

我國(guó)漁業(yè)生態(tài)環(huán)境的鎘（Cd2+）污染形勢(shì)嚴(yán)峻。《2015年中國(guó)漁業(yè)生態(tài)環(huán)境狀況公報(bào)》指出，我國(guó)江河天然重要漁業(yè)水域中Cd2+的超標(biāo)面積為2.1%（約1萬hm2），國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)（內(nèi)陸）Cd2+的超標(biāo)面積為2.7%（約10萬hm2）[1]。因其具有來源廣、積蓄性、難以降解、易于沿食物鏈發(fā)生生物放大作用等特點(diǎn)，成為對(duì)水生生物和人類危害最大的污染物之一[2]。因此，對(duì)Cd2+的有效監(jiān)測(cè)和毒性評(píng)價(jià)研究刻不容緩。

背角無齒蚌（Anodonta woodiana）具有營(yíng)底棲生活、地理分布廣泛、對(duì)污染物的高富集性和低代謝性、污染物積累量與水環(huán)境中污染物含量簡(jiǎn)單相關(guān)等特點(diǎn)[3-4]，被篩選為“淡水貝類觀察”研究體系的專用指示生物[3]?；诓杉吧辰菬o齒蚌[3，5-6]及移殖“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌（人工繁育的生物因子相同、遺傳質(zhì)量穩(wěn)定、污染本底值低）[7-8]，已成功監(jiān)測(cè)水環(huán)境Cd2+等重金屬的污染狀況。移殖監(jiān)測(cè)在顯示指示物可比性強(qiáng)、可以按照監(jiān)測(cè)的需求被移殖到任何水域、能夠反映污染時(shí)間動(dòng)態(tài)等優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，也存在貝類死亡率從0～100%巨大差異的制約因素[9]，這可能與貝類所處的生長(zhǎng)階段不同以及水域環(huán)境條件之間的差別（如重金屬含量不同）有關(guān)。因此，有必要弄清不同生活史階段的“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌對(duì)Cd2+等重金屬的耐受性。

應(yīng)用生物標(biāo)志物有望對(duì)重金屬污染起到早期預(yù)警作用。研究初步顯示，貝類的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）[10-11]和 DNA 損傷[12-13]對(duì) Cd2+的響應(yīng)較為快速、靈敏。邢慧芳等[11]用Cd2+對(duì)背角無齒蚌進(jìn)行96 h暴露，鰓和外套膜中MDA含量呈升高趨勢(shì)；Kolarevic′等[13]發(fā)現(xiàn)背角無齒蚌的血細(xì)胞DNA損傷（以O(shè)live尾矩表示，OTM）能夠反映出自然水體Cd2+的季節(jié)性變化動(dòng)態(tài)。然而，這些研究?jī)H局限于野生的背角無齒蚌成蚌。

針對(duì)上述問題，本研究擬在前人報(bào)道背角無齒蚌成蚌及鰓MDA對(duì)Cd2+毒性效應(yīng)的基礎(chǔ)上[11]，就Cd2+對(duì)“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌的鉤介幼蟲、稚蚌和幼蚌的急性毒性開展研究，進(jìn)而以鰓（Cd2+積累的關(guān)鍵靶器官[14-15]）作為研究對(duì)象，探索在移殖監(jiān)測(cè)中被廣泛選用的“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌幼蚌/成蚌[7-8]對(duì)Cd2+的MDA、OTM響應(yīng)特征。以期為漁業(yè)生態(tài)環(huán)境Cd2+污染的移殖監(jiān)測(cè)、早期預(yù)警，以及淡水貝類資源保護(hù)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

不同生活史階段的“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌，包括鉤介幼蟲（＜24 h，平均殼長(zhǎng) 0.25 mm）、稚蚌（＜5 d，平均殼長(zhǎng)0.27 mm）、幼蚌（6月，平均殼長(zhǎng)50 mm）和成蚌（48月，平均殼長(zhǎng)85 mm），均來自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉實(shí)驗(yàn)基地，其人工繁養(yǎng)方法、水環(huán)境條件見參考文獻(xiàn)[16-17]。挑選出發(fā)育成熟的母蚌，用針筒沖洗出外鰓中孕育的鉤介幼蟲。以黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）為宿主魚，每條宿主魚寄生的鉤介幼蟲達(dá)1672±787個(gè)（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，下同；n=6），變態(tài)成功率達(dá)（53.3±12.1）%，選取脫落高峰期的稚蚌進(jìn)行流水培育和池塘吊養(yǎng)，進(jìn)而生長(zhǎng)發(fā)育為幼蚌和成蚌。

氯化鎘（CdCl2）為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)?？偟鞍缀蚆DA用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、二甲基亞砜（DMSO）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）和溴化乙錠（EB）等來自上海生工生物工程有限公司。

1.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)

鑒于我國(guó)尚缺乏淡水貝類的毒性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，因此，本研究參照在業(yè)內(nèi)被廣泛認(rèn)可的美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)方法“Standard guide for conducting laboratory toxicity tests with freshwater mussel”（ASTM E2455-06）[18]進(jìn)行 Cd2+的急性毒性研究。

1.2.1 鉤介幼蟲的急性毒性

鉤介幼蟲的成活率大于90%方可用于暴露實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)成活率的方法：吸取約100只鉤介幼蟲放入盛有2 mL去離子水的培養(yǎng)皿中，加一滴NaCl飽和溶液，并在1 min內(nèi)記錄開殼和閉殼鉤介幼蟲的數(shù)量。加入NaCl溶液后，閉殼的鉤介幼蟲定義為存活的個(gè)體，而加入NaCl溶液前閉殼的及加入NaCl溶液后開殼的鉤介幼蟲定義為死亡個(gè)體。存活率的計(jì)算：

存活率=（加NaCl后閉殼的鉤介幼蟲數(shù)量-加NaCl前閉殼的鉤介幼蟲數(shù)量）/鉤介幼蟲總數(shù)×100%

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用人工配制軟水（表1）[18]設(shè)定5 個(gè) Cd2+濃度梯度，依次為 2.5、5.0、10、20、40 μg·L-1，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各設(shè)置3個(gè)平行。用500 mL玻璃培養(yǎng)皿作實(shí)驗(yàn)容器，實(shí)驗(yàn)液200 mL，每個(gè)培養(yǎng)皿各加入約1000個(gè)鉤介幼蟲。將培養(yǎng)皿置于智能光照培養(yǎng)箱中（PGX-250A，無錫沃信儀器有限公司），水溫保持在 20±1℃，16 h光照，8 h黑暗，光照強(qiáng)度 1000 lx，溶解氧（DO）大于 5.0 mg·L-1。實(shí)驗(yàn)持續(xù) 24 h，并于 6 h 和24 h分別取約100個(gè)鉤介幼蟲進(jìn)行檢查。

1.2.2 稚蚌的急性毒性

將稚蚌暫養(yǎng)48 h后用于實(shí)驗(yàn)。在5 min之內(nèi)，斧足伸出運(yùn)動(dòng)的稚蚌定義為活蚌，否則即認(rèn)為是死亡個(gè)體。稚蚌存活率的計(jì)算：

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以人工配制軟水設(shè)定5個(gè)Cd2+濃度梯度，依次為 2.5、5.0、10、20、40 μg·L-1，設(shè)置 4個(gè)平行。用500 mL玻璃培養(yǎng)皿作實(shí)驗(yàn)容器，實(shí)驗(yàn)液200 mL，每個(gè)培養(yǎng)皿加入5個(gè)稚蚌，每48 h更換75%的實(shí)驗(yàn)液以保持Cd2+濃度穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)期間不投餌。實(shí)驗(yàn)條件同1.2.1，于48 h和96 h分別檢查各組稚蚌的成活率。實(shí)驗(yàn)期間要求對(duì)照組的成活率大于90%。

1.2.3 幼蚌的急性毒性

將幼蚌暫養(yǎng)48 h后用于實(shí)驗(yàn)。美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)中判別幼蚌死亡的方法同上述稚蚌[18]。然而，背角無齒蚌幼蚌具有將斧足縮在貝殼內(nèi)保持長(zhǎng)時(shí)間不運(yùn)動(dòng)的特殊習(xí)性，遇到外界刺激更是采取緊閉雙殼的保護(hù)措施[19]，且貝殼不再透明無法看到內(nèi)部斧足是否運(yùn)動(dòng)[17]，所以該判別方法對(duì)背角無齒蚌幼蚌是無效的。針對(duì)此問題，本研究提出以幼蚌雙殼張開（包括雙殼閉合但用開殼器打開后不能恢復(fù)閉殼），用玻璃棒刺激不閉殼為死亡標(biāo)準(zhǔn)，即：

存活率=（幼蚌總數(shù)-雙殼張開且刺激不閉殼的幼蚌數(shù)量）/幼蚌總數(shù)×100%

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用人工配制軟水設(shè)定0.625、1.25、2.5、5.0、10 mg·L-1的 Cd2+濃度梯度，設(shè)置 4 個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)于貝類重金屬暴露系統(tǒng)（上海海圣水族設(shè)備廠）中進(jìn)行，向10 L一次成型的玻璃缸加入實(shí)驗(yàn)液2 L，每個(gè)玻璃缸加入5個(gè)幼蚌，于48 h更換75%的實(shí)驗(yàn)液以保持Cd2+濃度穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)期間不投餌。其他實(shí)驗(yàn)條件同1.2.1，于48 h和96 h分別檢查各組幼蚌的成活率。實(shí)驗(yàn)期間要求對(duì)照組的成活率大于90%。

1.3 幼蚌鰓脂質(zhì)過氧化測(cè)定

根據(jù)Cd2+對(duì)幼蚌的安全濃度即96 h半效應(yīng)濃度（EC50）×0.1[20]，設(shè)計(jì) 3 個(gè) Cd2+濃度梯度 0.005、0.05、0.5 mg·L-1，以人工配制軟水為對(duì)照組，各設(shè)置3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)條件同1.2.3，于0、48 h和96 h分別從各濃度組取3只蚌。解剖分離出幼蚌的鰓，按質(zhì)量體積比為1∶9加4℃預(yù)冷的生理鹽水制備成10%的組織勻漿。勻漿液于 4℃，2500 r·min-1，離心 10 min獲取上清液，用總蛋白定量測(cè)試盒（BCA法）測(cè)定總蛋白含量。勻漿液于95℃水浴80 min，流水冷卻后4000 r·min-1離心10 min獲取上清液，用MDA測(cè)試盒（TBA法）測(cè)定MDA含量。

1.4 成蚌鰓DNA損傷測(cè)定

根據(jù) Cd2+對(duì)成蚌的 96 h EC50為 134.9 mg·L-1[11]，即安全濃度為13.5 mg·L-1，設(shè)計(jì)3個(gè)Cd2+濃度梯度2.5、5.0、10 mg·L-1，以人工配制軟水為對(duì)照組，各設(shè)置3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)條件同1.2.3，于0、48 h和96 h分別從各濃度組取3只蚌。

參考Singh等[21]的方法測(cè)定DNA損傷：調(diào)整細(xì)胞濃度約1×105cell·mL-1，將單細(xì)胞懸液與0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖按1∶10混合均勻后，取75 μL均勻加入到彗星分析專用載玻片（3-Well Comet Slides，美國(guó)Cell Biolabs）的凹槽中；于裂解液（100 mmol·L-1Na2EDTA，2.5 mol·L-1NaCl，10 mmol·L-1Tris，用 NaOH 調(diào)節(jié) pH為10，臨用前加10%的DMSO和l%的Triton X-100）中裂解 2 h；再用堿性電泳液（300 mmol·L-1NaOH，1 mmol·L-1Na2EDTA，pH 值為 13）解旋 30 min，調(diào)節(jié)電壓為 25 V、電流為 300 mA，電泳 20 min（DYY-6，北京六一儀器廠），中和（0.4 mol·L-1Tris，pH 值為 7.5）2 次后，用 75%乙醇固定，最后用 2 μg·mL-1EB染色 20 s。在熒光顯微鏡（BX51，日本 Olympus）的 515～560 nm的激發(fā)光下，放大200倍，每組隨機(jī)觀察30個(gè)細(xì)胞并拍照。用CASP彗星圖像分析軟件測(cè)定Olive尾矩（OTM），OTM=（尾部密度重心-頭部密度重心）/尾部DNA含量[22]。

表1 人工配制軟水的配制方法及水質(zhì)指標(biāo)Table 1 Quantities of chemicals required to prepare reconstituted soft water and the resulting water qualities

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用概率單位分析（Probit Analysis）計(jì)算 EC50[23]。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）對(duì)MDA含量和OTM進(jìn)行組間差異性分析，p＜0.05表示差異水平顯著。用Pearson等級(jí)相關(guān)系數(shù)分析MDA含量、OTM與Cd2+濃度之間的相關(guān)性，并回歸分析變量之間的關(guān)系[24]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同生活史階段的背角無齒蚌對(duì)Cd2+的敏感性

不同時(shí)間點(diǎn)，各濃度Cd2+暴露下鉤介幼蟲、稚蚌和幼蚌的死亡率見表2。受到Cd2+脅迫，鉤介幼蟲表現(xiàn)出聚集成團(tuán)的趨勢(shì)，稚蚌和幼蚌則表現(xiàn)為活動(dòng)能力減弱、軟組織粘液分泌增加，直至雙殼張開而死亡。Cd2+對(duì)鉤介幼蟲 6、24 h的 EC50分別為 0.033 8、0.001 8 mg·L-1；對(duì)稚蚌 48、96 h 的 EC50分別為 0.007 5、0.0047 mg·L-1；對(duì)幼蚌96h的EC50為4.5mg·L-1（表2）。

Cd2+對(duì)生物體的毒性機(jī)制包括鎘-蛋白質(zhì)互作、鎘-鈣互作、鎘-基因表達(dá)互作、氧化損傷和DNA損傷[25]。因此，暴露于Cd2+中的“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌發(fā)生了行為改變，并且死亡率明顯增加。

鉤介幼蟲是淡水蚌類生活史中特有的階段。背角無齒蚌的鉤介幼蟲由殼（包含殼鉤）、外套膜、閉殼肌和足絲等簡(jiǎn)單器官構(gòu)成，尚不能夠獨(dú)立存活（需寄生到魚體完成變態(tài)發(fā)育）[16]。因此，本研究對(duì)鉤介幼蟲最長(zhǎng)只進(jìn)行了24 h的暴露，與Liu等[26]研究一致?！皹?biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌鉤介幼蟲對(duì)Cd2+特別敏感，24 h EC50（0.001 8 mg·L-1）明顯低于同為無齒蚌屬的Anodonta anatine鉤介幼蟲[27]（24 h EC50約為0.75 mg·L-1）、淡水溝貝鉤介幼蟲[23]（24hEC50大于0.008mg·L-1），以及毒理學(xué)常用試驗(yàn)物種大型蚤（Daphnia magna），其在pH為7.0時(shí)的24 h EC50為0.42 mg·L-1[28]。這可能是由于前者為有鉤型且殼鉤粗壯[16]，遇到Cd2+的脅迫無法閉緊雙殼，從而難以發(fā)揮貝類解毒機(jī)制第一道防線（閉緊雙殼）[29]的保護(hù)作用。值得注意的是，Cd2+對(duì)“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌鉤介幼蟲的24 h EC50還低于我國(guó)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB 11607—1989）規(guī)定的 Cd2+限量（0.005 mg·L-1）[30]，提示我國(guó)現(xiàn)行的漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)似乎無法對(duì)其進(jìn)行有效保護(hù)。這可能是我國(guó)背角無齒蚌資源量銳減[17]的一個(gè)重要原因，同時(shí)也表明它有潛力作為Cd2+水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)研究的受試物種。鑒于鉤介幼蟲的規(guī)格較?。ㄆ骄鶜らL(zhǎng)為256 μm[16]），在自然水域中難以采集[29]，通過人工培育或采集野生的孕育母蚌，從而獲取足夠的成熟鉤介幼蟲作為受試生物，已被嘗試應(yīng)用于漁業(yè)水質(zhì)基/標(biāo)準(zhǔn)的修訂[23]。

稚蚌已具有獨(dú)立存活能力，但是其對(duì)外界脅迫仍很敏感[16]?！皹?biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌稚蚌對(duì)Cd2+的敏感性明顯高于其他水生生物，如淡水溝貝稚蚌（5 d）對(duì)Cd2+毒性的 48 h EC50為 0.042 mg·L-1，96 h EC50為 0.016 mg·L-1，分別是背角無齒蚌稚蚌的5倍和3倍以上[23]；花鰱（Aristichthys nobills）仔魚（10 h）、幼魚（10 d）和魚苗（50 d）對(duì) Cd2+的 96 h LC50分別為 0.24、0.54、2.25 mg·L-1[31]。這可能是由兩方面原因造成的：一是剛脫落的背角無齒蚌稚蚌的殼鉤尚未退化完全，稚蚌和鉤介幼蟲一樣不能緊閉雙殼，從而無法阻止水體中Cd2+通過濾水和滲透進(jìn)入體內(nèi)；二是鰓此時(shí)還處于鰓原基階段[17]，不能高效積累Cd2+。值得注意的是，Cd2+對(duì)“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌稚蚌的96 h EC50（0.004 7 mg·L-1）依然低于我國(guó)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的Cd2+限量[30]，提示我國(guó)現(xiàn)行的漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)似乎無法有效保護(hù)稚蚌。利用稚蚌對(duì)Cd2+等重金屬的敏感性特點(diǎn)，人工繁育的稚蚌被嘗試用作受試生物，以探索建立漁業(yè)水質(zhì)Cd2+等污染物限量的新標(biāo)準(zhǔn)[23，32]。

表2 鎘對(duì)不同生活史階段“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌的死亡率（Mean±SD）和半效應(yīng)濃度Table 2 Mortality rate（Mean±SD）and median effect concentrations（EC50）in acute toxicity tests with Cd2+for“standardized”Anodonta woodiana at different life stages

“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌幼蚌生長(zhǎng)到60 d以后，外部形態(tài)已接近成體，內(nèi)部器官包括鰓、斧足、內(nèi)臟團(tuán)、心臟、腸道等也已發(fā)育完全[17]。因此，幼蚌對(duì)Cd2+的耐受性比鉤介幼蟲、稚蚌顯著增加（表1），也高于淡水溝貝幼蚌（6 months）對(duì)Cd2+的耐受性[23]（96 h EC50為0.199 mg·L-1）。隨著背角無齒蚌的生長(zhǎng)，其對(duì) Cd2+的耐受性也會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)，如成蚌對(duì)Cd2+的96 h EC50可高達(dá)134.9 mg·L-1[11]。這與背角無齒蚌解毒功能的完善是分不開的。首先，幼蚌/成蚌能夠緊閉雙殼，通過減少濾水率和呼吸率以阻止對(duì)水體中Cd2+的吸收[19，29]；其次，它們能夠產(chǎn)生大量的金屬硫蛋白與Cd2+絡(luò)合[33]，大幅度降低體內(nèi)Cd2+的毒性[29]。這提示“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌發(fā)育到幼蚌以后便適宜用于漁業(yè)生態(tài)環(huán)境Cd2+的污染監(jiān)測(cè)。筆者課題組之前的研究顯示[3]，背角無齒蚌成蚌對(duì)Cd的積累可高達(dá)53 μg·g-1。

值得注意的是，由于我國(guó)目前尚無淡水貝類的毒性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，基于淡水貝類開展的毒理學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)條件尚不統(tǒng)一，如實(shí)驗(yàn)用水的選擇就分為曝氣自來水[11，33]、去離子水[34]和人工配制水[26]等。而 Cd2+等重金屬對(duì)水生生物的毒性，會(huì)受到水體的硬度、溫度、pH值和溶解性有機(jī)物含量等理化因子的影響[28，34-35]，從而難以準(zhǔn)確掌握它們的毒性及受試生物的敏感性。鑒于此，可以參考美國(guó)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)（ASTME2455-06）[18]，并結(jié)合我國(guó)本土物種的特點(diǎn)和水質(zhì)因子狀況，建立較為標(biāo)準(zhǔn)的基于淡水貝類的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)規(guī)范，以有效保護(hù)我國(guó)淡水貝類資源。

2.2 Cd2+對(duì)幼蚌鰓MDA含量的影響

不同濃度Cd2+暴露48、96 h均對(duì)幼蚌鰓MDA產(chǎn)生了明顯影響（圖 1）。MDA 最高值（27.7 nmol·mg-1）出現(xiàn)在0.005 mg·L-1暴露48 h的組別，而最低值（0.3 nmol·mg-1）出現(xiàn)在 0.05 mg·L-1暴露 96 h 的組別。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，0.05 mg·L-1和 0.5 mg·L-1暴露組 MDA含量變化呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，各組別MDA含量變化與Cd2+濃度之間不相關(guān)（P＞0.05）。

脂質(zhì)過氧化發(fā)生在生物膜上，是Cd2+等有毒物質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）增加，氧自由基攻擊多不飽和脂肪酸（PUFA）的一種不斷加合重復(fù)的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的MDA含量能夠反映Cd2+對(duì)機(jī)體的損傷程度[10]。

圖1 鎘對(duì)“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌幼蚌鰓MDA含量的影響Figure 1 Impact of Cd2+on MDA contents in gills of“standardized”Anodonta woodiana juveniles

本研究顯示除了低濃度組（0.005 mg·L-1）的MDA呈現(xiàn)“誘導(dǎo)-抑制”的變化規(guī)律之外，其他組別總體上表現(xiàn)為抑制作用（圖1）。這應(yīng)該與“毒物興奮效應(yīng)”（Hormesis）有關(guān)，即低劑量化學(xué)物對(duì)生物體代謝表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)，而高劑量時(shí)表現(xiàn)為抑制作用[36]?！皹?biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌幼蚌MDA的這種變化趨勢(shì)與海洋貽貝 Bathymodiolus azoricus[10]和褶紋冠蚌（Cristaria plicata）[37]類似，卻有別于背角無齒蚌成蚌對(duì)Cd2+毒性響應(yīng)為MDA含量不斷升高[11]。這可能是由于暴露成蚌的Cd2+濃度很高（濃度梯度為 4.22、8.43、16.82、33.7、67.45 mg·L-1）[11]，致使其抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，超出了自我恢復(fù)能力。而本研究中暴露幼蚌的Cd2+濃度相對(duì)較低，有機(jī)體能夠發(fā)揮“毒物興奮效應(yīng)”功能，表現(xiàn)為盡快修復(fù)脅迫引起的損傷，并保護(hù)生物體在其后的脅迫中免受或少受傷害[36]。也許正因?yàn)槿绱耍装鯩DA含量和Cd2+濃度之間沒有表現(xiàn)出明顯的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系。

2.3 Cd2+對(duì)成蚌鰓DNA損傷的影響

圖2為CASP軟件分析Cd2+誘導(dǎo)成蚌鰓細(xì)胞DNA損傷的彗星圖像。對(duì)比圖片可以看出，Cd2+暴露對(duì)成蚌鰓細(xì)胞DNA產(chǎn)生明顯的損傷作用。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)、Cd濃度的增加，OTM均呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)（圖3）。暴露48 h和96 h，OTM變化和Cd2+濃度之間均表現(xiàn)為顯著的線性正相關(guān)（p＜0.05，圖4）。

OTM綜合了距離類和強(qiáng)度類指標(biāo)，比彗星長(zhǎng)度、彗尾長(zhǎng)度、尾部DNA含量等單一指標(biāo)能更靈敏、精確和全面地反映DNA的損傷程度[13，22]，被廣泛應(yīng)用于海、淡水貝類對(duì)重金屬如Cd2+的污染監(jiān)測(cè)和毒性評(píng)價(jià)[13，38]。

圖2 CASP軟件分析Cd2+暴露“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌96 h的鰓細(xì)胞DNA損傷的彗星圖像（×200）Figure 2 CASP software analyze comet images of DNA damage in gill cells of“standardized”Anodonta woodiana adults induced by Cd2+for 96 h（×200）

圖3 鎘對(duì)“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌成蚌鰓細(xì)胞DNA損傷（OTM）的影響Figure 3 Impact of Cd2+on DNA damage（OTM）in gills of“standardized”Anodonta woodiana adults

圖4 “標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌成蚌鰓細(xì)胞DNA損傷（OTM）與Cd2+濃度之間的關(guān)系Figure 4 Relationships between DNA damage（OTM）in gills of“standardized”Anodonta woodiana adults and Cd2+concentrations

“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌成蚌鰓細(xì)胞的OTM隨著Cd2+暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)明顯的升高趨勢(shì)（圖3），且表現(xiàn)出顯著的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系（圖4）。這和斑馬貽貝（Dreissena polymorpha）鰓細(xì)胞 OTM[38]及銅銹環(huán)棱螺（Bellamya aeruginosa）肝胰腺 OTM[34]對(duì) Cd2+的響應(yīng)趨勢(shì)相一致，卻有別于背角無齒蚌血細(xì)胞OTM對(duì)Cd2+不存在明顯的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系（r=0.306，P=0.309 3）[13]，初步顯現(xiàn)了背角無齒蚌的鰓細(xì)胞可能比血細(xì)胞對(duì)Cd2+毒性更為靈敏。因?yàn)闊o齒蚌鰓是Cd2+積累的最重要的靶器官[14-15]，而血液在循環(huán)過程中可能會(huì)將Cd2+運(yùn)輸至其他器官，從而稀釋了血細(xì)胞中Cd2+的含量[39]。盡管如此，在今后的研究中還需通過同步比較、分析鰓細(xì)胞和血細(xì)胞OTM對(duì)Cd2+的響應(yīng)特征來驗(yàn)證,同時(shí)表明成蚌鰓的OTM可以用作Cd2+污染評(píng)價(jià)、預(yù)警的生物標(biāo)志物。根據(jù)Cd2+暴露96 h的“劑量-效應(yīng)”的線性方程y=0.341 6x+0.368（圖4）和我國(guó)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB 11607—1989）規(guī)定的Cd2+限量（0.005 mg·L-1）[30]，初步得出 OTM 值達(dá)到 0.37 可作為水體Cd2+污染預(yù)警的參考閾值。值得注意的是，Cd2+對(duì)水生生物的毒性還與水體的理化因子密切相關(guān)[28，34-35]。因此，在利用OTM作為生物標(biāo)志物監(jiān)測(cè)自然水體Cd2+污染動(dòng)態(tài)前，還需進(jìn)一步探索這些環(huán)境因子對(duì)Cd2+致OTM變化的影響。

3 結(jié)論

（1）“標(biāo)準(zhǔn)化”背角無齒蚌的鉤介幼蟲和稚蚌對(duì)Cd2+特別敏感，具有作為受試物種完善漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中Cd2+限量的潛力，而幼蚌和成蚌對(duì)Cd2+的耐受性強(qiáng)，適宜用于Cd2+污染的移殖監(jiān)測(cè)。

（2）在 0.05 mg·L-1和 0.5 mg·L-1Cd2+暴露組中，幼蚌鰓MDA含量隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，但是鰓MDA含量與Cd2+之間沒有明顯的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系。

（3）成蚌鰓細(xì)胞OTM隨著Cd2+暴露時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，且與Cd2+之間具有顯著的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系。鰓細(xì)胞OTM適宜作為漁業(yè)生態(tài)環(huán)境Cd2+污染的早期預(yù)警的生物標(biāo)志物。

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Acute toxicity of cadmium and its effects on lipid peroxidation and DNA damage in“standardized”Anodonta woodiana

CHEN Xiu-bao,LIU Hong-bo,SU Yan-ping,JIANG Tao,YANG Jian*
（Key Laboratory of Fishery Eco-Environment Assessment and Resources Conservation in Middle and Lower Reaches of the Yangtze River,Freshwater Fisheries Research Center,Chinese Academy of Fishery Sciences,Wuxi 214081,China）

This study was undertaken to investigate the toxic effect of waterborne Cd2+on the freshwater bivalve“standardized”Anodonta woodiana,a unique bioindicator used in the“Freshwater Mussel Watch”project.Glochidia（＜ 24 h,mean length 0.25 mm）,early juveniles（＜ 5 days,mean length 0.27 mm）,and late juveniles（6 months,mean length 50 mm）were exposed to various Cd2+concentrations for the acute toxicity test.Furthermore,late juveniles or adults（48 months,mean length 85 mm）were used to investigate the temporal variation of lipid peroxidation[malondialdehyde（MDA）content]and DNA damage[Olive tail moment（OTM）]in gills,which are the target organs of Cd2+accumulation.The results showed that the 24-h median effect concentration（EC50）for glochidia was 0.001 8 mg·L-1,whereas the 96-h EC50values for early and late juveniles were 0.004 7 mg·L-1and 4.5 mg·L-1,respectively.MDA content was continuously reduced over time in both the 0.05 mg·L-1and 0.5 mg·L-1groups,and was not related to Cd2+concentration（P＞0.05）.In contrast,the OTM values increasedover time,and were linearly and positively correlated with Cd2+concentration（p＜0.05）.These results indicate that glochidia and early juveniles may be used as sensitive test organisms for Cd2+toxicology research,late juveniles and adults may be suitable for biomonitoring Cd2+pollution,and OTM is a valuable biomarker for early warning of Cd2+contamination.

“standardized”Anodonta woodiana;life stages;cadmium;acute toxicity;biomarker

X171.5

A

1672-2043（2017）10-1960-08

10.11654/jaes.2017-0430

陳修報(bào)，劉洪波，蘇彥平，等.鎘對(duì)＂標(biāo)準(zhǔn)化＂背角無齒蚌的急性毒性及脂質(zhì)過氧化和DNA損傷的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2017,36（10）：1960-1967.

CHEN Xiu-bao,LIU Hong-bo,SU Yan-ping,et al.Acute toxicity of cadmium and its effects on lipid peroxidation and DNA damage in ＂standardized＂Anodonta woodiana[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（10）：1960-1967.

2017-03-23 錄用日期：2017-07-13

陳修報(bào)（1983—），男，博士，助理研究員，從事漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)與保護(hù)研究。E-mail：chenxb@ffrc.cn

*通信作者：楊 健 E-mail：jiany@ffrc.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31502166）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20161144）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2015JBFM13）

Project supported：The Young Scientists Fund of the National Natural Science Foundation of China（31502166）；The Natural Science Foundation of Jiangsu Province，China（BK20161144）；Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund（2015JBFM13）