史謝堯 張振國 郝爽 黃俊嶺 羅璋 馮守明

摘 要：2017年7月，天津某鯽魚養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生病害，患病鯽主要癥狀為頭部發(fā)黑，體表出血。為分析其病因，通過寄生蟲檢測(cè)、病毒檢測(cè)、病原菌分離和鑒定、藥物敏感性測(cè)定等方法對(duì)患病魚及病原進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：從患病魚體表和體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)大量寄生蟲；未能檢測(cè)到皰疹病毒II型陽性；但從腎臟和脾臟組織分離到大量細(xì)菌。經(jīng)鑒定為溫和氣單胞菌；該分離株對(duì)鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素和氟苯尼考等3種藥物較為敏感，選擇鹽酸土霉素作為治療藥物，按25.0 mg/kg魚體重的用藥量拌和在飼料中進(jìn)行投喂，每天投喂1次，連續(xù)投喂5 d，取得了較好的治療效果。

關(guān)鍵詞：鯽；溫和氣單胞菌；藥物敏感性；治療

鯽具有肉質(zhì)鮮嫩，抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)集約化養(yǎng)殖等特點(diǎn)而深受養(yǎng)殖者喜愛，是我國主要的淡水養(yǎng)殖品種之一，2016年全國養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)291.2萬噸[1]。隨著鯽養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖產(chǎn)量的穩(wěn)步上升，各種病害的大規(guī)模暴發(fā)已經(jīng)成為了鯽健康發(fā)展的制約因子。迄今為止，鯽的多種生物性病原被報(bào)道，包括病毒性病原鯉皰疹病毒I型（Cyprinid herpesvirus I，CyHV-I）和鯉皰疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus II，CyHV-II）[2-4]；細(xì)菌性病原嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、蘇伯利亞氣單胞菌等[3-5]；以及車輪蟲、孢子蟲等寄生蟲病原和真菌性病原[6-8]。病原的多樣化給鯽病害的防治帶來困難，特別少數(shù)不同的病原引起鯽的發(fā)病癥狀極為相似，例如氣單胞菌引起的細(xì)菌性敗血癥和鯉皰疹病毒II型引起的鯽皰疹病毒病都能導(dǎo)致鯽體表出血[4，9]，僅憑肉眼觀察很難判斷病原，給鯽疾病的診治增加了難度。為了對(duì)疾病進(jìn)行有效防控，在疾病發(fā)生后及時(shí)查找病原，篩選有效藥物進(jìn)行治療顯得尤為重要。

2017年7月上旬，天津武清地區(qū)某鯽魚養(yǎng)殖池塘發(fā)生疾病，典型癥狀為頭部發(fā)黑、體表出血、黏液增多、鱗片松動(dòng)，該疾病發(fā)展速度快、死亡率高，給養(yǎng)殖者帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失。為了盡快采取合理措施控制疾病的蔓延，作者等對(duì)病原進(jìn)行了分析，開展了藥敏性試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇藥物進(jìn)行了野外治療試驗(yàn)，取得較好的治療效果。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離和寄生蟲觀察

用75%酒精棉球反復(fù)擦拭病魚體表后，在無菌條件下對(duì)病魚進(jìn)行解剖，用接種環(huán)分別從患病魚的腎、肝、脾等組織取少量樣品劃線接種于LB平板和BHI平板，28 ℃培育48 h后，選取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化，直至獲得純培養(yǎng)JY-201705菌株后，將其保存、備用；同時(shí)，取患病魚的鰭條、鰓、黏液、腸黏膜等樣本在顯微鏡下進(jìn)行寄生蟲檢查。

1.2 病毒的檢測(cè)

取患病鯽的鰓、腎、脾、肝、腦組織混合后勻漿，使用DNA提取試劑盒按照說明書提取DNA。用套式PCR的方法對(duì)鯉皰疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus 2， CyHV-2）進(jìn)行檢測(cè)（引物序列見表1）[9]。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板0.5 μL，上下游引物各0.2 μL（10 μmol/L），2 × Mix 10 μL，加雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)行以下循環(huán)，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 將分離純化后的JY-201705菌株劃線接種于LB平板，28℃培養(yǎng)24 h至長出均勻菌落后，觀察其菌落形態(tài)。并挑取少量菌苔做革蘭氏染色涂片，利用光學(xué)顯微鏡觀察染色特性和菌體形態(tài)。

1.3.2 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定 按GN試劑卡片說明書操作。

1.3.3 分子生物學(xué)方法鑒定 按參考文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行，提取菌株JY-201705的基因組DNA為模板，采用細(xì)菌16S rRNA序列擴(kuò)增的通用引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（反應(yīng)體系和程序參照12）。將PCR產(chǎn)物切膠回收，連接PMD-18T載體后，轉(zhuǎn)E.coil TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與所有已登錄GenBank的基因片段進(jìn)行同源性比對(duì)得到相應(yīng)的屬種信息，并從GenBank中下載相近種的16S rRNA序列，利用軟件MEGA5.0進(jìn)行多序列匹配排列，采用鄰位相連法（ Neighbor-joining） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstraps重復(fù)檢驗(yàn)1 000次。

1.4 藥物敏感性測(cè)定

1.4.1 待測(cè)細(xì)菌的準(zhǔn)備 將從患病鯽上分離到的JY-201705菌株接種在LB培養(yǎng)基中，28 ℃ 150 r/min培養(yǎng)48 h后，6 000 g離心10 min收集菌體，用0.75%的滅菌生理鹽水將菌液濃度調(diào)整至1×107 CFU/mL，備用。

1.4.2 供試藥物的選擇 選擇硫酸新霉素、硫酸慶大霉素、硫酸鏈霉素、鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、氟苯尼考、恩諾殺星、諾氟殺星、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素等10種藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.4.3 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 參照陳昌福等[11]的方法進(jìn)行。將各種藥物分別用適宜介質(zhì)溶解后，用0.75%滅菌生理鹽水按2倍稀釋法將各種藥物濃度稀釋至1 000.0～0.25 μg/mL等13個(gè)濃度。然后用滅菌后的LB培養(yǎng)基將各濃度的藥物稀釋10倍，使藥物濃度稀釋至100.0～0.025 μg/mL等13個(gè)濃度。在盛有3.0 mL 含不同濃度藥物的LB培養(yǎng)基的試管中分別加入100.0 μL供試菌液，28℃ 150 r/min培養(yǎng)36 h后，肉眼觀察證實(shí)無菌生長試管中的最低藥物濃度，即為該藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

1.5 野外藥物治療試驗(yàn)

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇有較好抑菌效果的鹽酸土霉素，按25.0 mg/kg.魚體重的使用量，均勻地拌和在飼料中制備成藥物餌料，對(duì)發(fā)病池塘養(yǎng)殖的鯽進(jìn)行投喂，每天投喂1次藥餌，連續(xù)投喂5 d。endprint

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離

從瀕死鯽腎臟分離得到細(xì)菌1株，暫定名為JY201705。分離菌株在LB平板上形成光滑半透明、圓形、濕潤、邊緣整齊隆起的灰白色菌落；BHI平板上生長的菌落形與在LB平板類似，但生長速度更快，菌落更大，呈淡黃色。

2.2 病原菌的鑒定

通過革蘭氏染色，利用光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菌株JY201705菌株為革蘭陰性短桿菌，無芽胞。利用法國梅里埃公司的全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（型號(hào)：VITEK 2 Compact）鑒定的結(jié)果為溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria），可信度為98%，鑒定評(píng)語為極好的鑒定。具體生化反應(yīng)見表2。以JY201705菌株的總DNA為模板，經(jīng)細(xì)菌通用引物27F和1 492R擴(kuò)增到1 506 bp大小的核酸片段，將測(cè)序產(chǎn)物進(jìn)入NCBI網(wǎng)站進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與溫和氣單胞菌同源性最高，為99%。選用GenBank中已登錄的部分氣單胞菌屬16S rRNA基因序列進(jìn)行匹配排列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），結(jié)果表明JY201705菌株與A.sobria聚成一枝。因此，綜合各方面試驗(yàn)結(jié)果，將JY201705菌株鑒定為溫和氣單胞菌。

2.3 藥物敏感性試驗(yàn)

各種抗菌藥物對(duì)菌株JY201705的MIC測(cè)定結(jié)果如表3所示。在10種供試藥物中，以鹽酸四環(huán)素、鹽酸土霉素和氟苯尼考具有比較好的抑菌效果，最小抑菌濃度分別為0.39、0.78 和1.56 μg/mL， 其他各種藥物的抑菌效果比較差。

2.4 野外治療效果

采用抑菌效果較好的鹽酸土霉素對(duì)患病鯽進(jìn)行治療，在投喂藥餌2 d后，鯽死亡率即開始度下降，連續(xù)用藥5 d后，養(yǎng)殖池塘內(nèi)鯽基本上停止了死亡，說明鹽酸土霉素對(duì)該疾病具有很好的治療效果。

3 討論

魚類發(fā)生病害以后，為了制定有效的治療措施，首先要進(jìn)行病原的確定。本試驗(yàn)中，利用顯微鏡對(duì)寄生蟲的進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)除鰓部有少量車輪蟲寄生外，未在其他組織中發(fā)現(xiàn)大量的寄生蟲，因此排除了寄生蟲疾病的可能。據(jù)已有的報(bào)道，鯽的病毒性疾病主要有2種，一種為鯉痘瘡?。–arp pox），其病原為皰疹病毒科的鯉皰疹病毒I型（Cyprinid herpesvirus 1， CyHV-1），該病主要癥狀是體表出現(xiàn)乳頭狀突起的增生物，體表無充血癥狀，通常在冬季和早春低溫季節(jié)發(fā)生[2]，與本病在發(fā)生季節(jié)和癥狀上截然不同，因此可以排除鯉痘瘡病的可能而未進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)；另一種為鯉皰疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus II， CyHV-II）引起皰疹病毒病，其主要癥狀為鰓和體表出血，流行溫度為20～25 ℃，與本病的特征極為相似，但本試驗(yàn)中利用套式PCR技術(shù)未能檢測(cè)鯉皰疹病毒II型陽性，因此初步排除了病毒性疾病的可能。此外，從患病鯽腎和脾臟組織中分離到大量形態(tài)一致的菌落，利用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀將其鑒定為溫和氣單胞菌，此外，通過分子生物學(xué)的方法進(jìn)一步驗(yàn)證了其鑒定的可靠性。利用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀對(duì)細(xì)菌純培養(yǎng)物開展鑒定通常只需要4～6 h，較快的鑒定速度非常符合生產(chǎn)實(shí)際的要求。根據(jù)柯赫氏法則，為了對(duì)分離的疑似病原進(jìn)行確認(rèn)，應(yīng)該利用分離株進(jìn)行回感試驗(yàn)，但感染試驗(yàn)通常要觀察14 d以上，生產(chǎn)實(shí)踐中病害一旦發(fā)生，時(shí)間極為緊迫，所以本試驗(yàn)中沒有開展回感試驗(yàn)；但是，根據(jù)鑒定結(jié)果，分離到的疑似病原為溫和氣單胞菌，溫和氣單胞菌是一種水產(chǎn)動(dòng)物常見病原，能引起鯽、鯉、鰱、草魚、團(tuán)頭魴等淡水魚類的病害[4， 12-15]。因此，我們將其判斷為引起此次病害的病原。

為了使藥物在治療水產(chǎn)動(dòng)物疾病的過程中獲得較好的效果，在決定使用某種藥物之前，需要針對(duì)病原菌進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定。只有在分離到病原菌，并測(cè)定該病原菌對(duì)擬選用藥物敏感程度的基礎(chǔ)上，才能選擇適當(dāng)?shù)乃幬锖瓦m宜的用藥量對(duì)疾病進(jìn)行治療，不然，就可能導(dǎo)致盲目選用藥物，造成治療效果不佳和藥物對(duì)養(yǎng)殖水環(huán)境的污染。關(guān)于菌株對(duì)藥物敏感性的測(cè)定，通常使用的方法有2種，一種為紙片法，將帶有某種藥物的紙片粘貼于已涂布待測(cè)菌液的平板上，培養(yǎng)24～48 h后通過測(cè)定抑菌圈的大小判斷敏感程度，該方法操作方便，但只能用于定性試驗(yàn)。另一種方法為本試驗(yàn)中使用的MIC法，該方法操作較紙片法繁瑣，但能準(zhǔn)確計(jì)算出具體的MIC值，并可據(jù)此估計(jì)藥物的具體使用濃度，因此在生產(chǎn)實(shí)際中較為實(shí)用。在本研究中，鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素和氟苯尼考對(duì)菌株JY201705有較好的抑菌效果，這與肖艷翼等[16]的測(cè)試結(jié)果較為一致，但胡琳琳等[17]，巴翠玉等[18]，徐海圣等[19]利用分別從金魚、大馬哈魚、黃鱔中分離到的溫和氣單胞菌開展藥物敏感性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其對(duì)四環(huán)素耐藥。這反應(yīng)出同種細(xì)菌的不同菌株耐藥情況存在很大的差別，因此，在用藥前，開展藥敏試驗(yàn)顯得十分重要。本試驗(yàn)中利用鹽酸土霉素治療鯽的病害取得了較好的效果，但是，這并不意味著這種藥物就永遠(yuǎn)是抑制該池塘溫和氣單胞菌的特效藥物，因?yàn)椴≡鷮?duì)抗菌藥物的敏感程度會(huì)發(fā)生改變。最近，陳昌福等[20]的研究表明，利用溫和氣單胞菌在含氟苯尼考的FWA培養(yǎng)基中傳代9次以后，氟苯尼考對(duì)該菌株的MIC值上升了4～8倍，當(dāng)停止使用該藥物一段時(shí)間后，MIC也會(huì)隨之下降。此外，目前我國的養(yǎng)殖水體大部分是開放型的，耐藥性可以在不同菌體間相互傳遞，由于在同一個(gè)水域中從事水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)的不同養(yǎng)殖業(yè)者在預(yù)防和治療同期發(fā)生的水產(chǎn)動(dòng)物病害時(shí)，可能選擇不同種類的抗生素類藥物，這會(huì)導(dǎo)致病原菌在短時(shí)間內(nèi)對(duì)多種藥物產(chǎn)生耐藥性。因此，為了避免病原菌過快地對(duì)某些抗生素類藥物產(chǎn)生耐藥性，同一個(gè)養(yǎng)殖水域的養(yǎng)殖業(yè)者應(yīng)該共同關(guān)注水域中致病菌耐藥性的變化趨勢(shì)，科學(xué)合理地選用藥物，達(dá)到避免或延緩該水域中病原菌產(chǎn)生耐藥性。

近年來，鯽皰疹病毒的發(fā)生情況十分普遍，很多養(yǎng)殖者通?？吹筋^部發(fā)黑、體表出血等癥狀就認(rèn)為是皰疹病毒感染，從而失去養(yǎng)殖信心。而本試驗(yàn)的研究表明，在確認(rèn)為細(xì)菌性病原引起的出血癥狀后，篩選合適的藥物進(jìn)行治療，能起到較好的效果。此外，也有研究表明，對(duì)于鯽皰疹病毒的防控，免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用具有較好的應(yīng)用效果[21]。因此，在病害發(fā)生后，一定先查找病因，再選擇合理的防控策略。endprint

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（收稿日期：2017-09-07）endprint