謝佳賓，王媛，田夢，李亞梅，武媛媛，王玉明，李遇伯*，張艷軍

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué) 天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193)

·基礎(chǔ)研究·

靶細胞萃取聯(lián)用UPLC/Q-TOF-MS方法分析川芎中的藥效成分△

謝佳賓1，王媛1，田夢1，李亞梅1，武媛媛1，王玉明1，李遇伯1*，張艷軍2*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué) 天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193)

目的建立靶細胞萃取聯(lián)用UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)分析川芎中藥效成分的方法。方法選用人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)作為靶細胞，萃取川芎中的藥效成分。在細胞對數(shù)生長期加入川芎供試品溶液，孵育2 h收集細胞并用液氮迅速冷凍，反復(fù)凍融使細胞破碎，離心得到萃取藥物后的細胞樣品。采用UPLC/Q-TOF-MS對其進行檢測，分析川芎化學(xué)成分中與細胞結(jié)合的物質(zhì)，即川芎中與細胞結(jié)合進一步發(fā)揮藥效的可能有效成分。結(jié)果從川芎中篩選到2個可能的藥效成分，分別為阿魏酸和藁本內(nèi)酯。結(jié)論本研究建立的方法可以通過化合物與細胞中靶點(受體、通道、酶等)之間的特異性結(jié)合作用，篩選出川芎中藥效活性成分，從而為藥物活性成分的篩選以及藥物機制的研究提供思路，同時推動了中藥安全性的快速發(fā)展。

川芎；靶細胞萃?。晦槐緝?nèi)酯；阿魏酸；UPLC/Q-TOF-MS

川芎為傘形科植物川芎LigusticumChuanxiongHort.的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味辛性溫，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛功能，用于胸痹心痛、胸脅刺痛、跌撲腫痛、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)等[1]。中藥化學(xué)成分極其復(fù)雜，在藥材質(zhì)量控制過程中闡明藥效物質(zhì)已成趨勢，因此，明確中藥藥效成分是保證中藥材及其產(chǎn)品安全有效和質(zhì)量穩(wěn)定可控的基礎(chǔ)與核心。

靶細胞萃取法是一種細胞色譜法[2]，原理是利用生物活性物質(zhì)的特異性相互作用進行生物樣品分離分析和生物活性參數(shù)測定，通過藥物與靶點(受體、通道、酶等)結(jié)合的原理，將藥物中的效應(yīng)物質(zhì)分離，該類技術(shù)具有色譜高效分離分析的優(yōu)勢和以生物活性靶標(biāo)進行特異篩選的特點，無需分離得到純品即可快速、高效、簡捷地完成活性成分的篩選[3-4]。因此，本研究將靶細胞萃取與分析技術(shù)相結(jié)合，以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)為作用對象，聯(lián)用UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)建立了川芎藥效成分的篩選方法。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

川芎(購自北京鶴延齡中藥飲片公司，批號：150200431)，藁本內(nèi)酯(中國科學(xué)院成都生物研究所，批號：MUST-1432414，質(zhì)量分數(shù)大于99%)，阿魏酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：MUST-110773-201313，質(zhì)量分數(shù)大于99%)，乙腈(美國Sigma公司，色譜純)，95%乙醇(天津市廣成化學(xué)試劑有限公司，分析純)，純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)，HUVEC(天津賽爾生物技術(shù)有限公司)，胰蛋白酶(美國GIBCO BRL)，DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO BRL)，1640培養(yǎng)基(美國GIBCO BRL)，胎牛血清(FBS，美國GIBCO)，DMSO(天津市化學(xué)試劑一廠)，96孔培養(yǎng)板(比利時Orange Scientific)。

1.2 儀器

Waters Acquity UPLC儀、Waters Xevo G2 Q-Tof/MS質(zhì)譜儀(美國Waters公司)，十萬分之一BT 125D電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，HH-S8數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市盛藍儀器制造有限公司)，DZTW型電子調(diào)溫電熱套(山東省永興儀器廠)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma)，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)，TS-1型搖床(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，5415D型離心機(德國Eppendorf)，ELx800酶標(biāo)儀(美國Bio-tek)，MTT(美國Ameresco公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為水(A相)和乙腈(B相)；梯度洗脫(0～2 min，1%～1%B；2～5 min，1%～6%B；5～15 min，6%～10%B；15～20 min，10%～20% B；20～30 min，20%～40%B；30～36 min，40%～50%B；36～38 min，50%～70%B；38～39 min，70%～99%B；39～41 min，99%～99%B；41～43 min，99%～1% B；43～45 min，1%～1%B)，流速：0.25 mL·min-1，柱溫：35 ℃，進樣量：10 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 超高效液相色譜法耦合到Q-TOF-MS，配備電噴霧電離源(ESI)，采用負離子模式進行掃描分析。MS參數(shù)設(shè)定如下：干燥氣流速為10 mL·min-1，N2溫度為350 ℃，霧化器氣壓為310 kPa，脫溶劑氮氣流速為600 L·h-1，錐孔反吹氮氣為50 L·h-1，毛細管電離電壓為2.1 kV，四級桿掃描范圍為m/z50～1000，輔助氣體為高純氮氣。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取1.0 g川芎藥材于圓底燒瓶中，加入10倍量70%乙醇水溶液回流提取1 h，過濾取上清液，殘渣再加入8倍量70%乙醇水溶液，提取1 h，過濾，合并兩次濾液，減壓濃縮并凍干成粉末。取粉末500 mg，采用乙腈定容至100 mL，即得川芎供試品溶液，于4 ℃冰箱保存，備用。

2.3 人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

選用穩(wěn)定的細胞株HUVEC，用DMEM高糖培養(yǎng)基在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有10% FBS、1%PS、1%非必需氨基酸，在37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天更換培養(yǎng)基，生長3～4 d后細胞達到融合。用胰蛋白酶(0.25%)-EDTA(1 mmol·L-1)的消化液傳代。在倒置相差顯微鏡下放大200倍觀察，選均勻鋪滿瓶底、排列整齊、胞漿飽滿、生長狀態(tài)良好、均一的細胞供實驗用。

2.4 靶細胞萃取川芎中的藥效成分

選擇處于對數(shù)生長期的HUVEC，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的條件下孵育0.5 h，棄去無血清的培養(yǎng)基，加入用無血清的DMEM培養(yǎng)基溶解川芎凍干粉配制的500 mg·L-1的供試品溶液，孵育2 h。棄去含藥物培養(yǎng)基，用PBS沖洗4次，取1 mL第4次洗脫液備用。收集細胞，并將其置于液氮中急速冷凍10 min，隨后取出立即置于37 ℃水浴中融化，重復(fù)以上反復(fù)凍融操作3次，使細胞破碎，并將其冷凍干燥成粉末。取萃取藥物后的凍干樣品，分別加200 μL 50%甲醇水溶液溶解樣品，渦旋混勻1 min，以4 ℃、13 000 r·min-1離心15 min，移取上清液備用。將第4次洗脫液和細胞破碎液用UPLC/Q-TOF-MS檢測。以同樣的方法用無血清的DMEM溶液代替藥液作為空白細胞的破碎液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 制備川芎供試品溶液，連續(xù)進樣6次，隨機選取20個色譜峰，計算20個色譜峰的峰面積的RSD值，20個色譜峰峰面積的RSD在0.9%～2.2%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗 平行制備6份川芎供試品溶液，連續(xù)進樣分析，隨機選取20個色譜峰，計算20個色譜峰的峰面積的RSD值，20個色譜峰峰面積的RSD在2.2%～5.3%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 制備川芎供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣分析，隨機選取20個色譜峰，計算20個色譜峰的峰面積的RSD值，各色譜峰峰面積的RSD在0.8%～2.4%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，所以每批樣品保證在24 h內(nèi)測定。

2.6 靶細胞萃取川芎成分分析

分別對空白細胞破碎液和加入川芎的HUVEC破碎液進行UPLC/Q-TOF-MS分析。圖1為空白和加入川芎供試品的HUVEC破碎液的BPI圖。通過對比可以看出，相對于空白的細胞破碎液，加入川芎供試品的HUVEC破碎液出現(xiàn)2個色譜峰，分別標(biāo)號為1和2，說明這兩個化合物可能是在HUVEC中有吸收的成分。同時，對川芎供試品的HUVEC破碎液中檢測到的2個化合物進行質(zhì)譜鑒定，從一級質(zhì)譜圖中可以獲得各個化合物的分子離子峰，從而確定其精確分子量，推導(dǎo)出分子式，然后從二級質(zhì)譜中對其獲得的碎片離子信息進行結(jié)構(gòu)鑒定。具體的物質(zhì)信息和斷裂規(guī)律見表1。

峰1保留時間為17.82 min，準分子離子[M-H]-為m/z193.050 2，分子式為C10H10O4，二級碎片中具有193.050 2[M-H]-，161.022 4[M-H-CH3OH]-，136.980 0[M-H-C4H8]-，133.027 4[M-H-CH3COOH]-等離子碎片，通過與文獻報道[5-9]的二級圖譜比對后推斷其為阿魏酸。

注：A.空白細胞提取液；B.加藥細胞破碎液。圖1 空白細胞提取液和加藥細胞破碎液的BPI圖

峰2保留時間為26.40 min，準分子離子[M-H]-為m/z189.091 1，分子式為C12H14O2，二級碎片中具有189.099 1[M-H]-，171.098 2[M-H-H2O]-，161.089 9[M-H-CO]-，153.093 4[M-H-2H2O]-，143.095 8[M-H-H2O-CO]-等離子碎片，通過對比文獻報道[5-9]，推測其為藁本內(nèi)酯。

從鑒定結(jié)果可知，加入川芎供試品的HUVEC細胞破碎液中檢測到的2個化合物分別為阿魏酸和藁本內(nèi)酯，因此，可以推斷阿魏酸和藁本內(nèi)酯為可能的藥效成分。

表1 阿魏酸和藁本內(nèi)酯的斷裂規(guī)律

3 討論

中藥有效成分的篩選是創(chuàng)新性藥物研究的源頭性工作，但由于中藥作用的整體性、中藥化學(xué)成分和作用機制的復(fù)雜性，中藥藥效物質(zhì)研究一直進展緩慢，成為制約中藥現(xiàn)代化進程的瓶頸之一。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)[10]，某些藥物發(fā)揮作用的一個重要原因是與細胞膜上的受體、酶、通道等結(jié)合或進入細胞內(nèi)部。所以，能與靶細胞有結(jié)合的成分可能為藥物的活性成分，針對這些成分進行有目的地分離和藥理活性篩選，既避免了大量無活性、無吸收成分的干擾，也不用先對中藥中成分進行大量的分離純化工作，為活性成分不明確的中藥藥效物質(zhì)研究提供了新的、快捷、有效的方法，克服了以往先從中藥中分離有效部位或單體，再分析其藥效，從而避免了成分分離和藥效篩選脫節(jié)的弊端，其成為中藥復(fù)雜體系的新的研究策略。

本研究建立了靶細胞萃取聯(lián)用UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)分析川芎中的藥效成分的方法，結(jié)果表明，通過靶細胞萃取方法從川芎中篩選出與之細胞結(jié)合的可能的藥效成分，即藁本內(nèi)酯和阿魏酸。本研究建立的篩選藥效成分的方法，能保持細胞的正常生理狀態(tài)下對藥效成分進行快速篩選，具有準確、簡便、重復(fù)性好等優(yōu)勢。因此，本研究為川芎的質(zhì)量控制和藥效評價提供了理論依據(jù)，同時為快速篩選中藥藥效成分提供一種研究思路，并為中藥安全性和安全用藥提供幫助。

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AnalysisofPharmacodynamicComponentsinChuanxiongRhizomabyTargetCellSorptionCombinedwithUPLC/Q-TOF-MS

XIE Jiabin1，WANG Yuan1，TIAN Meng1，LI Yamei1，WU Yuanyuan1，WANG Yuming1，LI Yubo1*，ZHANG Yanjun2*

(1.CollegeofTraditionalChineseMateria，TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300193，China； 2.TianjinStateKeyLaboratoryofModernChineseMedicine，TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300193，China)

Objective:To establish a method by using target cell and UPLC/Q-TOF-MS for extraction the pharmacodynamic components in Chuanxiong Rhizoma.MethodsThe human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were used as target cells，and the freeze-dried powder of Chuanxiong Rhizoma in logarithmic growth period was added.After 2 h incubation，the cells were collected and frozen rapidly with liquid nitrogen，the cells were broken by repeated freezing and thawing，and centrifuged to obtain a sample of cells after extraction.While compounds in the extract of cell samples were determined by UPLC/Q-TOF-MS，the effect of possible effective components that entered the cell of Chuanxiong Rhizoma was analyzed.ResultsAfter HUVEC extraction two active ingredients ferulic acid and ligustilide were obtained.At the same time，the method was established for the determination of the two components.ConclusionThe analysis method of the target cell extraction and UPLC/Q-TOF-MS can be applied for screening out the active ingredients in Chuanxiong Rhizoma by specific binding effect between the compound and the target (receptor，channel，enzyme，etc.) in the cell，so as to provide a new method for screening the active ingredients and drug mechanism study.

Chuanxiong Rhizoma；target cell sorption；ferulic acid；ligustilide；UPLC/Q-TOF-MS

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.007

國家科技支撐計劃課題(2011BAI07B08)

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李遇伯，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥分析及代謝組學(xué)研究，Tel:(022)59596191,E-mail:yaowufenxi001@sina.com;張艷軍，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥理及安全性評價研究，Tel：(022)59596223，E-mail：tianjin_tcm001@sina.com

2017-01-05)