唐靜，黃磊

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院 藥劑科，湖北 武漢 430077；2.武漢市武昌醫(yī)院，湖北 武漢 430063)

·中藥工業(yè)·

響應(yīng)面法優(yōu)化何首烏二苯乙烯苷類化合物提取工藝△

唐靜1，黃磊2*

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院 藥劑科，湖北 武漢 430077；2.武漢市武昌醫(yī)院，湖北 武漢 430063)

目的通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化何首烏二苯乙烯苷類化合物提取工藝。方法根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)的方法，選取溫度、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，二苯乙烯苷提取率為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析方法，得到回歸方程的預(yù)測(cè)模型，并確定二苯乙烯苷提取工藝的最佳條件。結(jié)果何首烏二苯乙烯苷提取工藝的最佳條件為溫度54 ℃、液料比18∶1(mL·g-1)、乙醇體積分?jǐn)?shù)72%。在此條件下，提取率達(dá)到2.75%。結(jié)論該工藝條件可為何首烏二苯乙烯苷的提取提供參考。

響應(yīng)面；何首烏；二苯乙烯苷；提取

何首烏PolygonummultiflorumThumb.是蓼科蓼族何首烏屬多年生纏繞藤本植物，其干燥塊根入藥[1]，具有解毒(截瘧)、消癰、潤(rùn)腸通便功能[2-3]。何首烏含有二苯乙烯類、卵磷脂、蒽醌類、黃酮類、鞣質(zhì)、微量元素等物質(zhì)[4]。2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(TSG)俗稱二苯乙烯苷，是何首烏二苯乙烯類中含量較高的成分之一，也是何首烏主要的有效成分。本研究選取TSG為考察指標(biāo)，采用BBC中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化何首烏TSG的提取工藝。

1 材料

1.1 試藥

何首烏飲片(湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司)打粉后過(guò)80目篩，收集粉末；TSG(中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度>98%)；乙腈為色譜純；乙醇為分析純；水為蒸餾水。

1.2 儀器

Waters高效液相色譜儀、Empower色譜工作站(美國(guó)waters公司)；JJ224BC分析天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠，精度：0.1 mg)。

2 方法

2.1 何首烏提取物中二苯乙烯苷含量測(cè)定方法學(xué)的建立

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取TSG，加適量乙醇制得質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，分別取對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，得回歸方程：Y=106X-67 073，r=0.999 8，線性范圍0.5g～5 μg。

2.1.2 色譜條件 色譜柱Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(V乙腈∶V水=23∶77)；檢測(cè)波長(zhǎng)：310 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：28 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.3 供試品溶液的制備 何首烏粉末0.5 g，置于50 mL錐形瓶中，按一定的液料比，加入一定量和一定濃度的乙醇，水浴回流一定時(shí)間，合并濾液，濾過(guò)，精密吸取5 mL，即得供試品溶液。

2.2 單因素試驗(yàn)

分別考察提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、溫度對(duì)二苯乙烯苷提取率的影響。在固定實(shí)驗(yàn)條件(液料比為20∶1，溫度為60 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%)下，考察提取時(shí)間0.5、1、1.5、2、2.5 h對(duì)TSG提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。在固定實(shí)驗(yàn)條件(液料比為20∶1，溫度為60 ℃，提取時(shí)間為1.5 h)下，考察乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%對(duì)TSG提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。在固定實(shí)驗(yàn)條件(乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，溫度為60 ℃、提取時(shí)間為1.5 h)下，考察液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1對(duì)TSG提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。在固定實(shí)驗(yàn)條件(液料比為20∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、提取時(shí)間為1.5 h)下，考察溫度40、50、60、70、80 ℃對(duì)TSG提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖1 提取時(shí)間對(duì)TSG提取率的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)TSG提取率的影響

圖3 液料比對(duì)TSG提取率的影響

圖4 溫度對(duì)TSG提取率的影響

2.3 何首烏提取工藝響應(yīng)面法優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，按照Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[5]，選擇提取溫度(A)、液料比(B)、乙醇體積濃度(C)為自變量，以TSG提取率為響應(yīng)值，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析，通過(guò)Design-Expert8.0.6.1軟件進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化，響應(yīng)面分析因素設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表1～2。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

由圖1可知，在1.5 h左右TSG的提取率達(dá)到最高值，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率略有下降，這可能由于提取時(shí)間延長(zhǎng)，TSG化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定[6]，使得提取率出現(xiàn)了下降，因此選擇提取時(shí)間為1.5 h。

由圖2可看出，隨著乙醇濃度的增加，TSG的提取率在增加，在70%濃度時(shí)達(dá)到峰值，隨后可能由于乙醇濃度增大使溶液黏度增加，影響了成分的溶出，同時(shí)也增加了醇溶性成分的溶出，使得提取率減少，從易操作性角度考慮，選擇乙醇濃度為70%。

由圖3可知，TSG的提取率隨著液料比的增大而增大，在液料比20∶1時(shí)達(dá)到高峰，隨后出現(xiàn)了下降，其原因可能是乙醇量繼續(xù)增加，導(dǎo)致更多的雜質(zhì)成分溶出，反而降低了TSG的提取率，因此選擇液料比為20∶1。

由圖4可知，在溫度達(dá)到60 ℃后，TSG的提取率一度出現(xiàn)了最大值，在80 ℃以后，提取率出現(xiàn)了明顯的下降。這可能是隨著溫度升高，TSG的含量降低，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7-8]，說(shuō)明溫度影響TSG穩(wěn)定性，因此選擇提取溫度為60 ℃。

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)選提取工藝

表1中“0”代表單因素試驗(yàn)中的最優(yōu)條件值，“-1”、“1”分別代表以最優(yōu)條件為基準(zhǔn)，在上下區(qū)域各取1個(gè)水平作為響應(yīng)面法設(shè)計(jì)水平。表2為三因素三水平17個(gè)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)水平，其中1～12是析因試驗(yàn)，13～17是以零點(diǎn)最優(yōu)條件為中心的5次重復(fù)試驗(yàn)。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的分析，得到了提取率(Y)與各影響因素的回歸方程：Y=2.73-0.12A-0.044B+0.036C+0.017AB-0.017AC-0.095BC-0.20A2-0.14B2-0.17C2。

表3 方差分析表

注：***P< 0.001為極顯著；**P< 0.01為非常顯著；*P< 0.05為顯著。

3.3 響應(yīng)面法分析各因素影響

比較表3中F值可知，對(duì)TSG提取率影響由大到小依次為提取溫度(A)、液料比(B)、乙醇體積濃度(C)。等高線的形狀可以反映兩因素間交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素間交互作用較強(qiáng)，圓形則相反[9]。圖5、6與圖7相比更圓，故BC兩因素之間的交互作用最強(qiáng)，且BC兩因素之間的交互圖曲面較陡，也支持這一點(diǎn)[10-11]。

圖5 液料比與溫度對(duì)二苯乙烯苷提取率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)比與溫度對(duì)二苯乙烯苷提取率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比對(duì)二苯乙烯苷提取率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖

3.4 試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)模型，得到優(yōu)化工藝：在53.97 ℃、液料比為17.62∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為71.88%，在此條件下理論提取率為2.75%?？紤]到可操作性，將提取工藝改為：提取溫度54 ℃，液料比18∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為72%。在此條件下，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果顯示，二苯乙烯苷的平均提取率為2.63%，與模型的誤差為5.1%，說(shuō)明該方程與實(shí)驗(yàn)情況擬合較好。

4 討論

響應(yīng)面法是采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析，尋找到最佳工藝的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，具有使用簡(jiǎn)便、精確度高、預(yù)測(cè)性好等特點(diǎn)[12]。本研究通過(guò)對(duì)單因素試驗(yàn)中確定的3個(gè)影響提取工藝的因素采用BBC法設(shè)計(jì)后，進(jìn)行響應(yīng)面法分析，使得TSG的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值較為接近，說(shuō)明響應(yīng)面法可用于優(yōu)化TSG提取工藝。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)得到了何首烏二苯乙烯苷優(yōu)化后的提取工藝：提取溫度54 ℃，液料比18∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為72%，本研究方法對(duì)TSG的提取有一定的理論指導(dǎo)意義。

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ResponseSurfaceAnalysisofExtractionforTSGfromPolygonummultiflorum

TANG Jing1，HUANG Lei2*

(1.LiyuanHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan43007，China；2.WuchangHospitalofWuhan，Wuhan430063，China)

Objective:To optimize the extraction for 2,3,5,4-tetrahydroxyl diphenylethylene-2-O -glucoside(TSG)fromPolygonummultiflorumwith response surface methodology.Methods: Extraction temperature，liquid-solid ratio，ethanol volume，which designed by central composite were evaluated by TSG extraction yield.The response surface methodology was used to establish the prediction model of regression equation，and confirm the optimal extraction in TSG.ResultsThe optimal protocol for TSG extraction was at 54 ℃ in 72% ethanol with a liquid-solid ratio of 18∶1，the extraction yield reached 2.75%.ConclusionThe selected parameters provide a theoretical basis for TSG extraction。

Response surface analysis；Polygonummultiflorum；TSG；extraction

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.016

華中科技大學(xué)自主創(chuàng)新基金(2014QN072)

*

黃磊，主治醫(yī)師，研究方向：老年醫(yī)學(xué)；Tel:(027)51173147;E-mail:394579393@qq.com

2016-12-19)