張大勇， 戚維聰， 萬 群， 劉 佳， 徐照龍， 黃益洪， 邵宏波>

(江蘇省農業(yè)科學院 農業(yè)資源與環(huán)境研究所 鹽土農業(yè)研究中心， 江蘇 南京 210014)

5個大豆AT-hook基因GmAHLs的克隆與定位分析

張大勇①， 戚維聰①， 萬 群， 劉 佳， 徐照龍， 黃益洪， 邵宏波②>

(江蘇省農業(yè)科學院 農業(yè)資源與環(huán)境研究所 鹽土農業(yè)研究中心， 江蘇 南京 210014)

從大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕中克隆出5個AT-hook基因，分別命名為GmAHL1、GmAHL2、GmAHL3、GmAHL4和GmAHL5，其中，GmAHL5為GmAHL1的重復基因。序列分析結果表明：5個GmAHLs蛋白的AT-hook基序分別位于其氨基酸序列的42～54、39～51、42～54、41～53及42～54處，且GmAHL1和GmAHL5蛋白的氨基酸序列相同。大豆GmAHLs蛋白和野大豆(G.sojaSieb. et Zucc.) GsAHLs蛋白與其他植物H1組蛋白的親緣關系較遠，說明GmAHLs蛋白不屬于H1組蛋白。GmAHL1基因在所有檢測的組織中均不表達；GmAHL2基因主要在花、種子、葉片和根中表達；GmAHL3基因主要在花、葉片、莖和根尖分生組織中表達，在果莢中不表達，但在根瘤中有表達；GmAHL4基因在根瘤中高度表達，在根、莖端分生組織、莖和果莢中也有較高表達；GmAHL5基因主要在葉片、種子、根尖分生組織和花中表達。GmAHL2基因在根中的表達受氨的誘導，GmAHL3基因在根中的表達受硝酸鹽、尿素和根瘤菌的抑制。亞細胞定位分析結果表明：大豆GmAHLs蛋白定位于細胞核。研究結果顯示：大豆GmAHLs基因均非組成型表達基因，其中GmAHL2、GmAHL3和GmAHL4基因的表達具有特異性，且可被外源氮素和根瘤菌處理誘導或抑制。

大豆； AT-hook基因；GmAHLs； 克?。?表達； 亞細胞定位

AT-hook蛋白是一類DNA結合蛋白，含有以精氨酸(Arg)-甘氨酸(Gly)-精氨酸(Arg)-脯氨酸(Pro)(RGRP)為核心的小基序，因此AT-hook基序也被稱作RGRP基序[1]。AT-hook蛋白首先是在哺乳動物非組蛋白的染色體高移動群蛋白HMG-1/Y中被發(fā)現[2]，這類蛋白往往定位于細胞核，又被稱為AHL蛋白(AT-hook motif nuclear localized protein)[3]。目前，在擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕、水稻(OryzasativaLinn.)、番茄(SolanumlycopersicumLinn.)、大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕和小麥(TriticumaestivumLinn.)等植物中也發(fā)現有AT-hook蛋白[4]，而且越來越多的AT-hook基因家族成員被鑒定出來，如擬南芥[3]、水稻[5]和番茄[6]中分別含有29、45和32個成員。

AT-hook蛋白家族不僅在植物生長發(fā)育、器官構建、逆境脅迫和激素信號應答中起重要作用，還可作為染色體結構和轉錄因子的輔助因子，調節(jié)基因的轉錄活性[7-8]。AHL27基因過量表達可降低葉片衰老基因的表達水平，提高葉片光合效率和葉綠素含量以延緩植物葉片的衰老[9]；而過量表達擬南芥AHL27基因可推遲擬南芥開花[10-11]。說明AHL27蛋白在植物的營養(yǎng)生長過程中起重要作用，能夠延緩營養(yǎng)生長向生殖生長的轉化。丁麗雪等[6]采用脫落酸、水楊酸、NaCl、高溫和低溫處理番茄幼苗，結果顯示：32個AT-hook基因受誘導表達，其中部分基因顯著上調或下調表達，推測這些基因很可能參與了番茄逆境脅迫條件下的防御應答反應。大豆含有AT-hook基序的GmHMG-I蛋白可以與大豆根瘤素基因N23和質體藍素基因的啟動子相互作用[12-13]；也有研究認為，大豆的HMG-A相似蛋白AT-1SNBP能夠結合到大豆谷氨酞胺合成酶基因GSI5的啟動子上，作為結構蛋白維持該啟動子的空間構象[14]。

作者前期從大豆酵母雙雜交文庫中篩選到1個HMGB1基因，該基因編碼的氨基酸序列中含有AT-hook基序。本研究從大豆中分離出5個AT-hook基因，分析其基因序列、蛋白質結構及基因的數字表達，并與野大豆(GlycinesojaSieb. et Zucc.)進行了序列比較，還通過煙草(NicotianatabacumLinn.)表皮細胞進行了亞細胞定位，以系統(tǒng)研究大豆AT-hook基因及其編碼蛋白。

1 材料和方法

1.1 材料

所用大豆品系Willasm82、大腸桿菌DH5α、農桿菌GV3101、過表達載體pMDC83均由江蘇省農業(yè)科學院鹽土農業(yè)研究中心保存。載體pGEM-T購自Promega公司，載體構建所用的KOD DNA聚合酶、質粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別購自寶生物工程(大連)有限公司和天根生化科技(北京)有限公司。實驗用引物合成和序列測定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 基因克隆

PCR體系含cDNA 2.0 μL、10×PCR緩沖液5.0 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 4.0 μL、2 mmol·L-1MgSO43.0 μL，10 μmol·L-1上游和下游引物各1.5 μL、KOD DNA聚合酶1.0 μL，ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序為：98 ℃ 預變性3 min；98 ℃變性5 s、55 ℃退火10 s、68 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；暫停程序，加入1.0 μL KOD DNA聚合酶，68 ℃延伸10 min。電泳檢測后將PCR產物送交南京金斯瑞生物科技有限公司測序，獲得目的基因序列，所用引物見表1。

1.3 序列信息分析

利用www.soybase.org網站提供的數據庫分析核實基因序列，利用www.ncbi.nlm.nih.gov網站的BLASTp程序分析目的蛋白的結構域和預測保守氨基酸，利用Vector NTI軟件(美國Invitrogen公司)進行多重比對和系統(tǒng)進化樹的構建。

1.4 基因數字表達分析

從公共數據庫(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/；https：∥www.soybase.org/；https：∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Gmax)下載共享的大豆不同組織的轉錄組測序原始數據(clean reads)。使用已得到的大豆基因GmAHL1、GmAHL2、GmAHL3、GmAHL4和GmAHL5為參考序列，使用短reads比對軟件SOAP2/SOAPaligner將clean reads比對到參考序列上，并利用RPKM法[15]計算基因在不同組織中的表達量。

表1大豆GmAHLs基因PCR擴增的引物序列

Table1PrimersequencesusedforPCRamplificationofGmAHLsgenesfromGlycinemax(Linn.)Merr.

引物 Primer正向引物序列(5'→3') Sequenceofforwardprimer(5'→3')反向引物序列(5'→3') Sequenceofreverseprimer(5'→3')P1CACCATGATGGGCAAGAAGAAGCCACTGCTCTTTCTGGGTTTGCTTTTCP2CACCATGATGGGTAAGAAGAAGCCACTACTCTTTCTGGGTTTGCTTTTCP3CACCATGGGGAAAAAGAAGCGCCAAGTGCTTTTTCTGGGTTTGCTTTP4CACCATGGGGAAAAAGAATCGCCAAGTGCTTTTTCTGGGTTTGCTTT

1.5 亞細胞定位分析

設計5′端添加CACC的正向引物和3′端去除終止密碼子的反向引物(表1)，利用pENTRTM/D-TOPO vector將GmAHL1、GmAHL2、GmAHL3和GmAHL4基因置換到中間載體上，利用Gateway LR ClonaseTM試劑盒將目的基因置換到植物表達載體pMDC83上，構建pMDC83-GmAHLs-GFP，然后測序驗證。利用凍融法[16]將pMDC83-GmAHLs-GFP轉化農桿菌GV3101，然后注射煙草表皮，參照李曉君等[17]的方法，25 ℃培養(yǎng)24 h，采用ZEISS LSM510 Meta激光共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司)觀察GFP信號，確定GmAHLs蛋白的亞細胞定位，同時用DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)進行細胞核熒光染色。

2 結果和分析

2.1 GmAHLs基因的克隆與序列分析

從公共數據庫https：∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Gmax網站找到大豆中5個含有AT-hook基序的基因，登陸號分別為Glyma14g074800、Glyma04g032400、Glyma06g032300、Glyma14g075100和Glyma17g250300，依次命名為GmAHL1、GmAHL2、GmAHL3、GmAHL4和GmAHL5，其中，GmAHL5為GmAHL1的重復基因。序列分析結果顯示：GmAHL1基因包含3個內含子和4個外顯子，其余4個基因均無內含子。

對大豆GmAHLs蛋白與野大豆GsAHLs蛋白的氨基酸序列進行多重比對， 結果見圖1。大豆GmAHL1、GmAHL2、GmAHL3、GmAHL4和GmAHL5蛋白的AT-hook基序分別位于其氨基酸序列的42～54、39～51、42～54、41～53及42～54處，且GmAHL1和GmAHL5蛋白的氨基酸序列完全一致。對大豆GmAHL蛋白與野大豆GsAHL蛋白的氨基酸序列進行比較，在C端GsAHL1蛋白的氨基酸序列較GmAHL1蛋白少了1個氨基酸S，GmAHL2蛋白與GsAHL2蛋白，以及GmAHL4蛋白與GsAHL4蛋白的氨基酸序列完全一致，GmAHL3蛋白與GsAHL3蛋白的氨基酸序列有3個氨基酸存在差異；GmAHL5蛋白與GsAHL5蛋白的氨基酸序列差異較大，且GsAHL5蛋白氨基酸序列的RGRP基序缺少1個P。

GmAHL1，GmAHL2，GmAHL3，GmAHL4，GmAHL5： 大豆Glycine max (Linn.) Merr.； GsAHL1，GsAHL2，GsAHL3，GsAHL4，GsAHL5： 野大豆G. soja Sieb. et Zucc.圖1 大豆GmAHLs蛋白與野大豆GsAHLs蛋白的氨基酸序列的多重比對結果Fig. 1 Result of multiple alignment of amino acid sequences of GmAHLs proteins from Glycine max (Linn.) Merr. and GsAHLs proteins from G. soja Sieb. et Zucc.

將大豆GmAHLs蛋白與含有AT-hook基序的其他植物的H1組蛋白進行系統(tǒng)樹進化分析，結果見圖2。大豆GmAHLs蛋白和野大豆GsAHLs蛋白與其他植物H1組蛋白的親緣關系較遠，表明盡管大豆GmAHLs蛋白均為AT-hook蛋白，但不屬于H1組蛋白。

2.2 GmAHLs基因的數字表達分析

大豆GmAHLs基因在不同組織中的數字表達結果見圖3。由圖3可見：GmAHL1基因在所有檢測的大豆組織中均不表達；GmAHL2基因主要在花、種子、葉片和根中表達，其在根中的表達受氨的誘導；GmAHL3基因主要在花、葉片、莖和根尖分生組織中表達，在種子中表達量較低，在果莢中不表達，其根部的表達受硝酸鹽、尿素和根瘤菌的抑制，但在根瘤中有表達；GmAHL4基因在根瘤中高度表達，根、莖端分生組織、莖和果莢中也有較高表達；GmAHL5基因主要在葉片、種子、根尖分生組織和花中表達。

分支上的數據表示bootstrap百分比Datums above the branches indicate percentage of bootstrap. GmAHL1，GmAHL2，GmAHL3，GmAHL4，GmAHL5： 大豆Glycine max (Linn.) Merr.； GsAHL1，GsAHL2，GsAHL3，GsAHL4，GsAHL5： 野大豆G. soja Sieb. et Zucc.； MmH1： Musa acuminata subsp. malaccensis (Ridl.) N. W. Simmonds； TaH1： 小麥Triticum aestivum Linn.； LlH1： 麝香百合Lilium longiflorum Thunb.； SbH1： 高粱Sorghum bicolor (Linn.) Moench； ZmH1： 玉米Zea mays Linn.； BdH1： 二穗短柄草Brachypodium distachyon (Linn.) P. Beauv.； OsH1： 水稻Oryza sativa Linn.； ObH1： Oryza brachyantha A. Chev. et Roehrich.圖2 大豆GmAHLs蛋白與其他植物H1組蛋白的NJ系統(tǒng)樹Fig. 2 NJ phylogenetic tree of GmAHLs proteins from Glycine max (Linn.) Merr. and H1 histones from other species

紅色—黃色—綠色表示基因表達量從0到最大 Red-green-yellow means that the expression of gene increasing from zero to the maximum.圖3 大豆GmAHLs基因在不同組織中的數字表達Fig. 3 Digital expression of GmAHLs genes from Glycine max (Linn.) Merr. in different tissues

2.3 GmAHLs蛋白的亞細胞定位分析

由于GmAHL1和GmAHL5蛋白具有完全相同的氨基酸序列，因此，用含有pMDC83-GmAHL1-GFP、pMDC83-GmAHL2-GFP、pMDC83-GmAHL3-GFP和pMDC83-GmAHL4-GFP的GV3101農桿菌注射煙草葉片表皮后，發(fā)現4個GmAHLs蛋白的GFP標記與經過DAPI染色的細胞核很好地融合在一起(圖4)，表明這4個GmAHLs蛋白全部定位于細胞核。

DAPI： 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(細胞核熒光染色) 4′，6-diamidino-2-phenylindole (cell nuclear fluorescent staining)； GFP： 綠色熒光蛋白Green fluorescent protein； B： 明場Bright； M： 融合Merge； GmAHL1-GFP，GmAHL2-GFP，GmAHL3-GFP，GmAHL4-GFP： 分別為GmAHL1、GmAHL2、GmAHL3和GmAHL4蛋白與GFP的融合蛋白Merged proteins of GmAHL1， GmAHL2， GmAHL3， and GmAHL4 proteins with GFP， respectively.圖4 大豆GmAHLs蛋白在煙草葉片表皮細胞的亞細胞定位Fig. 4 Subcellular localization of GmAHLs proteins from Glycine max (Linn.) Merr. in epidermal cells of Nicotiana tabacum Linn. leaf

3 討 論

目前，AHLs基因在所有測序完成的植物中普遍存在，從單細胞的苔蘚到單子葉和雙子葉植物，如擬南芥、水稻、高粱〔Sorghumbicolor(Linn.) Moench〕和楊樹(Populusspp.)等[18]，這種在進化過程中的高度保守性表明AHL基因家族在植物的生長發(fā)育過程中起重要作用。根據AHL蛋白序列中保守核心氨基酸基序Arg(R)-Gly(G)-Arg(R)側翼序列氨基酸的特征，尤其是C端序列，AHL蛋白可以分為2個類型：Ⅰ型的C端為Gly(G)-Ser(S)-Lys(K)-Asn(N)-Lys(K)；Ⅱ型的C端為Arg(R)-Lys(K)-Tyr(Y)-X(任意氨基酸)[4]。Aravind等[19]則將AHL蛋白分為3類：Ⅰ型AHL蛋白的RGRP基序下游第2位置為Gly(G)；Ⅱ型AHL蛋白的RGRP基序下游第2位置為Lys(K)；Ⅲ型AHL蛋白的RGRP基序下游第4位置為Lys(K)。本研究克隆的大豆GmAHLs基因編碼的氨基酸序列僅含有1個保守的RGRP基序，且RGRP下游第2位氨基酸均為K，屬于Ⅱ型AHL蛋白。與Musaacuminatasubsp.malaccensis(Ridl.) N. W. Simmonds、小麥、麝香百合(LiliumlongiflorumThunb.)、高粱、玉米(ZeamaysLinn.)、二穗短柄草〔Brachypodiumdistachyon(Linn.) P. Beauv.〕、水稻和OryzabrachyanthaA. Chev. et Roehrich H1組蛋白的聚類分析結果顯示：大豆GmAHLs蛋白與上述植物H1組蛋白分為2類，表明大豆GmAHLs蛋白不屬于H1組蛋白，推測可能屬于非組蛋白類型，用于結合DNA與組蛋白共同構成核染色質，進而組裝成染色體。

丁麗雪等[6]利用實時熒光定量PCR技術對番茄32個植株的AT-hook基因進行組織表達分析，認為該類基因在根和花中表達較高；擬南芥AHL22基因過表達表現出開花延遲和胚軸伸長受抑制表型[20]；而Jin等[21]認為，AT-hook蛋白對于水稻的內稃形成和花器官發(fā)育是必需的，且AT-hook蛋白對植物花的發(fā)育存在較大影響。作者對數據庫中現有表達數據的分析認為，大豆AT-hook基因(GmAHL1除外)在各組織中均有不同程度的表達，并且在根部表達受外界生物和非生物脅迫的誘導。

AHL蛋白含有4個保守的RGRP殘基[2]，這個短的保守氨基酸序列對AHL蛋白結合DNA和細胞核定位是必需的[19，22]。本研究獲得的4個大豆GmAHLs蛋白均含有保守的RGRP基序，這對其定位于細胞核起到重要作用。Fujimoto等[3]研究結果表明：陸生植物的AHL蛋白在C端含有PPC結構域，通常含有LRS、GRFEIL和FTPH 3類基序之一，PPC結構域負責AHL蛋白的核定位和與其他蛋白相互作用，大豆GmAHLs蛋白在C端沒有類似的PPC基序，而本研究通過煙草注射的方法發(fā)現大豆的GmAHLs蛋白全部定位于細胞核，暗示RGRP基序可能對GmAHLs蛋白的亞細胞定位起著至關重要的作用，然而，對于該類基因在大豆植株生長發(fā)育和應答外界脅迫的功能和機制仍然需要進一步研究。

本研究首次報道并克隆了大豆中編碼AT-hook蛋白的GmAHLs基因，并對這些基因在大豆不同組織的表達以及GmAHLs蛋白的亞細胞定位進行系統(tǒng)研究，為今后該類基因在大豆中的研究奠定了基礎。

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CloningandlocalizationanalysisonfiveAT-hookgenesGmAHLsfromGlycinemax

ZHANG Dayong①， QI Weicong①， WAN Qun， LIU Jia， XU Zhaolong， HUANG Yihong， SHAO Hongbo②

(Salt-soil Agricultural Center， Institute of Agricultural Resources and Environment， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China)，J.PlantResour. &Environ.， 2017，26(4)： 1-7

Five AT-hook genes were cloned fromGlycinemax(Linn.) Merr.， which were named asGmAHL1，GmAHL2，GmAHL3，GmAHL4， andGmAHL5， respectively， in which，GmAHL5 is duplicated gene ofGmAHL1. The sequence analysis result shows that AT-hook motifs of five GmAHLs proteins are located in their amino acid sequences of 42-54， 39-51， 42-54， 41-53， and 42-54， respectively， and GmAHL1 and GmAHL5 proteins share the same amino acid sequence. There is a distant relationship between GmAHLs proteins fromG.maxand GsAHLs proteins fromG.sojaSieb. et Zucc. with H1 histones from other species， meaning that GmAHLs proteins do not belong to H1 histones.GmAHL1 gene doesn’t express in all tissues tested；GmAHL2 gene mainly expresses in flower， seed， leaf， and root；GmAHL3 gene mainly expresses in flower， leaf， stem， and root tip meristem， does not in pod， but does in root nodule；GmAHL4 gene highly expresses in root nodule， and also relatively highly does in root， shoot apical meristem， stem， and pod；GmAHL5 gene mainly expresses in leaf， seed， root tip meristem， and flower. Expression ofGmAHL2 gene in root is induced by ammonia， while that ofGmAHL3 gene in root is inhibited by nitrate， urea， and rhizobia. The subcellular location analysis result shows that GmAHLs proteins fromG.maxare located in cell nucleus. It is suggested thatGmAHLsgenes fromG.maxare nonconstitutive expression genes， in which， expressions ofGmAHL2，GmAHL3， andGmAHL4 genes have specificity and can be induced or suppressed by exogenous nitrogen and rhizobia.

Glycinemax(Linn.) Merr.； AT-hook gene；GmAHLs； cloning； expression； subcellular location

Q943.2； S565.1

A

1674-7895(2017)04-0001-07

10.3969/j.issn.1674-7895.2017.04.01

2017-08-03

國家自然科學基金資助項目(31600211)； 江蘇省農業(yè)三新工程項目〔SXGC(2016)335〕； 江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目〔CX(15)1005〕

張大勇(1979—)，男，山西汾陽人，博士，副研究員，主要從事大豆耐鹽分子生物學方面的研究。戚維聰(1981—)，男，河北承德人，博士，助理研究員，主要從事植物抗逆方面的研究。

①共同第一作者

②通信作者E-mail： shaohongbochu@126.com

張明霞)