(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2017.11.019

不同劑量褪黑素對(duì)多浪羊受胎及產(chǎn)羔效果的影響

阿爾曼·海熱1，艾合買提江·吐爾遜1，宋玉坤1，2，王旭光1，努日比婭姆·麥麥提托合提1，劉國世1，2，阿布力孜·吾斯曼1

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193)

目的研究褪黑素對(duì)多浪羊受胎及產(chǎn)羔效果的影響，提高多浪羊繁殖率。方法研究注射褪黑素提高受胎率和產(chǎn)羔率的方法，選擇年齡、胎次、體況相似的57只多浪羊母羊，試驗(yàn)羊隨機(jī)分為三組同時(shí)進(jìn)行同期發(fā)情處理，并在撤栓36 h后皮下注射褪黑素注射劑。試驗(yàn)1組1 mL (5 mg)、試驗(yàn)2組2 mL (10 mg) 、對(duì)照組0 mL。并在埋栓前(中午12:00)、撤栓時(shí)(中午12:00)、撤栓后36 h(晚上24:00)、配種時(shí)(撤栓后48 h，中午12:00)、配種后20 d五個(gè)時(shí)間段采集血清，采用放射免疫法對(duì)其褪黑素含量進(jìn)行測(cè)定與分析；配種后第45 d采用B超監(jiān)測(cè)法檢測(cè)三組的受胎率；在產(chǎn)羔后比較這三組的產(chǎn)羔率。結(jié)果試驗(yàn)1組受胎率顯著高于試驗(yàn)2組和對(duì)照組(P<0.05)，試驗(yàn)2組與對(duì)照組之間差異不顯著(P>0.05)；對(duì)產(chǎn)羔率而言，三組之間相互比較后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論對(duì)多浪羊進(jìn)行同期發(fā)情處理時(shí)，撤栓后36 h皮下注射1、2 mL褪黑素會(huì)提高受胎率，其中1 mL的受胎率高于2 mL ，但是對(duì)產(chǎn)羔率無顯著影響。

褪黑素；多浪羊；受胎效果；產(chǎn)羔

0 引 言

【前人研究進(jìn)展】褪黑素(Melatonin , MT)發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)20年代，是McCord和Allen在牛松果腺提取物中分離出的一種使小蠟蚌皮膚黑色素發(fā)生凝聚反應(yīng)從而變白的物質(zhì)，因而得名[1]。褪黑素可結(jié)合 OH、次氯酸(HOCl)、H2O2等活性氧，還能與氧化氮基(NO)及過氧亞硝酸根(ONOO-)等結(jié)合，是一種廣譜抗氧化劑[2]。此外，褪黑素還可以有效地減少氧化應(yīng)激引起的染色體和線粒體DNA的損傷，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[3]。褪黑素作為強(qiáng)抗氧化劑已經(jīng)應(yīng)用在牛、羊、豬、老鼠、家禽等多種動(dòng)物的卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟以及胚胎發(fā)育等各方面[4]。褪黑素作為一種強(qiáng)抗氧化劑，經(jīng)常運(yùn)用在體外細(xì)胞、胚胎培養(yǎng)中。對(duì)動(dòng)物體直接注射或埋植褪黑素的研究，正在起步階段?，F(xiàn)今已在雞、鵝等家禽，以及牛、鹿等動(dòng)物身上直接注射或埋植過，最終得出對(duì)其繁殖性能方面有積極作用的結(jié)果[5]。目前褪黑素在動(dòng)物生殖生產(chǎn)當(dāng)中的研究不斷發(fā)展，在抗氧化、抗衰老、提高雄性動(dòng)物的精液品質(zhì)、雌性動(dòng)物卵母細(xì)胞的發(fā)育等方面取得了一些成績[6]。在綿羊上通過埋植褪黑素來誘導(dǎo)母羊提前發(fā)情的研究也取得了較好的成果[7]。研究注射褪黑素提高受胎率和產(chǎn)羔率的方法，以達(dá)到提高多浪羊的繁殖率為目的?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】對(duì)綿羊進(jìn)行注射褪黑素的研究尚未有報(bào)道。試驗(yàn)通過注射褪黑素，研究對(duì)多浪羊受胎及產(chǎn)羔效果的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇繁殖周期正常，健康無病，體況大致相同(體重、手術(shù)次數(shù)、年齡、經(jīng)產(chǎn)次數(shù)等差異不大)2～4歲的多浪羊空懷母羊57只進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 所用材料與藥品

于2016年11月～2017年4月在和田地區(qū)洛浦縣真心養(yǎng)殖農(nóng)民專業(yè)合作社進(jìn)行。埋栓槍，脫脂棉，紗布，口罩，手套，注射器(1、5、10和50 mL),溫度計(jì)，玻璃棒，石蠟油，假陰道，集精杯，精液稀釋液，顯微鏡，蓋玻片，載玻片，生理鹽水，酒精，碘液，頭燈，開腔器，輸精器，腹腔鏡，腹腔鏡輸精器，采血管。

羊用孕酮硅膠陰道栓(CIDR)，孕馬血清促性腺激素(PMSG)為寧波三生藥業(yè)生產(chǎn)，促性腺激素釋放激素(A3)由上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所提供，褪黑素注射劑(MT)自制。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)分組

將57只試驗(yàn)?zāi)秆螂S機(jī)分為三組，試驗(yàn)1組(20只)、實(shí)驗(yàn)2組(20只)、對(duì)照組(17只)。試驗(yàn)1、2組撤栓后36 h注射褪黑素，試驗(yàn)1組注射1 mL(5 mg)、試驗(yàn)2組注射2 mL(10 mg)，對(duì)照組不做處理。保證使用相同的飼料飼喂，自由飲水。

1.2.2 試驗(yàn)羊處理

對(duì)試驗(yàn)羊埋植孕酮海綿陰道栓(CIDR)進(jìn)行同期發(fā)情處理。每組隨機(jī)挑選6只試驗(yàn)羊做出標(biāo)記，在實(shí)驗(yàn)過程中分別于埋栓前(中午12:00)、撤栓時(shí)(中午12:00)、撤栓后36 h(晚上24:00)、配種時(shí)(撤栓后48 h，中午12:00)、配種后20 d五個(gè)時(shí)間段采集血清。

在埋植后的第13 d撤栓，注射孕馬血清(PMSG)，進(jìn)行采血分離血清，標(biāo)記為第一次采樣。在撤栓后第36 h進(jìn)行第二次采血，同時(shí)注射褪黑素針劑。撤栓后第48 h進(jìn)行人工授精，并注射促排3號(hào)(A3)，同時(shí)采血。配種后第20 d采血。輸精后第45 d進(jìn)行B超檢測(cè)，產(chǎn)羔后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)羔數(shù)量。

1.2.3 輸精

試驗(yàn)采用腹腔鏡人工輸精方法，在撤栓后第48 h統(tǒng)一對(duì)所有試驗(yàn)羊進(jìn)行輸精。輸精前12～24 h輸精母羊禁食空腹；手術(shù)器械等提前用0.1%新潔爾滅液浸泡30 min。將待輸精羊保定在手術(shù)移植車上，手術(shù)部位經(jīng)剪毛、剃毛、常規(guī)消毒，術(shù)時(shí)呈仰臥斜倒立保定，角度為45～60°。在輸精時(shí)，腹腔鏡的套管穿刺針在輸精母羊腹部乳房下10～14 cm處的位置刺入最佳，并且1.0和0.5 cm直徑穿刺針應(yīng)分別在腹中線兩側(cè)刺入，其中0.5 cm直徑穿刺針刺入的方向應(yīng)以操作者最適宜的操作手臂側(cè)為主，這樣可便于使用骨科長鉗進(jìn)行母羊卵巢狀況觀察及進(jìn)行子宮內(nèi)輸精針的操作。當(dāng)確定所觀察母羊可以進(jìn)行輸精時(shí)，用套管長鉗將要輸精側(cè)的子宮角調(diào)整到子宮角中線正對(duì)視野方向,以便于進(jìn)行輸精操作。然后撤出套管長鉗，在子宮內(nèi)輸精槍吸入精液后，插入剛剛撤出長鉗的套管內(nèi)，借助于冷光源探頭的觀察，沿著子宮角正中線，靠近子宮體側(cè)的子宮角上1/3處[8]，調(diào)整好子宮內(nèi)輸精槍的方向后，以點(diǎn)式快速刺入的手法，將輸精槍的前端細(xì)針完全刺入子宮角內(nèi)，刺入的感覺類似于用針刺破有彈性的乳膠手套或氣球，然后慢慢將精液輸?shù)阶訉m角內(nèi)。

1.2.4 血液樣品采集

頸靜脈采集5 mL血液，置于含有促凝劑的采血管中，3 000 轉(zhuǎn)/分離心10 min，取上層血清置于1.5 mL滅菌離心管中，-80℃保存?zhèn)錅y(cè)。

血樣測(cè)定是由北京北方生物技術(shù)研究所有限公司，采用放射免疫法在XH6080放免儀上進(jìn)行檢測(cè)。收集所有樣品后，進(jìn)行一次檢測(cè)，批內(nèi)變異系數(shù)為2.4% 。圖1

圖1 褪黑素測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig.1 Standard curve of melatonin

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)先用Excel作初步統(tǒng)計(jì)，采用SPSS軟件進(jìn)行重復(fù)數(shù)不等的方差分析，處理間的差異采用LSD、Duncan檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05 作為差異顯著性評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液中褪黑素的變化

研究表明，在埋栓之前這三組血液中褪黑素含量都較低，在撤栓時(shí)都有了明顯的提高，其中試驗(yàn)1組與試驗(yàn)2組直到配種時(shí)，血液中褪黑素的變化都呈現(xiàn)穩(wěn)定的上升趨勢(shì)，在配種后第20 d則表現(xiàn)出顯著的下降(P<0.05)；但是對(duì)照組從埋栓時(shí)到撤栓后36 h，血液中褪黑素的變化呈現(xiàn)出下降，在配種時(shí)則表現(xiàn)出顯著的上升，在配種后第20 d也表現(xiàn)出一定的上升趨勢(shì)，而且明顯高出試驗(yàn)1、2組(P<0.05)；試驗(yàn)1組與試驗(yàn)2組之間褪黑素含量的變化沒有顯著差異(P>0.05)，只是在配種時(shí)試驗(yàn)1組血液中褪黑素的含量略高于試驗(yàn)2組。表1，圖2

表1 血液中褪黑素變化
Table 1 Changes of melatonin in blood

組別第一次采血(埋栓之前)褪黑素濃度(pg/m)第二次采血(撤栓時(shí))褪黑素濃度(pg/mL)第三次采血(撤栓后36h)褪黑素濃度(pg/mL)第四次采血(配種時(shí))褪黑素濃度(pg/mL)第五次采血(配種后第20d)褪黑素濃度(pg/mL)試驗(yàn)1組83.640206.5597a360.894A542.658a248.3505a試驗(yàn)2組102.352301.2783b467.717A512.9386a308.5272b對(duì)照組75.825343.123b204.55BB427.7203b538.2356AB

注：同列數(shù)據(jù)，肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同或不標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)；肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同

Note：in the same row, values with different lower case letter superscripts mean significant difference(P<0.05); with the same superscripts or non-letter mean no significant difference(P>0.05); While with different capital letters mean significant difference (P<0.01), the same as below

圖2 血液中褪黑素變化
Fig.2 changes of melatonin in the blood

2.2 注射不同褪黑素劑量對(duì)受胎及產(chǎn)羔效果的影響

研究表明，試驗(yàn)1組受胎率為75.0%，試驗(yàn)2組為55.0%，對(duì)照組為58.82%。由此可以看出，試驗(yàn)1組的受胎率明顯高于其他兩組(P<0.05)；而試驗(yàn)2組與對(duì)照組之間差異并不顯著(P>0.05)。

對(duì)產(chǎn)羔率而言，對(duì)照組為80.00%，試驗(yàn)1組產(chǎn)羔率為86.67%，試驗(yàn)2組為90.91%。試驗(yàn)結(jié)果顯示，三組之間相互比較后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說明對(duì)多浪羊進(jìn)行同期發(fā)情處理，在撤栓后36 h皮下注射1 mL、2 mL褪黑素對(duì)于多浪羊產(chǎn)羔率無影響。表2

表2 注射不同劑量褪黑素下受胎及產(chǎn)羔效果
Table 2 The effect of injection of different doses of melatonin on pregnancy and lambing effect

試驗(yàn)分組處理及授精羊數(shù)褪黑素劑量(mL)受胎羊數(shù)受胎率(%)產(chǎn)羔數(shù)產(chǎn)羔率(%)備注試驗(yàn)1組2011575.0a1386.67a流產(chǎn)2只試驗(yàn)2組2021155.0b1090.91a流產(chǎn)1只對(duì)照組1701058.82b880.00a流產(chǎn)2只

3 討 論

3.1 血液中褪黑素的變化

新疆綿羊品種大多數(shù)屬于季節(jié)性發(fā)情，一般在秋季配種，春季產(chǎn)羔。在自然光周期條件下，春夏季的光周期延長和夏季至后的光周期縮短共同協(xié)調(diào)母羊在秋季進(jìn)入繁殖季節(jié)，春夏兩季的長光照起著協(xié)調(diào)內(nèi)源節(jié)律的作用，從而使綿羊在秋季自發(fā)啟動(dòng)生殖活性，傳統(tǒng)上將綿羊劃成“短光照型生殖動(dòng)物”[9]。有研究表明，褪黑素對(duì)羊的生殖活動(dòng)影響較大，如能使公母羊初情期提前、促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育、提高精子質(zhì)量等[6]。褪黑素能直接調(diào)控卵巢的生理功能，參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟等功能。在哺乳動(dòng)物卵巢中存在褪黑素的兩種膜受體和核受體。褪黑素在卵巢中的一些功能可以通過膜受體介導(dǎo)，這些受體廣泛的存在于成熟卵泡中的卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞上[2]。

楊啟堂等[10]褪黑素分為2組：150 mg/只，300 mg/只的劑量。45 d后，抽取血樣并進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用150 mg/只和300 mg/只的劑量處理雌性馬鹿后，血液中褪黑素的水平為41.398和45.422 pg/mL，而未處理組中褪黑素的水平為44.011 pg/mL，說明只有褪黑素達(dá)到一定劑量后，才會(huì)增加馬鹿血液中褪黑素的濃度。在試驗(yàn)中對(duì)試驗(yàn)1、2組注射褪黑素后，血液中的褪黑素含量呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，但是與對(duì)照組的差異不顯著(P>0.05)。這與楊啟堂等[10]的試驗(yàn)結(jié)果一致，證明褪黑素劑量需達(dá)到一定數(shù)值，才會(huì)增加血液中褪黑素的濃度。

王梁等[11]在試驗(yàn)中得出，對(duì)照組母鹿的褪黑激素濃度在撤栓前呈下降趨勢(shì)，撤栓后褪黑素迅速下降。在試驗(yàn)中對(duì)照組在撤栓后36 h呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這與王梁等[11]的試驗(yàn)結(jié)果一致。而試驗(yàn)1、2組呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這說明注射褪黑素可以使血液內(nèi)褪黑素水平升高。

試驗(yàn)1、2組從撤栓時(shí)直到配種時(shí)，血液中褪黑素的變化都呈現(xiàn)穩(wěn)定的上升趨勢(shì)，在配種后第20 d則表現(xiàn)出顯著的下降(P>0.05)；但是對(duì)照組從埋栓時(shí)到撤栓后36 h，血液中褪黑素的變化呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，在配種時(shí)則是顯著的上升(P<0.05)，在配種后第20 d也表現(xiàn)出一定的上升，而且明顯高出注射了試驗(yàn)1、2組(P>0.05)；試驗(yàn)1、2組間，只有在配種時(shí)試驗(yàn)1組血液中褪黑素的含量高出了試驗(yàn)2組，而其他時(shí)間段試驗(yàn)1組均小于試驗(yàn)2組，但是并沒有呈現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)。

3.2 注射不同褪黑素劑量對(duì)受胎及產(chǎn)羔效果的影響

褪黑素對(duì)生殖系統(tǒng)的作用對(duì)動(dòng)物種類、生理狀態(tài)不同的個(gè)體表現(xiàn)出抑制、促進(jìn)或無作用等多重性。有學(xué)者通過改變光照時(shí)間長短、測(cè)定動(dòng)物體內(nèi)MT水平、給予外源性MT等方式初步得出結(jié)論，MT對(duì)牛、鼠類、禽等動(dòng)物和人的生殖系統(tǒng)的發(fā)育表現(xiàn)出抑制作用；但對(duì)綿羊、鹿等動(dòng)物表現(xiàn)出促進(jìn)作用；而對(duì)光不敏感的動(dòng)物無作用[12-13]。褪黑素能直接調(diào)控卵巢的生理功能，參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟等功能。在哺乳動(dòng)物卵巢中存在褪黑素的兩種膜受體和核受體。褪黑素在卵巢中的一些功能可以通過膜受體介導(dǎo)，這些受體廣泛存在于成熟卵泡中的卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞上[2]。

史建民等[14]研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與奶牛受胎率關(guān)系密切的指標(biāo)——配種時(shí)血液中褪黑素的濃度。研究發(fā)現(xiàn)，配種時(shí)血液中褪黑素濃度高的奶牛配種后更容易妊娠。通過皮下注射的方式增加血液中褪黑素的濃度可以提高奶牛的產(chǎn)后首次配種受胎率，夏季可達(dá)到(26.15±2.00)%，春季可達(dá)到(44.00±2.28)%，還可以降低死胎率，而對(duì)犢牛性別、體重和成活率沒有影響。試驗(yàn)中試驗(yàn)1組在配種時(shí)血液中褪黑素濃度高于試驗(yàn)2組和對(duì)照組，受胎率也顯著高于這兩組(P<0.05)，這一結(jié)果與史建民等[14]的研究結(jié)果一致。以此證明，配種時(shí)血液中褪黑素濃度高的綿羊容易妊娠，且褪黑素有提高受胎率的作用。但是輸精前注射褪黑素對(duì)產(chǎn)羔率沒有影響，這可能是由于褪黑素針劑的作用效果持續(xù)時(shí)間短有關(guān)，因此，褪黑素對(duì)提高綿羊產(chǎn)羔效果的作用有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

4.1 對(duì)多浪羊進(jìn)行同期發(fā)情處理時(shí)，撤栓后36 h皮下注射1和2 mL褪黑素會(huì)使得母羊血液內(nèi)的褪黑素水平升高，并且試驗(yàn)1組與試驗(yàn)2組之間褪黑素水平的變化沒有顯著差異。

4.2 對(duì)多浪羊進(jìn)行同期發(fā)情處理時(shí)，撤栓后36 h皮下注射1和2 mL褪黑素會(huì)提高受胎率，其中1 mL的受胎率高于2 mL。

4.3 對(duì)多浪羊進(jìn)行同期發(fā)情處理時(shí)，撤栓后36 h皮下注射1和2 mL褪黑素對(duì)多其產(chǎn)羔率無顯著影響。

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EffectsofDifferentDosesofMelatoninonDuolangSheepPregnancyandLambingEffect

Aerman Haire1, Aihemaitijiang Tuerxun1, SONG Yu-kun1,2, WANG Xu-guang1,Nuribiyamu Maimaitituoheti1, LIU Guo-shi1,2, Abulizi Wusiman1

(1.CollegeofAnimalScience,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)

ObjectiveTo study the influence of melatonin on Duolang sheep pregnancy and lambing effect, to select the optimal amount to improve the pregnancy rate and lambing rate and improve the reproduction rate.MethodThis study selected 57 Duolang sheep ewes with similar age, parity and body condition from November 2016 to April 2017 to conduct experiments in the professional farmers' cooperatives in Luopu County of Hotan area. Sheep were randomly divided into three groups at the same time for the same period of estrus, and after the withdrawal of 36 hours, the test group I was injected melatonin 1 mL (5 mg), the test group II 2 mL (10 mg), the control group 0ml. And before the burying bolt (12 o'clock midday), bolt withdrawal (12 o'clock midday), 36 hours after the bolt withdrawal (12 o'clock midnight), the breeding (48 hours after embolization, serum withdrawal) of the five time periods for 20 days after the acquisition of its breeding, melatonin contents were determined and analyzed by radioimmunoassay; forty-fifth days after mating, they went through B-monitoring assay in three groups' pregnancy for the lambing rate; After the birth, the lambing rate of the three groups was compared.ResultThe test results showed that the pregnancy rate of test group I was significantly higher than that of the test group II and the control group (P< 0.05), there was no significant difference between test group II and control group (P> 0.05); As for the the lambing rate, comparison between the three groups demonstrated no significant difference (P> 0.05).ConclusionWhen treating Duolang sheep estrus, subcutaneous injection of 1 mL, 2 mL melatonin 36 hours after the withdrawal of thrombus can improve the pregnancy rate. The pregnancy rate of 1 mL injection amount is higher than that of 2 mL injection, but no significant effect is found on the lambing rate.

melatonin; Duolang sheep; pregnancy effect; lambing

Supported by: Science and Technology Supporting Xinjiang Program (2016E02037), National Spark Program (2015GA890002) and The China Agricultural University - Xinjiang Agricultural University Joint Fund Project(2015TC050)

Abulizi Wusiman(1968-), male, from Xinjiang, doctor’s degree, professor, research area is animal reproduce and Embryo biotechnology, (E-mail) abulizi68@126.com

S826.3+1

A

1001-4330(2017)11-2111-07

2017-05-17

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目“”(2016E02037)；國家星火計(jì)劃項(xiàng)目“”(2015GA890002)；中國農(nóng)業(yè)大學(xué)-新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合基金項(xiàng)目“”(2015TC050)

阿爾曼·海熱(1991-)，男，新疆人，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物生殖生理與繁殖技術(shù)，(E-mail)arman.hairy@foxmail.com

阿布力孜·吾斯曼(1968-)，男，新疆和田人，教授，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物繁殖與胚胎生物技術(shù)，(E-mail)abulizi68@126.com