馬 芬, 馮 鋒

(江蘇省南京明基醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 南京, 210019)

恩度促進(jìn)與肺癌細(xì)胞A549共培養(yǎng)體系中的HUVEC凋亡及其機(jī)制研究

馬 芬, 馮 鋒

(江蘇省南京明基醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 南京, 210019)

恩度; 肺癌細(xì)胞A549; HUVEC凋亡; 機(jī)制

本研究對恩度促進(jìn)與肺癌細(xì)胞A549共培養(yǎng)體系中的HUVEC凋亡及其機(jī)制進(jìn)行了研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

購買煙臺麥得津生物工程有限公司生產(chǎn)的重組人血管內(nèi)皮抑制素，購買中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs、人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株，購買湖南長沙長錦科技有限公司生產(chǎn)的CO2培養(yǎng)箱，購買杭州四季青公司生產(chǎn)的批號為110213的胎牛血清，購買武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)的Bax, Bcl-2抗體、鏈霉素親和生物素酶復(fù)合物(SABC), 購買南京凱基生物公司生產(chǎn)的Annexin V2FITC凋亡檢測試劑盒，購買日本Olympus IX71倒置熒光顯微鏡奧林巴斯BX51熒光顯微鏡，購買新加坡ESCO公司生產(chǎn)的超凈工作臺，購買GIBCO生產(chǎn)的DMEM與RPMI1640培養(yǎng)基，購買美國Sigma公司生產(chǎn)的3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT), 購買日本Osaka Takeda公司生產(chǎn)的O-(氯乙酰-氨基酰基)煙曲霉醇(TNP-470), 購買美國Moleculor Devices生產(chǎn)的SPECTRAmax190酶聯(lián)分析儀, Corning Transwll遷移小室直徑、孔徑分別為6 mm、5 μm。

1.2 方法

1.2.1 A549細(xì)胞與HUVECs細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立: 將對數(shù)生長期的A549取出來，對其進(jìn)行消化，在此過程中將0.25%胰腺充分利用起來，在RPMI-1640培養(yǎng)基中加入，將A549單細(xì)胞懸液制備出來，密度為2×104細(xì)胞/mL。同時將對數(shù)生長期的HUVECs細(xì)胞取出來，對其進(jìn)行消化，在此過程中將0.01%EDTA充分利用起來，在RPMI-1640培養(yǎng)基中加入，將HUVECs單細(xì)胞懸液制備出來，密度為1×105細(xì)胞/mL。分別在A549細(xì)胞、HUVECs上接種6孔板Transwell小室的上室、下室，在RPMI-1640培養(yǎng)基中加入，其含10%胎牛血清，培養(yǎng)成分為100 U/mL鏈霉素+100 U/mL青霉素，以使上室細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)基中得到切實有效的保證。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中對Transwell板進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 恩度共培養(yǎng)體系中對HUVECs生長抑制作用: 在下室HUVECs長到75%～85%融合度的情況下，用含藥培養(yǎng)基處理細(xì)胞。恩度的濃度分別為10、20、40、80、100 μg/mL, 陽性對照組為終濃度為25 μg/mL的TNP-470, 空白對照組加100 μL培養(yǎng)基代替，另將對照孔設(shè)置為本底，其屬于無細(xì)胞培養(yǎng)液，體積同上，含有相應(yīng)濃度藥物，每組將3個平行孔設(shè)置起來。進(jìn)行2 d的孵育后將每孔的含藥血清棄去，將1 mL不含血清的培養(yǎng)基重新加入，另將20 μL 5 mg/mL的MTT液加入，在培養(yǎng)箱中進(jìn)行4 h的孵育，將液體棄去，將100 μL二甲基亞砜(DMSO)加入每孔，在振蕩器中進(jìn)行10 min的振蕩，在580 nm波長處采用酶聯(lián)免疫檢測儀對OD值進(jìn)行測定，計算出生長抑制率，方法為對照組與實驗組OD值之差與對照組OD值的百分率，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 HUVECs凋亡測定: 對細(xì)胞進(jìn)行接種，并對其進(jìn)行藥物處理，然后進(jìn)行2 d的培養(yǎng)，對細(xì)胞凋亡進(jìn)行測定，在此過程中將Annexin V-FITC試劑盒充分利用起來，用胰酶-EDTA消化下室HUVECs細(xì)胞，將細(xì)胞收集起來，將消化終止，在此過程中將培養(yǎng)基充分利用起來。每個樣本計數(shù)1×104細(xì)胞。對收集的細(xì)胞進(jìn)行2遍的潤洗，在此過程中將冷的PBS充分利用起來，用500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，將5 μL Annexin V-FITC加入其中，以輕柔的動作混勻。測定前將5 μL PI加入其中，同時在暗處放置，進(jìn)行15 min的避光反應(yīng)。上機(jī)測定，每組平行2個樣本。

1.2.4 恩度對HUVECs中Bcl-2與Bax凋亡蛋白的影響檢測: 對恩度對共培養(yǎng)體系中HUVECs中Bcl-2與Bax凋亡蛋白的影響進(jìn)行評價，在此過程中將鏈霉親和生物素酶復(fù)合物(SABC)方法充分利用起來。將HUVECs接種在玻片上，恩度的濃度為10、20、40 μg/mL。進(jìn)行2 d的培養(yǎng)后用PBS對細(xì)胞進(jìn)行3次清洗，每次1 min，室溫下對4%多聚甲醛進(jìn)行90 min的固定，進(jìn)行3次洗滌，在此過程中將PBS充分利用起來，每次2 min。進(jìn)行30 min的處理，在此過程中將H2O2充分利用起來，進(jìn)行3次洗滌，在此過程中將PBS充分利用起來，每次2 min, 然后在37 ℃的溫度下對10%封閉血清進(jìn)行20 min的孵育。將1∶200 Bcl-2與1∶200 Bax抗體加入其中，在37 ℃的溫度下進(jìn)行2 h的孵育，之后將二抗加入其中，進(jìn)行20 min的孵育，用PBS洗滌，對樣本進(jìn)行處理，在此過程中將SABC溶液充分利用起來。最后用0.3 mg/mL 3, 3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)處理，鏡下對反應(yīng)時間進(jìn)行控制，輕度復(fù)染、洗滌、封片，在此過程中分別將蘇木素、PBS、中性樹膠充分利用起來。采用Image-ProPlus圖像分析軟件鏡下拍片。陰性對照組用PBS將一抗取代掉。

1.2.5 Bcl-2與Bax蛋白檢測: 進(jìn)行Western blotting, 對細(xì)胞進(jìn)行消化并將其收集起來，在此過程中將胰酶-EDTA充分利用起來，將400 μL裂解液加入其中前將冰冷PBS加入其中進(jìn)行3次潤洗，在冰上放置對細(xì)胞進(jìn)行30 min的裂解。在4 ℃離心機(jī)中進(jìn)行離心，速率和時長分別為14 000 r/min、5 min, 將上清液提取出來，對蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測定，然后進(jìn)行SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜。室溫下對TBST進(jìn)行1 h的封閉，在此過程中將含5%胎牛血清白蛋白(BSA)充分利用起來，將Bcl-2與Bax抗體加入，在4 ℃溫度的搖床過夜。將1∶1 000 HRP-IgG二抗加入其中雜交，洗膜后顯色。在凝膠成像系統(tǒng)中放置，分析Bcl-2與Bax蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0分析所得數(shù)據(jù)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示所有數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)組間差異比較用One-way ANOVA方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

恩度對HUVECs增殖抑制作用、誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡情況分析見表1。恩度對HUVECs中Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)的影響分析見表2。

表1 恩度對HUVECs增殖抑制作用、誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡情況分析

與正常組比較, *P<0.05; 與TNP-470比較, #P<0.05。

表2 恩度對HUVECs中Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)的影響分析 %

與空白組比較, *P<0.05; 與TNP-470比較, #P<0.05。

3 討 論

重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液(恩度)屬于一種血管內(nèi)皮生長抑制劑，特點為新型、多靶點，能夠?qū)δ[瘤血管生成進(jìn)行抑制，在多種腫瘤的治療中均得到了有效應(yīng)用[1-3]。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究[6-8]表明，恩度能夠?qū)ρ苌杉澳[瘤生長、侵襲、遷移進(jìn)行抑制，途徑為在腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性地作用。近年來，在腫瘤患者的發(fā)病率及死亡率中，肺癌在日益加重的環(huán)境污染、吸煙等因素的影響下已經(jīng)位居首位[9]。通常情況下，恩度是臨床治療肺癌過程中通常采用的藥物[10]。現(xiàn)階段，很多相關(guān)醫(yī)學(xué)研究均對恩度對血管內(nèi)皮生長因子、成纖維生長因子等的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控進(jìn)行了報道，但是卻很少有相關(guān)醫(yī)學(xué)研究對恩度對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)行報道。

本研究結(jié)果顯示，恩度對HUVECs增殖抑制率、誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡率均隨著濃度的提升而提升(P<0.05), 10、20 μg/mL恩度對HUVECs增殖抑制率、誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡率均顯著低于25 μg/mL TNP-470(P<0.05), 80、100 μg/mL恩度對HUVECs增殖抑制率、誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡率均顯著高于25 μg/mL TNP-470(P<0.05), 但40 μg/mL恩度、25 μg/mL TNP-470對HUVECs增殖抑制率、誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡率之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 20、40、80、100 μg/mL恩度、25 μg/mL TNP-470誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡率均顯著高于正常組(P<0.05), 但10 μg/mL恩度、正常組誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡率之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); 免疫細(xì)胞化學(xué)、Western blotting下20、40 μg/mL恩度、25 μg/mL TNP-470對HUVECs中Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著低于空白組(P<0.05), Bax蛋白表達(dá)均顯著高于空白組(P<0.05), 10 μg/mL恩度對HUVECs中Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著高于25 μg/mL TNP-470(P<0.05), Bax蛋白表達(dá)均顯著低于25 μg/mL TNP-470(P<0.05), 但20、40 μg/mL恩度、25 μg/mL TNP-470對HUVECs中Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 10 μg/mL恩度、空白組對HUVECs中Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 說明恩度促進(jìn)與肺癌細(xì)胞A549共培養(yǎng)體系中的HUVEC凋亡的機(jī)制為對Bcl-2家族蛋白進(jìn)行調(diào)控。

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R 734.2

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1672-2353(2017)23-081-03

10.7619/jcmp.201723026

2017-06-28