宋瑩瑩，王長明，張 賡，楊 進

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023)

【實驗研究】

益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方對糖尿病足小鼠VEGF、胰腺氧化應(yīng)激、胰島形態(tài)的影響?

宋瑩瑩，王長明，張 賡，楊 進△

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023)

目的：觀察益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方對糖尿病足(diabetic foot，DF)小鼠血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及胰腺抗氧化應(yīng)激能力、胰島形態(tài)的影響。方法: SPF級C57BL/6J雄性小鼠70只，隨機抽10只為正常組，其余小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)(120mg/kg)及結(jié)扎股動脈、股靜脈建立DF模型，分為模型組、二甲雙胍+西洛他唑組(西藥對照組)、通塞脈片組(中藥對照組)、益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方高、中、低劑量組，連續(xù)用藥3周，檢測干預(yù)前后各組小鼠體質(zhì)量、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、干預(yù)后血清VEGF、胰腺組織超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)活性及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量。實驗?zāi)┱∫认?，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色觀察胰島結(jié)構(gòu)。結(jié)果： 益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方能顯著降低FBG，上調(diào)VEGF，提高胰腺SOD、GSH活性，降低MDA含量。胰島HE染色提示益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方高劑量組形態(tài)學(xué)改變優(yōu)于模型組。結(jié)論： 益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方能降低血糖，調(diào)節(jié)血清VEGF濃度，增強胰腺抗氧化應(yīng)激能力，改善胰島病理形態(tài)，從而促進血管再生，阻止或延緩胰腺功能的損害，加速足部潰瘍愈合。

益氣養(yǎng)陰通絡(luò)；糖尿病足；VEGF；氧化應(yīng)激；胰島形態(tài)學(xué)

糖尿病足(diabetic foot，DF)是糖尿病(diabetic mellitus，DM)常見的慢性致殘性并發(fā)癥之一，屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”“脫疽”“脈痹”等范疇。中醫(yī)學(xué)認為，DF由消渴日久、脾失健運、氣陰兩傷、瘀熱阻絡(luò)、筋脈失于濡養(yǎng)所致，總屬本虛標(biāo)實之證。江蘇省名中醫(yī)楊進教授提出DF治法為“補虛化瘀、清熱解毒，解痙通絡(luò)”，并運用益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方治療，用于治療血栓閉塞性脈管炎(脫疽)毒熱癥的通塞脈片也具有培補氣血、養(yǎng)陰清熱、活血化瘀之效，而DF發(fā)病機制與脈管炎有相似之處，屬于中醫(yī)學(xué)“脫疽”范疇，因此在本研究中將其設(shè)為中藥陽性對照。二甲雙胍是目前DM治療的一線藥物，是全球性惟一用以改善胰島素作用的降糖藥，目前尚缺少治療DM下肢血管病變的特效藥物，西洛他唑是選擇性環(huán)磷酸腺苷磷酸二酯酶抑制劑[1]，具有抗血小板、擴張血管、減輕下肢血管閉塞的作用，因此將此兩藥聯(lián)用設(shè)為西藥陽性對照。

本研究通過建立DF小鼠模型，觀察上述陽性對照藥物及益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方對DF小鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、氧化應(yīng)激指標(biāo)、胰島形態(tài)的影響，探討益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方促進DF潰瘍愈合的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方由生黃芪30 g、當(dāng)歸20 g、金銀花30 g、玄參20 g、水蛭6 g等組成，中藥由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院江蘇省中醫(yī)院中藥房提供；通塞脈片(每素片重0.35 g)主要成分為當(dāng)歸、牛膝、黃芪、黨參、石斛、玄參、金銀花、甘草，由康緣陽光藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字Z32020535，批號161209)；鹽酸二甲雙胍片(0.5 g)由中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字H20023370，批號AAJ9601)；西洛他唑片(50 mg)由浙江大冢制藥有限公司生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字H10960014，批號151205P)；鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)(S0130-500 mg)購自美國Sigma公司(批號WXBC1125V)；戊巴比妥鈉(5 g)購自美國Invitrogen公司(批號922L0311)；小鼠VEGF檢測試劑盒購自南京Angle Gene 公司(批號16120921087 M)，小鼠超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)測試盒(批號20160930)，小鼠還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)測試盒(批號20160933)，小鼠微量丙二醛(Malondialdehyde，MDA)測試盒(批號20160934)均購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 實驗器材 血糖試紙及快速血糖儀(ONETOUCH Ultra穩(wěn)豪型血糖儀，美國強生)；電子天平(Bt125D，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，中國)；研究用酸度儀(PB-10，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，中國)；超低溫冰箱(HFU686 Basic，Thermo Fisher Scientific，美國)；數(shù)控超聲波清洗器(KH-500DV，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，中國)；高速微量離心機(CL 17R，Thermo Fisher Scientific，美國)；酶標(biāo)儀(Infinite F50，Tecan公司，瑞士)；全自動洗板機(APW-100，Thermo公司，美國)；紫外可見分光光度計(UV-1600，上海美譜達儀器有限公司，中國)；包埋機(YD-6 L，金華益迪，中國)；石蠟切片機(RM2235，Leica公司，德國)；光學(xué)顯微鏡(Axio Imager M2型，Zeiss公司，德國)等。

1.2 動物模型制備

1.2.1 動物及飼養(yǎng)環(huán)境 SPF級C57BL/6 J雄性小鼠70只，健康狀況良好，周齡4～8周，體質(zhì)量18～21g，由南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院提供(實驗動物許可證SCXK(蘇)2015-0001)。分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)，普通飼料，自由進食飲水，自然照明。實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境室溫23～25 ℃，相對濕度40%～70%，定期觀察記錄其癥狀、體征、飲水量、尿量、進食量，每日觀察其健康狀況及死亡情況。

1.2.2 DM小鼠模型的建立[2]將所有小鼠適應(yīng)性普通飼料喂養(yǎng)1周后隨機選出10只小鼠作為正常對照組，其余為擬DM造模組。正常對照組給予普通飼料(含脂肪12%，碳水化合物60%，蛋白質(zhì)28%)喂養(yǎng)，擬DM造模組給予高脂飲食(74.5%基礎(chǔ)飼料，10 %熟豬油，10%蔗糖，5%蛋黃粉，0.5%膽固醇)喂養(yǎng)。喂養(yǎng)2周后禁食16 h，不禁水，擬DM造模組小鼠腹腔快速注射STZ(120 mg/kg)，STZ按1%比例以檸檬酸緩沖液稀釋(pH=4.45，冰上配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)；正常對照組小鼠腹腔注射等容積pH4.45的檸檬酸緩沖液。3周后采尾靜脈血，用血糖儀檢測血糖，隨機血糖≥16.7 mmol/L即為DM小鼠造模成功，不符合標(biāo)準(zhǔn)者予以淘汰。

1.2.3 DF小鼠模型的建立[3-4]DM模型成功后，各組小鼠空腹12 h測小鼠凈體質(zhì)量。用1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，待小鼠角膜反射消失后，將小鼠以仰臥位固定在鼠板上備皮消毒。以手術(shù)剪刀縱行切開左側(cè)后肢正中皮膚，以止血鉗固定牽拉皮膚，充分暴露手術(shù)視野。以止血鉗固定分離出股動脈和股靜脈，結(jié)扎股動脈、股靜脈，傷口局部涂撒青霉素后縫合皮膚。

1.3 動物分組及給藥方法

70只小鼠隨機抽取10只作為正常對照組，其余60只小鼠造模，剔除不符合DM診斷標(biāo)準(zhǔn)的小鼠。49只DM成模小鼠用于建立DF模型。按隨機數(shù)字表法分為模型對照組8只，二甲雙胍+西洛他唑組(西藥對照組)8只，通塞脈片組(中藥對照組)8只，益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方高劑量組(中藥高劑量組)9只，益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方中劑量組(中藥中劑量組)8只，益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方低劑量組(中藥低劑量組)6組各8只。

按小鼠與人等效劑量換算，二甲雙胍量為0.417 g/(kg·d)(成人日用藥量10倍，體質(zhì)量按60 kg計)，西洛他唑量為0.033 g/(kg·d)(成人日用藥量的10倍，體質(zhì)量按60 kg計)，通塞脈片量為1.05 g/(kg·d)(成人日用藥量的10倍，體質(zhì)量按60 kg計)，益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方高、中、低劑量分別是35.2 g/(kg·d)、17.6 g/(kg·d)、8.8 g/(kg·d)(分別是成人日用藥量的20、10、5倍，成人體質(zhì)量按60 kg計)灌胃。正常對照組及模型對照組給予等容積生理鹽水灌胃，每日1次(9∶00左右)，連續(xù)用藥3周。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 各組小鼠一般情況觀察 實驗期間每天觀察各組小鼠的精神狀況、行為活動、皮毛色澤、健康狀況及死亡情況，并記錄其癥狀和體征。

1.4.2 各組小鼠體質(zhì)量及FBG變化 給藥前后稱量各組小鼠體質(zhì)量，同時取尾靜脈血，用血糖試紙測其FBG。

1.4.3 各組小鼠VEGF檢測 停藥后次日腹腔注射1%戊巴比妥鈉，分別將動物麻醉，眼眶靜脈叢采血約0.8 ml，離心3000 r/min、15 min，分離血清，-70 ℃保存?zhèn)溆?。?yīng)用雙抗體夾心法測定血清VEGF濃度，按試劑盒說明書步驟操作。在酶標(biāo)包被板上的標(biāo)準(zhǔn)品孔中依次加標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，對倍稀釋，稀釋后各孔加樣量均為50 μL。待測樣品孔中依次加40 μL樣品稀釋液、10 μL待測樣品，覆膜37 ℃溫育30 min。用預(yù)先稀釋好的洗液洗板，反復(fù)清洗5次并拍干。每孔加入50 μL酶標(biāo)試劑，空白對照孔除外，重復(fù)溫育、洗滌操作。每孔依次加入50 μL顯色劑A液、B液，37 ℃避光顯色15 min后，加50 μL終止液終止反應(yīng)。立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長下依序測量各孔的吸光度(OD值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算VEGF水平。

1.4.4 各組小鼠胰腺氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 取血后分別固定小鼠四肢，打開腹腔迅速分離胰腺組織。取少量的胰腺組織用冰磷酸緩沖鹽溶液洗凈殘留血液后制作成10%組織勻漿，低溫低速離心取上清液。采用黃嘌呤氧化酶法測定胰腺組織SOD活性，比色法測定GSH活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，均嚴(yán)格按試劑盒說明書步驟操作。其余胰腺組織置10%中性甲醛(pH7.4)固定液中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 各組小鼠胰島形態(tài)學(xué)觀察 每組選取3只小鼠，從10%中性甲醛(pH7.4)固定液中取出胰腺組織，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色，在光鏡下觀察胰島形態(tài)變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀況比較

正常對照組小鼠精神飽滿，活動自如，毛發(fā)光澤，飲食量、尿量正常，體質(zhì)量呈上升趨勢；小鼠DM模型成功建立后第1周出現(xiàn)明顯的精神倦怠、行動遲緩、毛發(fā)雜亂、進食量減少、飲水量有所增加，體質(zhì)量未出現(xiàn)明顯下降；建立后第2周出現(xiàn)多飲多食多尿現(xiàn)象，體質(zhì)量逐漸下降，毛發(fā)枯黃無光；建立后第3周出現(xiàn)食欲減退。

圖1顯示，小鼠DF模型建立后出現(xiàn)弓背、跛行、趾蜷、觸覺過敏、下肢潰瘍、創(chuàng)面紅腫、患肢肌肉萎縮等現(xiàn)象。與模型對照組比較，各治療組小鼠的精神狀態(tài)、一般狀況及下肢潰瘍均有不同程度的改善。以中藥高劑量組小鼠的潰瘍?nèi)庋塾^察為例。

圖1 中藥高劑量組小鼠潰瘍變化情況注：標(biāo)尺刻度為0.5 mm(→所指為潰瘍創(chuàng)面)A.用藥前潰瘍有血性分泌物，周圍皮膚腫脹；B.用藥1周后潰瘍面積縮小，分泌物減少，周圍皮膚無水腫；C.用藥2周后潰瘍面積明顯縮小，無明顯分泌物；D.用藥3周后上皮逐漸覆蓋，創(chuàng)面逐漸愈合

2.2 各組小鼠體質(zhì)量、FBG比較

表1顯示，治療前各組小鼠的初始體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。除正常對照組和模型對照組外，其余各組小鼠體質(zhì)量經(jīng)治療后均較治療前減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.001)。中藥高劑量組小鼠治療后的體質(zhì)量接近正常組小鼠，較模型對照組增加(P<0.05)。

西藥對照組、中藥對照組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組的FBG較治療前均明顯降低(P<0.01或P<0.001)，且低、中、高劑量組之間的血糖有依次下降趨勢。治療后，上述各組的FBG亦明顯低于模型對照組(P<0.001)，但西藥對照組、中藥對照組、中藥高劑量組的FBG含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方有降低FBG的作用，并在一定劑量范圍內(nèi)，隨劑量的增加降糖作用亦有增強趨勢。

2.3 各組小鼠VEGF、抗氧化指標(biāo)比較

表2顯示，與正常對照組比較，模型對照組、中藥對照組VEGF降低有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與模型對照組比較，中藥高劑量組VEGF含量明顯增加(P<0.05)，中劑量組、低劑量組含量雖高于模型對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，低、中、高劑量組VEGF含量依次上升。西藥對照組、中藥對照組、中藥高劑量組治療后VEGF含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組小鼠治療前后體質(zhì)量、FBG比較

注：與本組治療后比較：**P<0.01，***P<0.001；與模型對照組治療后比較:△P<0.05，△△△P<0.001

與正常對照組比較，模型對照組、中藥低劑量組的SOD含量明顯降低、MDA含量明顯上升(P<0.01，P<0.001)，各組的GSH含量均明顯下降(P<0.05，P<0.01或P<0.001)，反映胰腺組織自由基清除能力下降。治療后，西藥對照組、中藥對照組、中藥高劑量組、中藥中劑量組的小鼠胰腺SOD、GSH含量明顯高于模型對照組(P<0.05，P<0.01或P<0.001)，MDA含量明顯低于模型對照組(P<0.01)。與中藥低劑量組比較，西藥對照組、中藥對照組、中藥高劑量組、中藥中劑量組SOD含量升高，MDA含量降低(P<0.05，P<0.01或P<0.001)，中藥高劑量組、中藥中劑量組GSH含量升高(P<0.05，P<0.01)。與中藥高劑量組比較，西藥對照組、中藥對照組SOD、GSH、MDA含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。可見，西藥對照組、中藥對照組、中藥高劑量組小鼠治療后的胰腺抗氧化應(yīng)激能力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但西藥對照組、中藥對照組、中藥高劑量組、中藥中劑量組提高小鼠胰腺抗氧化應(yīng)激能力優(yōu)于中藥低劑量組。

表2 各組小鼠血清VEGF、抗氧化指標(biāo)比較

注：與正常對照組比較:#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與模型對照組比較:△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；與中藥低劑量組比較:●P<0.05，●●P<0.01，●●●P<0.001

2.4 各組小鼠胰島組織形態(tài)學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠胰島HE染色可見，正常對照組小鼠胰島豐富，數(shù)量較多，于胰腺腺泡間散在分布；模型對照組胰島數(shù)量明顯減少，分布稀疏。

胰島形態(tài)：正常對照組小鼠胰島形態(tài)完整呈圓形或橢圓形，與周圍組織界限清晰；模型對照組胰島形態(tài)不規(guī)則并有萎縮現(xiàn)象，呈條索狀，邊緣不齊，界限不清。

胰島細胞形態(tài)：胰島內(nèi)胰島細胞間有豐富的毛細血管，細胞排列整齊且均衡分布，胞漿豐富，胞核居中并呈圓形；模型對照組細胞排列紊亂，部分胰島細胞呈空泡狀變性甚至出現(xiàn)核溶解、核固縮改變。

圖2顯示，各給藥組胰島形態(tài)學(xué)均較模型組有明顯改善，胰島數(shù)目增加，形態(tài)較正常，邊界較清晰，胰島細胞空泡狀變性及細胞破裂也較少。

圖2 各組小鼠胰島細胞HE染色(×20)注：scale bar: width in inches: 0.3 μm(→所指為胰島) A.正常對照組：胰島結(jié)構(gòu)完整，胞漿豐富，細胞核呈圓形藍色著染；B.模型對照組：胰島萎縮，細胞排列雜亂，部分細胞呈空泡狀變性；C.西藥對照組：胰島形態(tài)較規(guī)則，邊界較清，體積縮小，細胞呈空泡狀變性較少；D.中藥對照組：胰島形態(tài)較規(guī)則，邊界欠清，部分細胞呈空泡狀變性；E.中藥高劑量組：胰島結(jié)構(gòu)較完整，細胞排列較齊；F.中藥中劑量組：胰島萎縮，形態(tài)不規(guī)則，邊界尚清，部分細胞呈空泡狀變性；G.中藥低劑量組：胰島萎縮，形態(tài)不規(guī)則，邊界欠清，部分細胞呈空泡狀變性

3 討論

VEGF是目前公認最強的促血管生成因子，促進內(nèi)皮細胞分裂、增殖和轉(zhuǎn)移，刺激新生血管形成[5]；提高血管的滲透性，促進血漿大分子物質(zhì)外滲至血管外的基質(zhì)中，為新生血管的生長提供營養(yǎng)。DF患者潰瘍創(chuàng)面VEGF不僅呈低水平表達，其表達高峰持續(xù)時間也在縮短，是創(chuàng)面難愈的重要原因之一[6]，其含量在一定程度上能客觀反映創(chuàng)面修復(fù)的能力。DF患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)可通過影響胰島β細胞基因的表達、促進β細胞凋亡、脂毒性等多種途徑對β細胞造成極強的殺傷力[7]。SOD是生物體內(nèi)清除超氧陰離子自由基的重要抗氧化酶。GSH對過氧化氫的還原反應(yīng)起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用，與SOD均是衡量機體抗氧化能力的重要因素。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要分解產(chǎn)物，反映機體所面臨的氧化應(yīng)激壓力大小。因此，SOD、GSH、MDA含量的變化能間接反映胰腺損傷的程度。益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方高劑量組與西藥對照組、中藥對照組在降低FBG、調(diào)節(jié)VEGF、改善胰腺抗氧化應(yīng)激能力方面效果相當(dāng)，低劑量組療效差于西藥對照組、中藥對照組，高、中、低劑量組的療效隨劑量的增加而提高。

本病以氣陰兩虛為本，瘀血阻絡(luò)、濕熱壅盛為標(biāo)，絡(luò)虛與絡(luò)瘀并存，因此以“絡(luò)以通為用”為治療原則，以益氣養(yǎng)陰扶其正，清熱解毒攻其邪，化瘀解痙通其絡(luò)為治療大法。益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方由當(dāng)歸補血湯、四妙勇安湯加減化裁而成，重用“瘡家圣藥”之生黃芪，意在氣旺則血行，瘀去絡(luò)通而起廢痿，既補脾運之不足又托毒生肌、鼓邪外出用為君藥。純補氣則瘀不去，當(dāng)歸養(yǎng)血活血，化瘀通脈。金銀花甘寒氣清，尤善清熱解毒；玄參甘咸寒，長于清熱涼血、瀉火解毒，并能滋養(yǎng)陰液、軟堅散結(jié)，與金銀花相伍既能清氣分之熱，又能解血分之毒，合當(dāng)歸養(yǎng)血滋陰而生新；水蛭破血逐瘀、通經(jīng)攻堅為使藥。《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》曰：“凡破血之藥，多傷氣分，惟水蛭味咸專入血分，于氣分絲毫無損”[8]，“破瘀血而不傷新血”。水蛭不失為可逐惡血又不傷氣分的最佳選擇。研究也發(fā)現(xiàn)，水蛭含有水蛭素、肝素、抗血栓素，其中水蛭素是已知最強的凝血酶抑制劑，有明顯的抗凝抗栓、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集、抗炎等多種功能[9]，抑制血栓形成，穩(wěn)定血管內(nèi)皮細胞，改善雙下肢血液循環(huán)。縱觀全方，補氣滋陰而不壅滯，活血通絡(luò)而不傷正。高劑量組小鼠的整體狀態(tài)(精神、活動、毛發(fā)、飲食等)改善也明顯優(yōu)于西醫(yī)對照組、中藥對照組。究其原因，可能是二甲雙胍、西洛他唑具有胃腸道反應(yīng)和全身反應(yīng)，如厭食、惡心、倦怠、乏力等；益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方的組方原則較通塞脈片的組方原則增加了“解痙通絡(luò)”的治法，配以蟲類藥物，專入絡(luò)脈，搜剔疏拔，對DF的治療更具有針對性。

胰島細胞HE染色提示，模型組胰島體積明顯萎縮，為適應(yīng)胰島素抵抗，胰腺需過度分泌大量的胰島素，逐漸進入胰島β細胞結(jié)構(gòu)破壞期，造成胰島β細胞功能下降、數(shù)量減少，導(dǎo)致β細胞空泡狀變性、進行性凋亡等。高劑量組胰島β細胞數(shù)量減少明顯改善，胰島內(nèi)亦罕見空泡狀變性。監(jiān)測FBG也發(fā)現(xiàn)，高劑量組降低血糖的力度在高、中、低劑量組中最大。據(jù)此推測，高劑量組的降糖作用更可能是通過促進胰島β細胞的再生、保持β細胞數(shù)量與功能、減少胰島萎縮以及促進胰島素分泌等多途徑調(diào)節(jié)血糖、增加胰島素敏感、減少對胰島素的需求。二甲雙胍降低FBG的機制包括抑制肝糖原異生，增加外周組織對葡萄糖的攝取，增加胰島素受體數(shù)量及其與胰島素結(jié)合的親和力，促進游離脂肪酸的再脂化并抑制脂解，改善胰島素抵抗[10]?？梢?，益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方與二甲雙胍均可通過保護胰島β細胞，增加胰島素敏感，降低胰島素抵抗，達到降糖目的。但后者不能促進胰島素的分泌，兩者作用機制的具體差異尚待進一步的深入研究。

綜上所述，高劑量的益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方能有效抑制DF小鼠體質(zhì)量過度下降，降低FBG，提升SOD、GSH的活性，降低MDA含量，改善小鼠胰腺的抗氧化應(yīng)激能力；升高血清VEGF，激活細胞增殖和肉芽組織的生長，促進血管生成，加強局部營養(yǎng)狀況和抗感染能力；減少胰島萎縮，保持β細胞數(shù)量與功能，促進胰島結(jié)構(gòu)及胰島β細胞自身修復(fù)，進而調(diào)節(jié)血糖，進入良性循環(huán)。這些可能是益氣養(yǎng)陰通絡(luò)方治療DF的部分作用機理與靶點，為其臨床應(yīng)用提供了一定的實驗依據(jù)。

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EffectofYiqiYangyinTongluoFormulaonVEGF，PancreaticOxidativeStressandIsletMorphologyofDiabeticFootMice

SONG Ying-ying, WANG Chang-ming, ZHANG Geng, YANG Jin△

(NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Objective: To observe the effect of Yiqi Yangyin Tongluo Formula on vascular endothelial growth factor(VEGF), pancreatic antioxidative ability and islet morphology of diabetic foot(DF)mice. Methods: 10 mice were randomly selected from 70 SPF male C57BL/6J mice. Other mice, given 120mg/kg streptozotocin (STZ) injection and femoral artery and vein ligature to establish DF models, were divided into model group, Metformin+Clostazol group, Tongsaimai group, and high, middle and low dose of Yiqi Yangyin Tongluo Formula groups. During gavage for 3 weeks, body weight and fasting blood glucose (FBG) of all the mice were observed dynamically, and VEGF, superoxide dismutase(SOD), glutathione(GSH) and malondialdehyde(MDA) were determined after gavage. At the end of the experiment, pancreases were removed and Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the structure of islets. Results: Yiqi Yangyin Tongluo Formula can lower FBG, raise VEGF level, SOD and GSH activity, and decrease MDA level. HE staining showed that the morphological changes of the high dose of Yiqi Yangyin Tongluo Formula group were better than those of model group. Conclusion: Yiqi Yangyin Tongluo Formula can lower glucose, regulate VEGF level, enhance pancreatic antioxidative ability and improve islet morphology to promote revascularization, prevent or delay pancreatic function lesion and thus accelerate foot ulcer healing.

Replenishing Qi, nourishing Yin and dredging collaterals; Diabetic foot; VEGF; Oxidative stress; Islet morphology

國家自然科學(xué)基金資助項目(81600966)-PIRT調(diào)節(jié)TRIPV1介導(dǎo)的骨癌痛機理研究；江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(BK20161042)-PIRT調(diào)節(jié)骨癌痛的外周神經(jīng)機理研究；江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(PAPD)-名醫(yī)名師楊進教授學(xué)術(shù)思想的傳承研究

宋瑩瑩(1984-)，女，江蘇宿遷人，助理研究員，醫(yī)學(xué)博士，從事溫病治則治法的機理研究。

△通訊作者：楊 進，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事溫病治則治法的機理研究，Tel：18913953750，E-mail：13951743559@163.com。

R285.5

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1006-3250(2017)11-1564-05

2017-05-10