王娜泠，胡則輝，卞光明，柴學(xué)軍

（1.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；2.江蘇省射陽縣長蕩鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，江蘇鹽城 224322）

5種蟹類線粒體Cyt b基因序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育

王娜泠1，胡則輝1，卞光明2，柴學(xué)軍1

（1.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；2.江蘇省射陽縣長蕩鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，江蘇鹽城 224322）

為研究浙江沿海蟹類系統(tǒng)發(fā)育情況，對5種常見蟹類（n=28）的線粒體細(xì)胞色素b基因進(jìn)行擴(kuò)增，獲得650 bp序列片段，其中8個紅星梭子蟹樣品中檢測出4個單倍型，銳齒蟳、銹斑蟳和日本蟳樣品中分別檢測出2個單倍型，綿蟹中檢測出1個單倍型；堿基T、C、A、G和A+T的平均含量分別為37.3%、19.8%、26.5%、15.8%和63.8%，A+T平均含量（63.8%）明顯高于G+C（36.2%），符合后生動物線粒體基因堿基偏倚特性；5種蟹類種內(nèi)遺傳距離處于0.000～0.050，種間遺傳距離為0.194～0.366，銳齒蟳與綿蟹種間遺傳距離最高（0.366），銹斑蟳與日本蟳遺傳距離最低（0.194）。通過鄰接法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹發(fā)現(xiàn)蟳屬物種首先聚類，然后與同屬于梭子蟹科的梭子蟹屬物種聚類，最后與綿蟹科綿蟹物種聚類，與相應(yīng)蟹類形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致。

蟹類；線粒體DNA；細(xì)胞色素b；系統(tǒng)發(fā)育

浙江沿海的蟹類資源豐富，物種多樣性水平高，隨著因過度捕撈引起的浙江海域傳統(tǒng)底層魚類資源的衰退，捕食蟹類的底層魚類減少，浙江沿海蟹類生存空間擴(kuò)大，資源發(fā)生量增多[1]，故而對浙江近海蟹類分子系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和分類學(xué)進(jìn)行相關(guān)研究，對于其資源的合理利用具有重要意義。細(xì)胞色素b（Cytochrome b，Cyt b）基因是目前研究系統(tǒng)進(jìn)化的重要目的基因，其進(jìn)化速率適中、序列保守、遺傳信息豐富，既能反映物種親緣關(guān)系，也能為系統(tǒng)發(fā)育重建提供重要參數(shù)[2]，其結(jié)構(gòu)和功能研究最為清楚，是線粒體DNA蛋白質(zhì)編碼基因中最為可信的分子標(biāo)記之一，適用于種間、屬間系統(tǒng)發(fā)育分析[3]。紅星梭子蟹Portunus sanguinolentus、日本蟳Charybdis japonica、銹斑蟳C.feriatus、銳齒蟳C.acuta等都是浙江近海海域經(jīng)濟(jì)蟹類，綿蟹Dromia dehaani為常見種，蟹類肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富深受人們喜愛。隨著人們對大型經(jīng)濟(jì)蟹類的需求量日益增加，蟹類資源的開發(fā)和合理利用顯得尤為重要。

目前，蟹類Cyt b基因研究主要集中于三疣梭子蟹Portunus trituberculatus[4]、中華絨螯蟹群體遺傳特性[5]、亞種比較[6]、RFLP分析[7]、胚胎標(biāo)記[8]等單個蟹種序列分析及系統(tǒng)發(fā)育研究，而多種蟹類Cyt b基因系統(tǒng)發(fā)育研究未見報道。本研究對5種蟹類的線粒體Cyt b基因進(jìn)行擴(kuò)增、序列分析及構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，以期獲得浙江沿岸蟹類分子系統(tǒng)學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為浙江沿海蟹類資源的開發(fā)與保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用樣品取自浙江近海，運回實驗室后置于95%的酒精中固定，超低溫（-70℃）保存?zhèn)溆?，具體采集信息見表1。

表1 采樣情況表Tab.1 Information of sampling used in this study

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測

取約30 mg的蟹類螯足肌肉，剪碎組織并根據(jù)天根海洋動物基因組提取試劑盒（TIANamp Marine Animals DNA Kit）操作說明提取樣品總基因組DNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，用紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量與濃度，并稀釋為50 ng/μL，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增和測序

從GenBank中下載日本蟳、銹斑蟳、紅星梭子蟹的線粒體Cyt b基因序列，比對后通過Oligo7軟件[9]設(shè)計 PCR 擴(kuò)增引物：Cyt b-F：5’-CATTTTCTAGAGTAGCGCATATTTGCCGAGA-3’；Cyt b-R：5’-GCAACTGATGCTACTAGTGCAATAACACC-3’（上海生工合成）。PCR 總反應(yīng)體系（25 μL）：12.5 μL2×Taq MasterMix（康維世紀(jì)）、1 μL上下游引物（10 μmol/L）、100 ng模板DNA，ddH2O 補足至25 μL。PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性2 min；94℃變性45 s、55℃退火1 min、72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 序列分析

通過ContigExpress軟件進(jìn)行拼接，然后使用BioEdit軟件[10]對所有序列編輯并輔以人工校正。用MEGA 5.0軟件[11]分析序列的堿基組成，并使用Kimura雙參模型（K2P）計算各蟹類間的遺傳距離。利用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建分子發(fā)育進(jìn)化樹，并采用序列數(shù)據(jù)集1 000次重復(fù)抽樣檢驗的自引導(dǎo)值（Bootstrap Value）表示系統(tǒng)樹各節(jié)點置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜如圖1所示，Marker為2 000 bp，從上至下依次為（2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp），產(chǎn)物片段長度處于500～750 bp，與設(shè)計的目的片段長度一致，條帶清晰明亮、無雜帶，滿足測序要求。

圖1 5種蟹類部分PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis patterns of PCR products in five species of crabs

2.2 序列分析

本試驗共測定了5種蟹類的Cyt b基因，采用ContigExpress軟件對正反向序列進(jìn)行拼接，并通過BioEdit編輯，去除兩端不穩(wěn)定部分，經(jīng)Genbank中BLAST同源性比對，確認(rèn)得到650 bp的Cyt b基因片段。8個紅星梭子蟹樣品中檢測出 4 個單倍型（PS1～4），銳齒蟳、銹斑蟳和日本蟳樣品中分別檢測出 2 個單倍型（CA1～2，CF1～2，CJ1～2），綿蟹檢測出1個單倍型（DD1）。

通過MEGA 5.0軟件計算5種蟹類Cyt b序列的堿基組成（表2），T、C、A、G的平均含量分別為37.3%、19.8%、26.5%和15.8%，A+T的平均含量為63.8%。5種蟹類Cyt b基因A+T含量處于61.1%～66.4%，平均含量63.8%明顯高于G+C（36.2%），符合后生動物線粒體基因AT偏倚性[12]。

表2 5種蟹類線粒體Cyt b基因堿基組成Tab.2 Nucleotide composition of mitochondrial Cyt b genes of five species of crabs

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

對所獲得的5種蟹類Cyt b基因片段進(jìn)行遺傳距離分析，由表3可知，5種蟹類種內(nèi)變異較小，遺傳距離范圍為0.000～0.050，種間遺傳距離處于0.194～0.366，其中銳齒蟳與綿蟹種間遺傳距離最高（0.366），銹斑蟳與日本蟳遺傳距離最低（0.194）。

表3 5種蟹類種內(nèi)和種間遺傳距離Tab.3 Within and between group meanaverage distance of five species of crabs

利用鄰接法構(gòu)建五種蟹類分子進(jìn)化樹（圖2），自檢次數(shù)為1 000次重復(fù)抽樣檢驗各分支置信度，如系統(tǒng)進(jìn)化樹所示，梭子蟹科螃蟹首先聚類，再與綿蟹屬螃蟹聚類，不存在不同物種交叉聚類，銳齒蟳、日本蟳首先聚為一支，然后與銹斑蟳聚為一支，再與紅星梭子蟹聚為一支，綿蟹獨立為一支。

圖2 基于Cyt b基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 NJ phylogenetic tree based on Cyt b gene sequences

3 討論

本研究所獲得的蟹類Cyt b序列與Genbank中相應(yīng)物種Cyt b基因片段BLAST比較，同源性處于93%～99%，排除所得Cyt b基因片段是假基因片段的可能性。Cyt b基因片段中，A+T含量（63.8%）明顯高于G+C含量（36.2%），且G堿基含量最低，平均僅為15.8%，這種類型的堿基含量與青蟹Scylla serrata[13-14]、日本絨螯蟹Eriachier japonica[15]、中華虎頭蟹Orithyia sinica[16]、相手蟹Sesarma sp.[17]、方蟹科[18]等蟹類線粒體基因片段結(jié)構(gòu)相似。

基于蟹類16S rRNA基因序列研究表明，蟹類種內(nèi)遺傳距離一般小于0.010[19-20]，最大不超過0.015[21]，而本研究中蟹類種內(nèi)遺傳距離處于0.000～0.050，這多是海洋動物線粒體DNA不同區(qū)域核苷酸的突變速率或不同基因片段的選擇壓力不同[22]，Cyt b基因進(jìn)化速率快于16S rRNA基因。此外，細(xì)胞色素b基因在5種蟹類種內(nèi)也有很高的多樣性，8個紅星梭子蟹樣品中檢測出4個單倍型，銳齒蟳、銹斑蟳和日本蟳樣品中分別檢測出2個單倍型，4種蟹類都有兩個或兩個以上單倍型，表明細(xì)胞色素b基因也可用于群體遺傳多樣性的分析研究。HEBERT,et al[23]基于COI基因序列的研究表明，大部分物種種間遺傳距離不小于0.02，物種遺傳分化標(biāo)準(zhǔn)序列閾值為10倍，本實驗研究5種蟹類種間遺傳距離為0.194～0.366，種間平均遺傳距離為0.263，是種內(nèi)平均遺傳距離的19倍，故而，Cyt b標(biāo)記是區(qū)分5種蟹類種間差異的有效分子標(biāo)記。Cyt b序列NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示：各分支置信度較高，同一物種首先聚類，不存在不同物種交叉聚類現(xiàn)象，表明Cyt b序列對本研究中的5種蟹類區(qū)分度較高。此外，同屬于蟳屬的銳齒蟳、銹斑蟳、日本蟳首先聚類，然后與同屬于梭子蟹科的梭子蟹屬的紅星梭子蟹聚為一支，最后梭子蟹科的蟹類與綿蟹科的綿蟹聚類，與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致。

本研究根據(jù)Genbank中的日本蟳、銹斑蟳、紅星梭子蟹線粒體Cyt b基因片段設(shè)計引物，對五種蟹類Cyt b基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，成功確認(rèn)得到650 bp的基因片段，表明本研究設(shè)計的引物能夠適用于多種蟹類Cyt b基因擴(kuò)增分析。此外，Genbank中未發(fā)現(xiàn)銳齒蟳線粒體Cyt b基因序列、其他蟹類Cyt b基因序列較少，研究結(jié)果為相關(guān)蟹類的分子系統(tǒng)學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Molecular Phylogeny and Sequence Analysis of Mitochondrial Cyt b Gene in Five Species of Crabs

WANG Na-ling1,HU Ze-hui1,BIAN Guang-ming2,et al
(1.Marine and Fishery Institute of Zhejiang Ocean University,Marine Fisheries Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316021;2.Changdang Township Agricultural Technology Extension and Service Center of Sheyang Country,Yancheng 224322,China)

In order to study the phylogenetic development of crabs in Zhejiang coastal areas,mitochondrial cytochrome b genes were amplified in five species of crabs(n=28),finally 650 bp sequence fragments were obtained.Four haplotypes were detected from eight Portunus sanguinolentus samples,and two haplotypes were respectivelydetected from Chrybdis acuta,C.feriatus and C.japonica,and one haplotype was detected from Dromia dehaani.The composition of T,C,A,G and A+T were 37.3%、19.8%、26.5%、15.8%and 63.8%,and the composition of A+T(63.8%)was significantly higher than that of G+C(36.2%),which consistent with the characteristics of mitochondrial base bias in metazoan animals.The genetic distance between the species was 0.000～0.050,the interspecific genetic distance was 0.194-0.366,the genetic distance between C.acuta and D.dehaanis was the highest(0.366),C.feriatus and C.japonica had the lowest genetic distance(0.194).The Neighbor-Joining(NJ)phylogenetic trees using adjacent method showed that the species of Charybdis spp.were clustered first,and then clustered with Portunus spp.belonging to Portunidae,and finally clustered with Dromiidae species,which consistent with the corresponding crab morphological classification results.

crabs;mitochondrial DNA;cytochrome b;phylogeny

Q959.233

A

2096-4730(2017)04-0315-05

2017-04-20

舟山市公益類科技項目（2015C31013）

王娜泠（1992-），女，重慶市人，碩士研究生，研究方向：種質(zhì)與種苗工程.E-mail：naling_wang@163.com

柴學(xué)軍（1972-），男，教授級高工，研究方向：魚類繁育與海洋生物技術(shù).E-mail：chaixj6530@sohu.com