劉招娣，劉祥義，張水滔,林早琴，李云仙，徐娟

（西南林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南昆明 650224）

青刺果總黃酮超聲波輔助提取及其抗氧化活性

劉招娣，劉祥義，張水滔,林早琴，李云仙，徐娟*

（西南林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南昆明 650224）

以青刺果油粕為原料，利用超聲波輔助提取總黃酮，通過(guò)單因素試驗(yàn)探究各因素對(duì)青刺果總黃酮得率的影響及正交試驗(yàn)確定最佳工藝參數(shù)。并以VC和BHT為對(duì)照，對(duì)其還原性及羥自由基·OH和超氧陰離子自由基O2-·的清除能力進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明：最佳提取工藝條件為乙醇濃度60%，提取溫度60℃，提取時(shí)間35min，料液比1∶30（g/mL），此條件下總黃酮的得率為5.28%。按其工藝條件制備青刺果黃酮具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，其抗氧化能力低于VC，與BHT相當(dāng)。

青刺果；總黃酮；超聲輔助提??；抗氧化活性

青刺果（Prinsepia utilis Royle），薔薇科（Rosaceae）扁核木屬（Prinsepia）植物總花扁核的果實(shí)，別名青刺尖、打油果[1-2]。其根、葉、果、均可入藥或食用，具有清熱、解毒、活血、消炎、止痛、消食、健胃等作用[3-4]。果仁可供榨油食用，榨油后的殘?jiān)从推桑梢宰鳛樯系蕊暳?，也是傳統(tǒng)食用或藥用部位，其中亦含有較多活性物質(zhì)，其主要有效成分為黃酮和多糖類[5-6]。黃酮類成分具有優(yōu)良的抗過(guò)敏、降血脂、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、止咳、平喘、消炎、祛痰、護(hù)肝、抗腫瘤等方面的作用[7-9]。其常用的提取方法有：超臨界流體萃取、水蒸氣蒸餾、溶劑浸提和超聲波提取等[10-11]。超聲波提取法具有時(shí)間短，減少溶劑消耗、降低生產(chǎn)能源及減少?gòu)U物的排放等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[12]。目前，采用超聲波提取青刺果總黃酮及其體外抗氧化活性的文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。本研究以青刺果油粕為原料，采用超聲波輔助提取總黃酮，再研究其抗氧化活性，為青刺果黃酮的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青刺果采于云南麗江，經(jīng)機(jī)械壓榨，提取青刺果油后所得油粕。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）、VC、磷酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、水楊酸、鹽酸均為分析純：南京化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、石油醚、無(wú)水乙醇為分析純：汕滇藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器

KH-500TDB型高頻數(shù)控超聲波清洗儀：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；A L104型電子天平：梅特勒一托利多化學(xué)儀器有限公司；722N型分光光度計(jì)：天津冠澤科技有限司；JJ-2組織搗碎機(jī)、真空干燥箱：上海恒科公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法測(cè)定黃酮含量。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示。線性回歸方程為y=11.514x+0.002 1；R2=0.999 6 質(zhì)量濃度在 0.01mg/mL～0.06mg/mL范圍內(nèi)線性良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of flavonoids

1.3.2 青刺果總黃酮的超聲提取及測(cè)定

將青刺果油粕干燥粉碎后過(guò)60目篩。稱取一定量樣品，加入過(guò)量的石油醚反復(fù)萃取至色素消失，60℃下烘干，備用。然后精確稱取該油粕1.000 0 g置于提取瓶中，加入一定量乙醇溶液，在設(shè)定溫度下超聲輔助提取一段時(shí)間后過(guò)濾，其濾液即提取液。將濾渣再超聲提取一次，合并濾液，濃縮后定容，測(cè)定吸光度，通過(guò)回歸方程求出濃度，計(jì)算出提取液中總黃酮的質(zhì)量。按下列公式計(jì)算總黃酮的得率：

總黃酮得率/%=提取液中黃酮質(zhì)量/青刺果油粕質(zhì)量×100

1.3.3 單因素試驗(yàn)

分別考察超聲時(shí)間，提取溫度，料液比，乙醇濃度對(duì)青刺果總黃酮得率的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

超聲輔助提取正交因素水平表見表1。

表1 超聲輔助提取正交因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal experiment design

1.3.5 青刺果黃酮體外抗氧化性測(cè)定

還原力的測(cè)定采用鐵氰化鉀還原法[13]，羥自由基（·OH）的清除采用水楊酸比色法[14]。超氧自由基（O2-·）的清除采用鄰苯三酚自氧化法[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)青刺果總黃酮得率的影響

在超聲提取溫度 40℃，料液比 1∶20（g/mL），乙醇濃度70%的條件下，選取時(shí)間范圍為10min～35min，考察超聲時(shí)間對(duì)青刺果總黃酮得率的影響。結(jié)果如圖2所示。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the total flavonoids yield

由圖2可知，超聲時(shí)間在10min～30min時(shí)，青刺果總黃酮得率隨時(shí)間的增加得率逐漸增大。因?yàn)樘崛r(shí)間短，乙醇浸提不充分，得到的總黃酮少，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有利于黃酮的提取，但是30min之后得率下降，有可能是因?yàn)槌晻r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，黃酮類物質(zhì)的穩(wěn)定性變差，導(dǎo)致得率降低，且能耗增加[16]。

2.1.2 料液比對(duì)青刺果總黃酮得率的影響

在超聲提取溫度40℃，時(shí)間30min，乙醇濃度70%的條件下。選取料液比范圍為1∶10（g/mL）～1∶35（g/mL），探討其對(duì)總黃酮得率的影響。結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of solid－liquid ratio on the total flavonoids yield

由圖3可知，隨著溶劑體積的增大，黃酮得率提高。當(dāng)料液比為1∶25（g/mL）時(shí)，青刺果總黃酮得率達(dá)到最大，因?yàn)楫?dāng)溶劑用量達(dá)到一定程度后，黃酮類物質(zhì)幾乎全部溶出，再增加溶劑用量會(huì)增加成本和后續(xù)濃縮的難度。

2.1.3 超聲溫度對(duì)青刺果總黃酮得率的影響

在料液比為 1 ∶25（g/mL），超聲時(shí)間 30min，乙醇濃度70%的條件下，選取溫度范圍為40℃～65℃，考察提取溫度對(duì)總黃酮提取效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 超聲溫度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the total flavonoids yield

由圖4可知，在40℃～60℃范圍內(nèi)，隨溫度升高，青刺果總黃酮明顯得率增大，這是因?yàn)辄S酮類物質(zhì)的溶解度會(huì)隨溫度升高而提高。當(dāng)溫度超過(guò)60℃時(shí)，由于黃酮類物質(zhì)耐熱性較差，過(guò)高的溫度對(duì)其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞[17]，而導(dǎo)致得率降低。

2.1.4 乙醇濃度對(duì)青刺果總黃酮得率的影響

在料液比 1 ∶25（g/mL），超聲時(shí)間 30min，提取溫度60℃，探討乙醇濃度（體積分?jǐn)?shù)30%～80%）對(duì)總黃酮得率的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，總黃酮得率隨著乙醇濃度（體積分?jǐn)?shù)）的增加先增大后減小，在乙醇濃度為60%時(shí)總黃酮得率達(dá)到最大。這可能是由于體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇極性與青刺果中黃酮類化合物的極性較為相近，隨著乙醇濃度的增加，會(huì)使更多的脂溶性雜質(zhì)被提取出來(lái)導(dǎo)致總黃酮得率有所下降。

圖5 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the total flavonoids yield

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，每個(gè)因素下選取3個(gè)水平，采用L9（33）正交表來(lái)研究不同試驗(yàn)條件下總黃酮的得率，確定提取青刺果總黃酮的最佳工藝條件。結(jié)果見表2所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2可以看出，各因素對(duì)黃酮類物質(zhì)提取的影響由大到小分別為乙醇濃度＞超聲時(shí)間＞料液比＞提取溫度。根據(jù)正交試驗(yàn)初步確定青刺果總黃酮超聲提取的最佳工藝條件為A3B2C3D2，即料液比1∶30（g/mL），提取溫度60℃，超聲時(shí)間35min，乙醇濃度60%。在最佳提取工藝條件下，重復(fù)3次試驗(yàn)，得到青刺果總黃酮得率的平均值為5.28%。

2.3 青刺果黃酮提取物的抗氧化活性

2.3.1 青刺果黃酮還原能力

青刺果黃酮、VC和BHT的還原能力見圖6。

由圖6可知，青刺果黃酮、VC和BHT的還原能力隨質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。在檢測(cè)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，青刺果黃酮還原力均低于VC；在質(zhì)量濃度低于0.12mg/mL時(shí)，青刺果黃酮還原力低于BHT，而質(zhì)量濃度大于或等于0.12mg/mL，其還原力與BHT相當(dāng)。

圖6 青刺果黃酮、VC和BHT的還原能力Fig.6 Reduction energy of prinsepia utilis royle flavonoids，BHT and VC

2.3.2 青刺果黃酮對(duì)·OH自由基清除作用

青刺果黃酮對(duì)羥自由基·OH的清除能力見圖7。

圖7 青刺果黃酮、VC和BHT對(duì)·OH清除作用Fig.7 Scavenging effect of prinsepia utilis royle flavonoids，VCand BHT on free radicals·OH

質(zhì)量濃度在0.4mg/mL～1.4mg/mL之間時(shí)，青刺果黃酮、VC和BHT對(duì)·OH（羥自由基）具有清除作用，且隨著反應(yīng)體系中濃度的增加，其對(duì)羥自由基的清除效果增強(qiáng)。質(zhì)量濃度相同時(shí)，對(duì)·OH自由基的清除能力VC最強(qiáng)，青刺果黃酮次之，BHT最弱。

2.3.3 青刺果黃酮對(duì)O2-·清除作用

青刺果黃酮對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除能力見圖8。

圖8 青刺果黃酮、VC和BHT對(duì)O2-·清除作用Fig.8 Scavenging effect of prinsepia utilis royle flavonoids，VCand BHT on free radicals O2-·

隨著質(zhì)量濃度的增加，青刺果黃酮、VC和BHT對(duì)超氧陰離子的清除能力均有增強(qiáng)的趨勢(shì)；在同一濃度下，三者對(duì)超氧陰離子自由基消除能力大小為：VC＞BHT＞青刺果黃酮。

3 結(jié)論

以得率為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，確定了超聲輔助法提取青刺果總黃酮最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶30（g/mL），提取溫度 60℃，超聲時(shí)間 35min，乙醇濃度60%。在此條件下，青刺果總黃酮得率為5.28%。以VC和BHT作為對(duì)照，考察了青刺果黃酮體外抗氧化活性。結(jié)果表明在所測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，青刺果黃酮具有一定的還原能力，且對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基有一定清除作用。青刺果黃酮的還原能力明顯低于VC，質(zhì)量濃度≥1.2mg/mL時(shí)，其還原能力與BHT相當(dāng)；濃度相同時(shí)，對(duì)·OH清除率比BHT的強(qiáng)、弱于VC，對(duì)O2-·的清除率弱于VC和BHT。

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Ultrasonic-assisted Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavoniods from Prinsepia utilis Royle

LIU Zhao-di，LIU Xiang-yi，ZHANG Shui-tao，LIN Zao-qin，LI Yun-xian，XU Juan*
（School of Chemical Engineering，Southwest Forestry University，Kunming 650224，Yunnan，China）

Ultrasonic-assisted extraction process for total flavonoids from Prinsepia utilis Royle oil meal was studied.The influence of flavonoids extraction was discussed by single factor；confirm its suitable extraction condition of flavonoids by orthogonal experiment．The evaluation of antioxidant activity was carried out by reduc－ing power，hydroxyl，superoxide anion scavenging assays in comparison to VCand BHT.The results showed that ethanol concentration 60%，extraction temperature 60℃，extraction time 35min，material-liquid radio 1 ∶30（g/mL），Under this conditions，the yield of total flavonoids from Prinsepia utilis Royle oil meal was 5.28%.Flavonoids from Prinsepia utilis Royle by ultrasonic-assisted extraction technological parameters presented strong antioxidant activity and its antioxidant capacity was equivalent to butylated hydroxyl toluene（BHT），than that of BHT，but lower than that of VC．

Prinsepia utilis Royle；total flavonoids；ultrasonic-assisted extraction；antioxidant activity

劉招娣，劉祥義，張水滔，等.青刺果總黃酮超聲波輔助提取及其抗氧化活性[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（1）：20-24

LIU Zhaodi，LIU Xiangyi，ZHANG Shuitao，et al.Ultrasonic-assisted Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavoniods from Prinsepia utilis Royle[J].Food Research and Development，2018，39（1）：20-24

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.005

云南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S201710677007）；西南林業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（C17009）

劉招娣（1996—），女（漢），本科，研究方向：天然產(chǎn)物提取研究。

*通信作者：徐娟（1982—），女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：生物質(zhì)資源開發(fā)及應(yīng)用。

2017-04-16