陳新兵, 黃榮峰, 王 娟

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

水稻矮桿突變體D814基因圖位克隆與功能分析

陳新兵, 黃榮峰*, 王 娟*

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

水稻株高對作物產(chǎn)量有著重要的影響，在水稻整個生長發(fā)育過程中，株高受到多因素的調(diào)控，而植物激素乙烯就是重要的影響因素之一。用10 mg/m3乙烯處理水稻幼苗，對水稻突變體庫進行篩選，獲得了3個根伸長生長對乙烯敏感性降低的突變體，其中1個突變體D814表現(xiàn)出植株矮化、分蘗數(shù)減少、千粒重下降等特征。圖位克隆將其定位在1號染色體上1 cM的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間有6個已報道的矮桿突變基因，通過對這6個基因測序，發(fā)現(xiàn)其中1個基因OsBRI1(LOC_Os01g52050)發(fā)生了點突變(編碼區(qū)第1 837位G突變?yōu)門)。并在D814中分別對OsBRI1的2個同源基因(OsBRL1和OsBRL3)進行測序，發(fā)現(xiàn)這2個基因均無突變。利用已報道的OsBRI1等位突變體gsor300084進行乙烯處理，發(fā)現(xiàn)gsor300084與D814一樣，表現(xiàn)出根對乙烯敏感性降低。OsBRI1是植物激素油菜素內(nèi)酯(brassinosteroid，BR)的信號受體，經(jīng)檢測，BR信號途徑響應(yīng)基因在D814突變體中的表達也有變化，說明D814是OsBRI1的1個等位突變體。功能分析發(fā)現(xiàn)，D814參與乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控途徑和植物鹽脅迫應(yīng)答途徑。研究結(jié)果為探究乙烯調(diào)控水稻生長發(fā)育及耐逆性的分子機理提供了研究材料，也為進一步探討油菜素內(nèi)酯與乙烯協(xié)同調(diào)控水稻生長發(fā)育機制奠定了理論基礎(chǔ)。

水稻；乙烯；矮桿；圖位克?。畸}脅迫應(yīng)答

水稻矮化是植物生長發(fā)育過程中的一個重要考察指標，對于作物產(chǎn)量、光合速率等具有重要的影響。矮化變異可作為一種穩(wěn)定性狀標記，用于新品種培育、作物遺傳改良等生產(chǎn)實踐[1]。根據(jù)矮化程度不同，可將水稻分為：半矮桿、矮桿、極矮桿3種表型，其中矮桿是指水稻株高表型比正常株高矮一半的矮桿突變體[2]。按照慣例，矮桿和極矮桿基因統(tǒng)一用符號d來命名，而半矮桿基因用符號sd來命名。目前在國家水稻數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站上(www.ricedate.cn)已鑒定出的矮桿基因有幾十個，其中分布在1號染色體上的矮桿基因有6個，分別為sd1、d2、d10、d18、d61、gid1。在這6個基因當中，d61是較早被發(fā)現(xiàn)的一個矮桿基因，是編碼植物激素油菜素內(nèi)酯(brassinosteroid，BR)的一個受體激酶BRI1。在水稻中，OsBRI1有2個同源基因，OsBRL1與OsBRL3，OsBRI1主要通過控制細胞分裂以及細胞伸長來調(diào)控器官發(fā)育，但對器官的起始不是必需的，而OsBRL1和OsBRL3主要是在根部響應(yīng)BR信號的應(yīng)答[3]。除此之外，OsBRI1在水稻的生長發(fā)育過程中起多種作用，包括節(jié)間伸長、葉傾角、暗形態(tài)建成等[4]。近年來通過正向遺傳學(xué)等手段也發(fā)現(xiàn)了許多OsBRI1的等位突變基因，例如半矮桿突變體Fn189(d54)的點突變導(dǎo)致OsBRIl激酶活性降低[5]。另外一個點突變體gsor300084，其點突變導(dǎo)致第444位的色氨酸突變?yōu)榫彼?，從而?dǎo)致對BR信號的鈍感表型[6]。OsBRI1除了參與植物生長發(fā)育以外，在逆境脅迫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要的作用。例如：鹽脅迫下，OsBRI1的表達量會顯著上升，從而導(dǎo)致植物體內(nèi)BR信號增強；隨著氧化脅迫強度的上升，BR能夠通過促進植物體內(nèi)H2O2的積累來使植物抵御這一傷害[7]。

對于BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，在擬南芥中已經(jīng)研究的十分清楚[8,9]。在水稻中，目前為止只鑒定出了一些與擬南芥相似的BR信號成分。OsBAK1與擬南芥中BAK1同源[10]，OsBZR1與擬南芥中BZR1的功能類似[11]。而擬南芥BIN2的同源基因OsGSK2，在水稻中同樣是BR信號的負調(diào)控因子[12]。除此之外，近年來BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中一些新的轉(zhuǎn)錄因子也陸續(xù)被鑒定出來：OsOFP8作為OsGSK2的作用底物參與BR信號途徑[13]；OsBUL1作為一個正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子參與BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[14]。隨著生物學(xué)的發(fā)展，水稻中越來越多的BR信號途徑新組分被鑒定出來，豐富和發(fā)展著BR信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在水稻生長發(fā)育的過程中，乙烯對植物的株高以及地下部生長發(fā)育具有十分重要的影響。挖掘乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的新組分是研究乙烯在植物體內(nèi)作用的分子基礎(chǔ)，也是目前常規(guī)的流行方法。作為重要的植物激素之一，乙烯在雙子葉植物體內(nèi)的作用主要表現(xiàn)為典型的三重反應(yīng)：抑制根的伸長生長、抑制下胚軸的伸長生長以及促進頂端彎曲；而在單子葉植物中乙烯只表現(xiàn)出二重反應(yīng)：抑制根的伸長生長和促進胚芽鞘的伸長生長[15]。研究表明，乙烯在植物體內(nèi)的這種作用主要是通過乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實現(xiàn)的[16～21]。除了調(diào)控植物生長發(fā)育作用外，乙烯還參與植物鹽脅迫、病原菌侵染等逆境脅迫條件下的應(yīng)答過程[22]。其中在鹽脅迫應(yīng)答中，乙烯可以通過調(diào)節(jié)水稻根系Na+/K+的轉(zhuǎn)運或者通過下游轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控耐鹽相關(guān)基因的表達[23]。

本研究用10 mg/m3乙烯處理水稻幼苗，對水稻突變體庫進行篩選，獲得了3個根對乙烯敏感性降低突變體，其中1個突變體D814表現(xiàn)出植株矮化、分蘗數(shù)減少、千粒重下降等顯著特征。圖位克隆將其定位在1號染色體上1 cM的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間有6個已報道的矮桿突變基因，通過對這6個基因測序發(fā)現(xiàn)其中1個基因OsBRI1(LOC_Os01g52050)發(fā)生點突變(第1 837位G突變?yōu)門)。同時檢測到D814中OsBRI1的2個同源基因(OsBRL1和OsBRL3)均無突變，且已報道的d61等位突變體gsor300084也表現(xiàn)出根對乙烯敏感性降低，而D814中BR響應(yīng)基因的表達也有所變化，上述結(jié)果說明該突變體很可能是OsBRI1基因點突變所致。進一步的功能分析發(fā)現(xiàn)，D814參與了乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控途徑和植物鹽脅迫應(yīng)答途徑。本研究為探究乙烯調(diào)控水稻生長發(fā)育及耐逆性的分子機理提供了研究材料，也為進一步探討B(tài)R與乙烯協(xié)同調(diào)控水稻生長發(fā)育奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與生長條件

1.1.1試驗材料 野生型02428和培矮64(PA64)水稻種子由本實驗室保存，3 000份以02428為背景的甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)誘變水稻突變體材料庫由本實驗室創(chuàng)建，乙烯敏感性降低矮桿突變體D814由本次實驗篩選并保存。用于D814突變體基因圖位克隆的F2群體由本實驗室創(chuàng)建。

1.1.2生長條件 2015年和2016年，連續(xù)2年在試驗基地(39.6°N，116.2°E)進行種植。土培幼苗：種植在土培盒中，在水稻培養(yǎng)溫室中(30℃,16 h白天/8 h黑夜)生長2周左右；水培幼苗：種植在鐵絲網(wǎng)架上，放入溫室培養(yǎng)4～5 d左右。

1.1.3試驗試劑 Trizol試劑盒購自天根生化有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自諾唯贊有限公司；用于熒光定量PCR的SYBR Green Mix購自翌圣生物科技有限公司。

1.2 乙烯篩選

選取萌發(fā)一致的水稻幼苗，種植在鐵絲網(wǎng)架上，每個鐵網(wǎng)格種植30粒水稻種子，每個株系種植3格，將網(wǎng)架放入10 L的塑料密閉培養(yǎng)箱中，加入5 L的水，使水面距離種子約1 cm處，封蓋，注入終濃度為10 mg/m3的乙烯氣體，長日照條件下培養(yǎng)4 d，進行表型觀察并統(tǒng)計初生根長，實驗設(shè)3次重復(fù)。

1.3 表型分析及農(nóng)藝性狀統(tǒng)計

在水稻幼苗期，選取土培2周左右的幼苗進行拍照；在水稻成熟期，分別對野生型02428和突變體D814植株進行觀察統(tǒng)計：隨機選取10株成苗，測量統(tǒng)計其株高、分蘗數(shù)、各節(jié)間長度等主要農(nóng)藝性狀；等種子成熟后，分別稱取野生型02428和突變體D814千粒重，并進行3次重復(fù)。

1.4 基因初步定位

將D814與PA64進行雜交獲得F1代后加繁一代得到F2代群體。選取飽滿度大致相同的F2群體以及親本野生型02428和PA64水稻種子，萌發(fā)后土培種植，在水稻溫室中培養(yǎng)2周左右，選取矮化表型幼苗單株，根據(jù)CTAB法提取基因組DNA后，首先隨機選取10個單株F2基因組DNA，按等濃度混勻構(gòu)成DNA混池，同時分別以野生型親本02428以及PA64的基因組DNA為模板進行PCR鑒定，PCR反應(yīng)程序為:95℃ 10 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s，共45個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR反應(yīng)體系為:模板1 μL，正反向引物各0.5 μL，2×PCR Mix 10 μL, 用H2O補齊到20 μL。PCR引物根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫中水稻品種02428和PA64的Indel分子標記進行設(shè)計，PCR產(chǎn)物用4%(w/V)瓊脂糖凝膠電泳。通過交換率分析確定D814突變基因所在染色體區(qū)域。再根據(jù)國家水稻數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http:rapdb.dna.affrc.go.jp/)對該區(qū)域基因的注釋與分析，選取候選基因。最后設(shè)計引物，將PCR產(chǎn)物測序后確定突變基因。

1.5 耐鹽性表型試驗

選取萌發(fā)一致的水稻種子，種植在裝有草炭土的種植盒中，每盒種植20粒水稻種子，每個株系種植8盒，分為對照組和處理組，封土，蓋好保鮮膜保濕，放在溫室中培養(yǎng)，待種子出苗后揭開保鮮膜，繼續(xù)培養(yǎng)2周左右，選取長勢一致的水稻幼苗放入150 mmol/L NaCl溶液中生長，每天觀察，待葉片萎蔫后進行復(fù)水處理，每天觀察并統(tǒng)計復(fù)水存活率,實驗設(shè)3次重復(fù)。

1.6 實時熒光定量PCR(Q-PCR)

分別剪取生長2周左右的野生型02428和突變體D814植株幼苗葉片，按Trizol試劑盒說明書步驟操作提取水稻總RNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過熒光定量PCR(IQ5 multicolor Real Time PCR Detection System)檢測乙烯信號途徑關(guān)鍵基因的表達。PCR反應(yīng)程序為:95℃ 10 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，共45個循環(huán)；以每30 s上升0.5℃的速率從55℃升至95℃來做為溶解曲線程序。PCR反應(yīng)體系為:模板1 μL，正反向引物各0.5 μL，SYBR Green Mix 10 μL, 用H2O補齊到20 μL。所用引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯不敏感突變體篩選

通過對野生型02428進行EMS誘變，獲得了3 000份水稻突變體材料，用10 mg/m3乙烯對其進行篩選，得到3個根伸長生長對乙烯敏感性降低的突變體，分別是D848、D814以及D841(圖1，彩圖見圖版一)。用已報道的水稻乙烯不敏感突變體ein2(日本晴背景)作為對照，在黑暗條件下水培4 d。統(tǒng)計數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在10 mg/m3乙烯處理下，野生型日本晴(Nip)和ein2初生根長分別縮短為原來的35.45%和76.72%。野生型02428的初生根長在10 mg/m3乙烯處理下縮短為正常條件下的31.69%，而D848、D814和D841突變體經(jīng)同樣處理后，初生根長度分別縮短為原來的43.35%、65.50%、41.88%，該結(jié)果表明這3個突變體的根伸長生長對乙烯敏感性均有所降低，其中D814根的伸長生長對乙烯的不敏感性最明顯。

表1 實驗所用引物序列Table 1 Sequences of the primers used in the experiment.

圖1 根對乙烯敏感性降低的水稻突變體篩選Fig.1 The screening of rice mutants with root decreased sensitivity to ethylenein.注：圖中為黑暗下生長4 d的幼苗在乙烯處理下的表型。其中，CK為對照組，未進行乙烯處理；C2H4為處理組，進行乙烯處理。(彩圖見圖版一)

2.2 D814參與調(diào)控乙烯信號途徑

為了進一步研究D814突變體根對乙烯敏感性降低的分子機制，在水稻幼苗期進行乙烯處理后，通過Q-PCR分別檢測了乙烯合成途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游調(diào)控基因的表達情況。對于乙烯合成家族基因，當外源施加乙烯處理水稻幼苗時，無論是野生型還是突變體，基因表達量都顯著升高(圖2A)，而對于乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的下游調(diào)控基因，當外源施加乙烯處理水稻幼苗時，OsSHR5和OsERF063的基因表達量只在野生型中有所上升，而在突變體中并未有明顯變化(圖2B)。該結(jié)果表明D814突變體阻斷了乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而對乙烯合成途徑無影響，從而說明D814是通過乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控植物根對乙烯的敏感性降低。

2.3 D814突變體表型分析

圖2 D814調(diào)控乙烯信號途徑基因的表達Fig.2 D814 regulates the expression of ethylene signaling-related genes.注：A：乙烯合成途徑中的關(guān)鍵酶編碼基因表達；B：乙烯信號下游基因OsSHR5和乙烯信號下游轉(zhuǎn)錄因子OsERF063的基因表達。CK為對照組，未進行乙烯處理； C2H4為處理組，進行乙烯處理。相對定量以ACTIN2為內(nèi)參基因。**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

d61突變體典型的表型就是株高變矮，其成熟期突變體高度相對野生型高度只有60%～70%左右，除此之外，d61突變體還會表現(xiàn)出直立葉、葉色深、突變體種子變黑等系列特征，其他的表型特征還包括葉夾角、葉鞘長度、分蘗數(shù)等[3～5]。分別對D814突變體在不同時期的表型進行了觀察。在幼苗期，D814突變體與02428相比表現(xiàn)出株高顯著變矮(圖3A、3B,彩圖見圖版一)；在成熟期，D814突變體與02428相比，在株高、花期、葉型、葉夾角、粒長、粒寬等主要農(nóng)藝性狀方面都存在顯著差異(圖3C～圖3I)，尤其是突變體平均株高為野生型的50.44%，OsBRI1的等位突變體d61-2以及gsor300084等都表現(xiàn)出相似的表型。除此之外，D814也像其他OsBRI1等位突變體一樣，表現(xiàn)出典型的直立葉、葉色深黑以及褐粒等。對D814突變體成熟期的各個節(jié)間進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)D814突變體株高變矮的原因主要是第一、第三和第四節(jié)間變短造成的。同時由于D814突變體粒長顯著小于野生型、粒寬略小于野生型，其千粒重也明顯低于野生型(表2)。這些結(jié)果表明D814能夠調(diào)控水稻的生長發(fā)育，而且D814在株高及種子的發(fā)育過程中具有十分重要的作用。

圖3 D814突變體與野生型表型比較Fig.3 Comparison of the phenotypes between D814 mutant and wild type.A：幼苗期植株；B：幼苗期根部；C：成熟期植株；D：成熟期節(jié)間長度；E：成熟期旗葉； F：成熟期穗部；G：成熟期穗頸及第一節(jié)間；H：成熟期籽長；I：成熟期粒寬(彩圖見圖版一)

2.4 D814突變基因定位

表2 D814突變體與野生型農(nóng)藝性狀比較Table 2 Comparison of agronomic traits between wild type and D814 mutant.

注：*和**分別表示同組數(shù)據(jù)中突變體與野生型相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。

利用D814的矮桿表型對其突變基因進行定位，在D814與培矮64(PA64)雜交的F2群體中篩選出了204株具有矮桿性狀的突變體單株。提取這些單株基因組DNA后，利用圖位克隆基因定位技術(shù)，首先將突變區(qū)間鎖定在1號染色體上，初步定位在2個標記(rm1-33和rm1-34)之間，該區(qū)間的遺傳距離為1 cM(圖4A)。通過水稻數(shù)據(jù)庫(http://rice.plant)查閱發(fā)現(xiàn)該區(qū)間已報道的矮桿基因有6個，分別為：調(diào)控赤霉素信號途徑中的GA20氧化酶基因sd1，參與獨角金內(nèi)酯合成途徑的細胞色素P450蛋白CYP90D2基因d2，類胡蘿卜素裂解雙加氧酶編碼基因d10，編碼赤霉素3β-羥化酶的基因d18，編碼油菜素內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的BR受體激酶的基因d61，以及編碼赤霉素信號途徑的GA受體的基因gid1。為了確定D814突變體矮化表型是否是由于這些基因引起的，分別提取野生型02428、突變體D814以及F2群體中隨機2個矮桿單株基因組DNA進行測序，結(jié)果表明只有d61(OsBRI1，LOC_Os01g52050)在其編碼區(qū)第1 837位堿基發(fā)生了點突變(由G突變?yōu)門)(圖4B)，導(dǎo)致其蛋白第613位氨基酸由甘氨酸變成了纈氨酸(G613V)(圖4C)。以上結(jié)果表明，D814突變體矮化表型可能是由于1號染色體上的d61等位突變引起。

圖4 突變基因D814在1號染色體上的定位圖Fig.4 Mapping of mutated gene D814 on chromosome 1.A、B：D814突變基因初步定位圖與測序結(jié)果；C：d61等位突變

為了進一步驗證該突變體是否由OsBRI1基因突變引起的，首先利用野生型以及突變體基因組DNA對其同源基因OsBRL1與OsBRL3啟動子及基因組全長進行測序，發(fā)現(xiàn)只有OsBRI1基因在其CDS區(qū)第1 837位發(fā)生了堿基突變(由G突變?yōu)锳)，而其同源基因并沒有發(fā)生突變。另一方面，由于突變體D814是在水稻突變體庫中用乙烯處理篩選出來的，于是利用已經(jīng)報道的以野生型松前為背景的d61水稻突變體gsor300084，與突變體D814一起進行乙烯處理，并觀察統(tǒng)計水稻根長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體gsor300084與D814一樣，初生根都表現(xiàn)出對乙烯的敏感性降低(圖5，彩圖見圖版一)。野生型02428和松前的初生根長在乙烯處理下分別縮短為正常條件下的26.47%和22.03%，而突變體D814和gsor300084分別縮短為57.14%和64.40%。從而進一步表明D814突變體可能是d61的等位突變體。

圖5 d61等位突變體gsor300084乙烯表型Fig.5 Comparison of the ethylene insensitive phenotypes between D814 and d61 mutant.注：圖中為光下生長4 d的幼苗在乙烯處理下的表型。CK為對照組，未進行乙烯處理； C2H4為處理組，進行乙烯處理。(彩圖見圖版一)

2.5 D814參與BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

為了驗證D814參與BR信號途徑，提取水培3 d的水稻幼苗總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后檢測BR信號響應(yīng)基因的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsBRI1及其同源基因OsBRL1與OsBRL3基因表達量相對于野生型并沒有明顯變化，BR信號傳導(dǎo)途徑基因OsBAK1，其表達量相對于野生型也沒有明顯變化。而對于BR信號下游響應(yīng)基因OsOFP8、OsBLE1和OsBUL1，在突變體D814中其基因表達水平相對于野生型02428顯著降低，而BR信號途徑負調(diào)控因子OsGSK2的基因表達略有升高(圖6)。該結(jié)果表明D814參與BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，也進一步證明了D814突變體很可能就是d61等位突變體。

2.6 D814參與植物鹽脅迫應(yīng)答

圖6 D814調(diào)控BR信號途徑基因的表達Fig.6 D814 regulates the expression of BR signaling-related genes.注：相對定量以ACTIN2為內(nèi)參基因。*表示與野生型02428相比差異顯著(P<0.05)；**表示與野生型02428相比差異極顯著(P<0.01)。

鹽脅迫是植物非生物脅迫的一個重要方面，植物在抵御鹽脅迫過程中，一方面通過Na+/K+轉(zhuǎn)移等離子通道，另一方面通過調(diào)控體內(nèi)一些植物激素水平來減輕鹽脅迫對植物造成的傷害。之前的研究[24]表明，乙烯作為一種重要的植物激素，能夠負調(diào)控水稻耐鹽性，因此比較了突變體D814和野生型02428的耐鹽性。觀察發(fā)現(xiàn)，使用150 mmol/L NaCl處理7 d后，水稻幼苗開始出現(xiàn)葉片卷曲，其中突變體發(fā)生卷曲的葉片數(shù)少于野生型(圖7A，彩圖見圖版二)。拍照統(tǒng)計后對處理組幼苗進行復(fù)水，復(fù)水5 d后拍照并統(tǒng)計成活率。結(jié)果顯示，野生型水稻幼苗復(fù)水后成活率為9.14%，而突變體復(fù)水后成活率為56.08%(圖7B)。說明D814突變體對高鹽脅迫的耐受力明顯高于野生型，并進一步表明D814能參與調(diào)控水稻鹽脅迫應(yīng)答。

3 討論

隨著對植物激素乙烯的深入研究，越來越多的乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的新組分被挖掘出來。例如在水稻中篩選到的乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑突變體mhz6等[25]，這些新組分的篩選不但闡明和完善了乙烯在植物體內(nèi)的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而且為育種學(xué)家培育新品種提供了理論基礎(chǔ)。

圖7 D814突變體與野生型鹽脅迫表型比較Fig.7 Comparison of mutants D814 and wild type in response to salt stress.注：A：野生型和突變體幼苗鹽處理表型。B：野生型和突變體幼苗鹽處理后復(fù)水成活率。**表示同組數(shù)據(jù)與野生型相比極顯著(P<0.01)。(彩圖見圖版二)

本研究首先用10 mg/m3濃度乙烯處理2周左右的水稻幼苗，對實驗室突變體庫進行篩選，獲得了3個根對乙烯敏感性降低的突變體：D841、D814和D848，從而為后續(xù)探究乙烯在植物體內(nèi)的作用及分子機理提供了寶貴的材料。由于突變體D814初生根的伸長生長對乙烯的敏感性最低，因此選擇D814突變體作為進一步的研究材料。表型觀察發(fā)現(xiàn)D814在整個植株生長發(fā)育的過程中，都表現(xiàn)出植株矮化、分蘗數(shù)減少、千粒重下降等顯著特征，與大多數(shù)OsBRI1基因的等位突變體相似，具有直立葉、葉色深等表型，說明D814可能是BR信號途徑有關(guān)的突變體，能夠參與水稻生長發(fā)育的調(diào)控，也說明D814在調(diào)控水稻生長發(fā)育過程中具有十分重要的作用，特別是在調(diào)控水稻株高方面。通過圖位克隆，將D814突變基因初步定位在1號染色體上遺傳距離為1 cM的區(qū)間內(nèi)，并通過基因測序表明其中的d61基因在編碼區(qū)1 837位堿基發(fā)生了點突變(由G變成T)，導(dǎo)致氨基酸的改變。從而說明D814突變基因很可能是d61的等位突變。之前的研究報道了d61的2個等位突變體d61-1和d61-2也都是點突變體(圖4)。d61編碼一個BR受體蛋白激酶，突變后會導(dǎo)致體內(nèi)BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，從而表現(xiàn)出節(jié)間伸長被抑制、葉片直立等典型特征[26]。在水稻中，BR不僅能夠單獨調(diào)控植物的生長發(fā)育，BR也能參與植物激素乙烯的合成與調(diào)控。例如BR與乙烯相互拮抗來共同調(diào)節(jié)下胚軸的生長[27]，也可以通過增強乙烯合成限速酶ACS5蛋白的穩(wěn)定性來調(diào)控乙烯的生物合成[28]。BR處理后，可以提高乙烯不敏感突變體ein2在鹽脅迫下種子的發(fā)芽率[29]。而D814作為BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻的突變體，幼苗期根部表現(xiàn)出對乙烯敏感性降低的特征，表明D814可作為一個良好的材料，對其深入研究將會為闡明油菜素內(nèi)酯與乙烯協(xié)同調(diào)控水稻生長發(fā)育機制奠定理論基礎(chǔ)。

由于初定位的遺傳距離1 cM的區(qū)間范圍太大，在該區(qū)間內(nèi)是否還有其他基因發(fā)生突變尚不清楚，同時為了進一步的驗證D814突變基因確實是OsBRI1，首先通過對同源基因OsBRL1和OsBRL3啟動子和基因組序列全長進行測序發(fā)現(xiàn)，其同源基因并沒有發(fā)生任何突變，只有OsBRI1基因在其CDs區(qū)發(fā)生了點突變(圖4)，進一步推測，如果突變基因確實是OsBRI1，那么D814突變體就應(yīng)該和已報道的d61等其他突變體一樣具有相似的表型，于是對已報道的d61等位點突變體gsor300084進行乙烯處理，觀察D814與gsor300084突變體根部表型，通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)D814和gsor300084一樣，根部都表現(xiàn)出對乙烯敏感性降低(圖5)，從而進一步說明D814很可能是OsBRI1的一個新的等位突變體。最后，進一步檢測了D814突變體中BR信號響應(yīng)基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)突變體中這些基因的表達量與02428野生型有顯著差異(圖6)，進一步說明D814參與BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，但還需要進一步的精細定位以及遺傳數(shù)據(jù)等來證明。

乙烯功能的發(fā)揮最終都是將乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)給下游一些轉(zhuǎn)錄因子，從而啟動乙烯相關(guān)基因的表達。在水稻中，乙烯處理能顯著誘導(dǎo)乙烯信號下游基因OsSHR5(LOC_Os08g10310)與OsERF063(LOC_Os09g11480)超高量表達[30]。而在D814突變體中，基因OsSHR5與OsERF063的表達量在乙烯處理前后并沒有顯著的差異，表明D814參與乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而使突變體D814表現(xiàn)出根對乙烯的敏感性下降。之前研究表明，在水稻中乙烯能夠負調(diào)控水稻的耐鹽性[31]，并且發(fā)現(xiàn)D814表現(xiàn)出耐鹽性增加，進一步表明D814通過阻斷乙烯信號途徑提高了植物的耐鹽性。以上研究對闡明乙烯在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和鹽脅迫應(yīng)答中發(fā)揮功能的分子機制具有十分重要的意義。

綜上所述，本研究鑒定了3個乙烯敏感性降低的水稻突變體，這些突變體的根都呈現(xiàn)了對乙烯的鈍感表型。通過圖位克隆方法初步鑒定D814可能為BR途徑的受體激酶OsBRI1點突變。進一步研究發(fā)現(xiàn)，D814突變體呈現(xiàn)耐鹽性增加，揭示了乙烯可能通過BR途徑調(diào)控根生長和鹽脅迫反應(yīng)的機制。這些研究對于揭示水稻乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制具有重要意義，為探究乙烯調(diào)控水稻生長發(fā)育及耐逆性的機理提供了研究材料，也為進一步探討油菜素內(nèi)酯與乙烯協(xié)同調(diào)控水稻生長發(fā)育機制奠定了理論基礎(chǔ)。

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Map-basedCloningandFunctionAnalysisofRiceDwarfMutantD814

CHEN Xinbing, HUANG Rongfeng*, WANG Juan*

BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China

Plant height confers important effects on crop yield in rice, which is regulated by many aspects in the growth and development process. Ethylene is one of important factors for regulating plant growth and stress response. In this research, we identified a mutantD814 from the mutants insensitive to ethylene in roots growth.D814 mutants showed the dwarf phenotype, decreased effective tilling numbers and reduced 1000-grain weight. Map-based cloning indicated thatD814 located in 1 cM range on chromosome 1, in which there contained six genes contributed to dwarf phenotype in the previous researches. Sequencing analyses demonstrated thatOsBRI1(LOC_Os01g52050) has a point mutation at 1 837 bp downstream of ATG, in which the G is changed to T. There were two homologous genes ofOsBRI1 in rice,OsBRL1 andOsBRL3, of which the sequences have no mutation inD814 mutants. A reported mutant ofOsBRI1,gsor300084, also showed decreased sensitivity to ethylene in root. Due to the function of OsBRI1 was a receptor in brassinosteroid (BR) signal pathway, we found the expressions of BR-response genes were affected inD814, which indicated thatD814 was an allele mutant ofOsBRI1. Moreover, our analyses showed thatD814 affected the expression levels of ethylene signaling-related genes and displayed increased salt tolerance. Thus our research provided a novel research material for exploring the molecular mechanism of ethylene regulating rice growth and stress tolerance, and laid a foundation for investigating the interplay of ethylene and brassinosteroid in growth and development.

rice; ethylene; dwarf; map-based cloning; salt stress response

2017-05-10;接受日期2017-07-10

國家自然科學(xué)基金項目(31470366)資助。

陳新兵，碩士研究生，研究方向為水稻新基因發(fā)掘與功能研究。E-mail:chenxinbing_caas@163.com。*通信作者：黃榮峰，研究員，主要從事植物激素與逆境脅迫應(yīng)答研究。E-mail:rfhuang@caas.cn；王 娟，助理研究員，主要從事作物蛋白質(zhì)功能研究。E-mail:wangjuan@caas.cn

10.19586/j.2095-2341.2017.0040