徐小文 王義勛 劉星

摘要：概述了近年來國內(nèi)外學(xué)者在松材線蟲病致病機(jī)理研究方面的進(jìn)展。該病害的致病決定因子主要包括幾個(gè)理化特性，①由線蟲食道腺產(chǎn)生的細(xì)胞壁水解酶，通過作用寄主細(xì)胞壁來幫助線蟲侵入、擴(kuò)散，最終影響寄主水分傳輸；②松材線蟲分泌的部分蛋白會(huì)參與到與寄主細(xì)胞的互作中來；③松材線蟲本身產(chǎn)生的植物毒素和其攜帶的細(xì)菌分泌的毒素可使寄主松樹萎蔫；④松材線蟲表面蛋白的作用。

關(guān)鍵詞：松材線蟲?。恢虏C(jī)理；綜述

中圖分類號：S432.4；S791.24 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）20-0005-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.20.001 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： This article provided a comprehensive overview of recent advances in the pathogenesis of pine wilt disease by scholars at home and abroad. Several physical and chemical traits have been studied as pathogenicity determinants. First， cell wall-degrading enzymes excreted of pine wood nematode（PWN） are used to help nematode migration by degrading the cell wall of host and thereby broken the water transportation； Second， some excreted proteins by PWN could be involved in nematode-plant interactions； Third， phytotoxins secreted by bacteria that are carried by PWN and toxins produced by PWN are proposed to arouse pine wilt； Fourth， surface coat proteins of PWN play important roles in the pathogenicity of it.

Key words： pine wilt disease； pathogenetic mechanism； review

松材線蟲病是由滑刃科（Aphelenchoididae）傘滑刃屬（Bursaphelenchus）的松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）引起的松樹上的一種毀滅性病害。該病害可使高感植株在感染后較短時(shí)間內(nèi)（2～3個(gè)月）萎蔫死亡，所以又被稱為松樹萎蔫病[1]。經(jīng)研究統(tǒng)計(jì)，已有高達(dá)50多種松屬樹種和10多種非松屬樹種成為該病害的為害對象[2，3]。自1905年在日本長崎大暴發(fā)以來，該病害不斷在世界各地被發(fā)現(xiàn)，截至目前該病已在亞洲、歐洲和北美洲等地的多個(gè)國家被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道[4，5]。而在中國，據(jù)國家林業(yè)局2018年發(fā)布的公告顯示，中國松材線蟲病的疫區(qū)已擴(kuò)散蔓延至16個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)）。因此，松材線蟲病嚴(yán)重威脅林業(yè)生態(tài)環(huán)境的安全，值得學(xué)者對其進(jìn)行長期深入的研究，以期早日攻克該病害。

1 松材線蟲病的致病機(jī)理

基于松材線蟲病的重要性和復(fù)雜性，對該病致病機(jī)理的研究長期以來是熱點(diǎn)。綜合近年來的研究結(jié)果，對該病害的致病機(jī)理研究綜述如下。

1.1 細(xì)胞壁降解酶的作用

松材線蟲病的早期病癥離不開線蟲產(chǎn)生的一系列水解酶的作用，這些酶類被認(rèn)為是決定線蟲致病性的關(guān)鍵因子，比如纖維素酶、果膠酶等[6]。這些酶類能夠通過降解和破壞寄主植株的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜來幫助線蟲侵染。當(dāng)寄主的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被水解酶有效破壞后，樹脂道中的樹脂會(huì)因此發(fā)生滲漏，最后造成的結(jié)果是樹脂擴(kuò)散到了相鄰的管胞中，從而影響水分的正常傳輸，誘發(fā)寄主萎蔫[2]。Odani等[7]通過體外試驗(yàn)證明用松材線蟲分泌的含纖維素酶的粗提物和商品化的纖維素酶、果膠酶等水解酶類處理赤松的幼苗都有與松材線蟲侵染相同的癥狀，由此說明這些水解酶類參與松材線蟲病的病理反應(yīng)。而編碼這些酶類基因的來源是什么呢？Kikuchi等[8]2004年利用分子生物學(xué)手段研究了來自松材線蟲的一個(gè)編碼糖基水解酶的基因家族第45纖維素酶類，結(jié)果表明這些酶基因以基因轉(zhuǎn)移的方式從真菌中獲得；而該研究小組又在2005年發(fā)表文章揭示松材線蟲中編碼內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶的基因來自細(xì)菌的基因水平轉(zhuǎn)移[9]。正是不同物種間水解酶基因的水平轉(zhuǎn)移使得松材線蟲獲得了更好的適應(yīng)能力[8，9]。盡管這些細(xì)胞壁水解酶類在線蟲與植株的互作中起到重要的作用，但是由于在不具致病性的擬松材線蟲中也存在這些水解酶類，而且目前缺乏此類酶參與致病的直接證據(jù)，所以該類酶的確切功能仍需探討。Ma等[10]通過RNAi技術(shù)證明纖維素酶被干擾表達(dá)后導(dǎo)致松材線蟲的繁殖力和擴(kuò)散能力顯著下降。因此，一個(gè)可能的解釋是這些由線蟲食道腺細(xì)胞產(chǎn)生的酶類主要作用于線蟲在寄主植物內(nèi)的移動(dòng)[11]。

1.2 參與線蟲與寄主互作過程的寄生蛋白的作用

盡管對于線蟲與寄主互作過程中參與的寄生蛋白的研究已有不少，但研究對象多集中在寄主內(nèi)部不發(fā)生移動(dòng)的固定線蟲，比如主要危害植物根部的根結(jié)線蟲和胞囊線蟲。通過對這兩種線蟲食道腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，鑒定出了大量的與寄生相關(guān)的基因，它們能編碼不同的效應(yīng)蛋白來協(xié)助線蟲寄生[12-16]。對松材線蟲寄生基因或者效應(yīng)因子的研究近年來取得了較大進(jìn)展。Shinya等[17]在2013年通過高靈敏度的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合可靠的基因組序列信息，分析鑒定出了1 515個(gè)松材線蟲的分泌蛋白，它們的功能主要為營養(yǎng)物質(zhì)的攝取、寄主內(nèi)的遷移擴(kuò)散和躲避寄主防御系統(tǒng)等。進(jìn)一步分析松材線蟲分泌蛋白組學(xué)中鑒定出的肽段后發(fā)現(xiàn)，與對照相比，這些顯著增加的分泌蛋白和蛋白抑制子來源于基因倍增和不同物種間的基因水平轉(zhuǎn)移。Espada等[18]在2016年通過分析比較松材線蟲幼蟲期和成蟲期的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)及借助效應(yīng)蛋白預(yù)測工具鑒定出了許多新的寄生相關(guān)基因，這些基因被認(rèn)為很可能介導(dǎo)松材線蟲與寄主的互作，而后在采用原位雜交技術(shù)深入研究這些寄生基因后表明它們總體可以被歸納為兩類解毒蛋白，一類在食道腺細(xì)胞特異表達(dá)，另一類在消化系統(tǒng)特異表達(dá)，這些解毒蛋白能夠幫助線蟲成功侵染寄主。

1.3 植物毒素和細(xì)菌毒素的作用

當(dāng)松樹被松材線蟲侵染后，病程的發(fā)展十分迅速，而且寄主發(fā)生細(xì)胞死亡的時(shí)間比線蟲大量繁殖的時(shí)間要早，表明線蟲可能通過產(chǎn)生植物毒素來誘導(dǎo)寄主的細(xì)胞死亡。Oku等[19]自1979年開始嘗試在受害松樹中提取毒素候選物，并不斷開展試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)將病樹的粗提物接種到健康的松樹苗上會(huì)使其萎蔫，而健康松樹的粗提物則不會(huì)。另外，不同品種的松樹對相同粗提物的耐受度也不一樣，感病株比抗病株對粗提物更敏感。分析粗提物的化學(xué)組分，然后單獨(dú)使用鑒定出的化學(xué)物接種后發(fā)現(xiàn)，苯甲酸、8-羥基香芹酮和二羥松柏醇是使松苗萎蔫的原因。Shaheen等[20]在1984年采用兩種不同的方法從不同品種的病松樹中提取化合物來接種松樹苗，結(jié)果表明無論是用炭抽提法還是基于三氯甲烷的抽提法得到的物質(zhì)都能使健康的兩年生的松樹苗在一周至一個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)萎蔫，抽提化合物造成松苗萎蔫的效率與其劑量呈正相關(guān)。將抽提物中的化學(xué)組分進(jìn)行分析鑒定和接種試驗(yàn)后證明，其中的香芹酮水合物和10-羥基馬鞭烯酮都具備使松苗發(fā)生萎蔫的功能[1，20]。雖然學(xué)者們通過試驗(yàn)觀察到這些粗提物導(dǎo)致植株萎蔫的現(xiàn)象伴隨著植物氣孔的大量關(guān)閉，從而推測它們參與寄主的蒸騰作用，但具體這些代謝物的來源和功能仍需更深入的研究[20，21]。

線蟲攜帶的細(xì)菌也是毒素的來源。松材線蟲攜帶的細(xì)菌數(shù)量多、種類雜，有研究表明一頭成年線蟲的體表有多達(dá)290個(gè)細(xì)菌[22-24]。假單胞菌屬、黃單胞菌屬、泛菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬、布丘氏菌屬、葡萄球菌屬等都包含其中[25-29]。各國學(xué)者通過分析不同國家和地區(qū)松材線蟲病疫區(qū)里的線蟲所攜帶的細(xì)菌后對于這些細(xì)菌的來源有兩個(gè)假說，一是它們被線蟲攜帶后用來促進(jìn)病害的發(fā)生，這些細(xì)菌要么只能夠通過線蟲進(jìn)入寄主松樹，要么本身就存在于松樹體內(nèi)，而松材線蟲侵入后，二者之間形成了共生關(guān)系；二是這些細(xì)菌附著在線蟲的體表，它們與病樹的萎蔫癥狀無關(guān)。這些不同來源的細(xì)菌的功能是什么呢？Oku等[25]研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲體表攜帶假單胞菌，而該細(xì)菌能夠分泌使得松樹萎蔫的毒素。Kawazu等[30，31]發(fā)現(xiàn)松材線蟲攜帶的3種細(xì)菌能夠產(chǎn)生苯甲酸，而苯甲酸是造成松樹萎蔫的原因。該研究小組認(rèn)為死亡的線蟲可以作為這些產(chǎn)生苯甲酸毒素的細(xì)菌的營養(yǎng)來源。與強(qiáng)致病力的松材線蟲相比，低致病力的松材線蟲攜帶細(xì)菌產(chǎn)生苯甲酸的量顯著降低，表明線蟲體表細(xì)菌產(chǎn)生苯甲酸的能力決定了線蟲的致病力。Han等[32]在2003年經(jīng)試驗(yàn)證明，將無菌的線蟲接種松苗不能使其發(fā)生萎蔫，但是將假單胞菌和線蟲混合后接種卻能夠引起松苗萎蔫，由此認(rèn)為松材線蟲病的病因是線蟲和其攜帶細(xì)菌共同作用的結(jié)果。Zhao等[33]在2011年發(fā)現(xiàn)將無菌松材線蟲與7個(gè)分離到的芽孢桿菌屬或者寡養(yǎng)單胞菌屬中的任何一個(gè)組合接種松苗都能導(dǎo)致松苗萎蔫。Zhao等[28]在病樹上的線蟲體表分離到24個(gè)細(xì)菌菌株，其中有17個(gè)被證明能夠產(chǎn)生植物毒素。Guo等[23]研究發(fā)現(xiàn)線蟲攜帶的部分細(xì)菌能夠分泌鞭毛蛋白和環(huán)二肽等對松苗有毒的蛋白。近年來，也有研究表明線蟲攜帶的細(xì)菌所屬的種類對碳元素的利用率越高，線蟲的致病力就越強(qiáng)，說明線蟲攜帶細(xì)菌的碳代謝水平與其致病力密切相關(guān)[34]。關(guān)于線蟲攜帶細(xì)菌的研究報(bào)道有很多，但是目前仍然有很多疑問和難點(diǎn)需要進(jìn)一步的研究，比如這些細(xì)菌與線蟲的寄主范圍之間的關(guān)系，線蟲致病力有無與其的關(guān)系等。

1.4 表面外殼蛋白的作用

線蟲的體表還攜帶有許多蛋白，這些蛋白也可能是決定線蟲致病力的因子。它們能夠與寄主細(xì)胞直接互作從而影響病情的發(fā)展。凝集素結(jié)合試驗(yàn)表明松材線蟲毒力株和無毒株卵殼表面的碳水化合物的組分不一樣[35]。Shinya等[36]通過凝集素結(jié)合試驗(yàn)來分析不同發(fā)育階段的松材線蟲的表面外殼蛋白，結(jié)果表明糖蛋白在不同的發(fā)育階段有明顯的變化。蛋白組學(xué)手段也被用來分析松材線蟲表面外殼蛋白的種類，結(jié)果表明從松苗上提取的線蟲的表面外殼蛋白的數(shù)量是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用線蟲食用真菌培養(yǎng)的松材線蟲的9倍，其中有37種蛋白在二者之間有顯著的表達(dá)量差異。這37種蛋白被進(jìn)行了深入解析，在被鑒定出來的32種蛋白中，有17種蛋白的表達(dá)量在松苗被感染后顯著上調(diào)，6種蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，另外9種蛋白來自細(xì)菌[36]。這些上調(diào)表達(dá)蛋白的功能經(jīng)生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)可能參與響應(yīng)寄主的防御反應(yīng)。上述研究表明，松材線蟲體表的外殼蛋白的數(shù)量和種類會(huì)隨著線蟲的發(fā)育和活動(dòng)而發(fā)生變化，其中更有參與響應(yīng)寄主防衛(wèi)反應(yīng)的蛋白，由此可以推斷，表面外殼蛋白在線蟲與環(huán)境，尤其是寄主間互作中起重要的調(diào)控作用[37]。Davies等[38]總結(jié)得出，以模式生物秀麗隱桿線蟲為研究對象，發(fā)現(xiàn)線蟲可以通過感應(yīng)植物的信號從而改變表面外殼蛋白的組分和結(jié)構(gòu)來適應(yīng)新的寄主環(huán)境或者逃避寄主的防御反應(yīng)，在松材線蟲中這些表面外殼蛋白的組分也隨著線蟲發(fā)育階段不同或者其致病力的不同而有差異，可以推測這些蛋白參與了寄主信號響應(yīng)，在松材線蟲的致病力和寄主環(huán)境適應(yīng)性上起到了重要作用。

2 結(jié)語

松材線蟲病自發(fā)現(xiàn)以來，許多科研團(tuán)隊(duì)都投入了大量的精力來研究該病害的發(fā)病規(guī)律和試圖提出防治策略，但由于此病害涉及的影響因素很多，包括線蟲本身、真菌、細(xì)菌、松樹、傳播媒介昆蟲以及溫度、濕度等環(huán)境因子，導(dǎo)致了目前對松材線蟲病的致病機(jī)理及防治手段都沒有解析完全和根本解決[1]。作者列舉了近年來在松材線蟲致病機(jī)理方面的研究成果，但概括而言，仍然有許多問題值得深入研究，比如松材線蟲分泌蛋白的靶標(biāo)蛋白和具體功能、松材線蟲分泌的植物毒素有效物質(zhì)和作用方式、寄主的內(nèi)生菌影響、線蟲與傳播媒介的互作等。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和科研水平的日益提高，不斷地有新技術(shù)應(yīng)用到該病害研究上來，比如蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等，相信不久的將來，對松材線蟲病的研究會(huì)取得更大進(jìn)展。

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