張永霞 王金福 宗 琪 陳菊紅

（上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201600）

RT-PCR熒光探針技術(shù)檢測(cè)中藥輔助治療犬瘟熱臨床療效的研究

張永霞 王金福 宗 琪 陳菊紅

（上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201600）

基于前期中藥輔助治療犬瘟熱病研究的基礎(chǔ)，本次研究將186只來(lái)自上海三家寵物醫(yī)院2014～2016年就診的犬瘟熱病犬隨機(jī)分為兩組，第一組為96只，僅用西藥治療。第二組為90只，在西藥治療的基礎(chǔ)之上運(yùn)用中藥進(jìn)行輔助治療。然后隨機(jī)選取了62只（每組31只），用RT-PCR熒光探針技術(shù)檢測(cè)治療14d后病犬的外周血血清中的犬瘟熱病毒抗原。研究結(jié)果表明：添加中藥輔助治療組陽(yáng)性率比僅用西藥組下降38.71%，說(shuō)明應(yīng)用課題組研發(fā)的中藥可有效地消滅病犬體內(nèi)的犬瘟熱病毒。

RT-PCR熒光探針 中藥輔助治療 犬瘟熱 臨床效果

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）引起的一種高度接觸性、傳染性、致死性疾病。病犬早期表現(xiàn)為雙相熱型、急性卡他性鼻炎、后期以支氣管炎、卡他性肺炎、嚴(yán)重的胃腸炎和神經(jīng)癥狀為主要特征，少數(shù)病例可出現(xiàn)腳墊和鼻端的高度角化。犬瘟熱病犬的病死率可達(dá)80%[1]。前期，課題組已研發(fā)出治療犬瘟熱的中藥膠囊，并進(jìn)行了為期一年的寵物醫(yī)院臨床用藥情況記錄與統(tǒng)計(jì)，研究表明，課題組研發(fā)的中藥制劑對(duì)輔助治療犬瘟熱病有較好的效果。本研究應(yīng)用RT-PCR熒光探針技術(shù)對(duì)比檢測(cè)僅用西藥治療和加入中藥輔助治療的病犬的外周血血清中犬瘟熱病毒含量，初步研究出中藥輔助治療對(duì)犬瘟熱病有效的機(jī)理，為課題組研制的治療犬瘟熱的中藥制劑在臨床大規(guī)模應(yīng)用提供一定的理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品：犬六聯(lián)高免血清購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍需大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院生物制品研究中心；中藥膠囊中所用的中藥飲片黃芩、黃連、生石膏、知母、杏仁等均購(gòu)買(mǎi)于自上海余天成大藥房；犬干擾素-α購(gòu)自中科拜耳生物技術(shù)有限公司；犬瘟熱單克隆抗體和免疫球蛋白均由北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)；犬瘟診斷試紙為韓國(guó)瑞必診快速診斷試紙。

1.1.2 試劑：RNA提取試劑盒、犬瘟熱病毒（CDV）核酸檢測(cè)試劑盒（RT-PCR熒光探針?lè)ǎ┵?gòu)自上海江萊生物科技有限公司。

1.1.3 儀器：冷凍離心機(jī)（Eppendorf）、ABI Step-One-Plus熒光定量PCR儀。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物：來(lái)自三家上海的寵物醫(yī)院2014～2016年前來(lái)就診的186只犬瘟熱患病犬。

1.2 方法

1.2.1 犬瘟熱病確診依據(jù)：犬瘟熱診斷試紙檢測(cè)為陽(yáng)性，結(jié)合出現(xiàn)發(fā)熱、飲欲增加、食欲不振、流水樣鼻液等臨床癥狀。

1.2.2 病犬分組：第一組96只，采用西藥常規(guī)治療即病初注射免疫球蛋白、IFN、高免血清、犬瘟熱單克隆抗體，出現(xiàn)嘔吐癥狀添加654-2，有炎癥發(fā)生添加頭孢菌素等抗生素治療。第二組90只，在第一組治療的基礎(chǔ)之上，用前期研發(fā)的中藥膠囊進(jìn)行中藥輔助治療。

1.2.3 待測(cè)血清的制備：從上述1.2.2病犬之中隨機(jī)選擇62只（每組31只），取每只病犬治療14d后的外周靜脈血2ml，1000×g離心20min，吸取上清液即可。

1.2.4 RNA的提取：依據(jù)上海江萊生物的RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)：取待檢血清100μl，添加100μl Solution R1，振蕩混合30s，室溫靜置1min；混勻樣本，加入600μl Solution R2顛倒混勻，室溫下靜置3～5min；把上清液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，12000rpm離心30s，棄去套管中液體。加入600μl Wash Buffer，12000rpm離心30s，重復(fù)此步一次?？罩?0000rpm離心1min，把空心柱轉(zhuǎn)移至新的1.5ml滅菌離心管中。加入10～20μl Elution Buffer 到吸附膜的中央，室溫下靜置1min，離心30s，即獲得總RNA。

1.2.5 RT-PCR熒光探針檢測(cè)樣品CDV核酸：每個(gè)反應(yīng)管中加入CDV反應(yīng)液20μl，酶液1μl，將每個(gè)樣品提取的RNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μl，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)。設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為25μl；熒光通道選擇：檢測(cè)通道FAM。淬滅通道NONE。循環(huán)參數(shù)設(shè)置（見(jiàn)表1）。

表1 熒光PCR循環(huán)參數(shù)t

2 結(jié)果

2.1 陰性和陽(yáng)性質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果

陽(yáng)性、陰性各只取一組數(shù)據(jù)進(jìn)行畫(huà)圖，見(jiàn)圖1。從圖中可見(jiàn)陽(yáng)性呈明顯指數(shù)增長(zhǎng)曲線，且Ct值約為7，小于32，而陰性無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)曲線，判定此次試驗(yàn)成功。

圖1 陰性和陽(yáng)性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線

2.2 兩組CDV RNA RT-PCR熒光探針檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)如下：陽(yáng)性：檢測(cè)通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線；可疑：檢測(cè)通道35.0＜Ct值≤37，需重復(fù)檢測(cè)，如檢測(cè)通道仍為35.0＜Ct值≤37，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線，判斷為陽(yáng)性，否則為陰性；陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞37或無(wú)Ct值。本研究對(duì)兩組共62份（每組中各選取31只）臨床治療14d的CDV臨床病犬的血清進(jìn)行RT-PCR熒光探針檢測(cè)結(jié)果顯示：第一組（常規(guī)西藥治療組），31只犬中有22只為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為70.97%；第二組（中藥輔助治療組），31只犬中有10只為陽(yáng)性；陽(yáng)性率32.26%。中藥輔助治療組陽(yáng)性率比常規(guī)西藥組下降38.71%。其中部分陽(yáng)性樣品擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2，部分陰性樣品擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖3。

圖2 部分陽(yáng)性樣品擴(kuò)增曲線

圖3 部分陰性樣品擴(kuò)增曲線

3 討論

（1）熒光 PCR是在 PCR 的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的核酸檢測(cè)技術(shù)[2]。熒光PCR技術(shù) 具有無(wú)須做梯度稀釋便可準(zhǔn)確的定量檢測(cè)，定量范圍極寬，無(wú)須PCR后處理，特異性強(qiáng)，克服了單純PCR 高效擴(kuò)增產(chǎn)生的假陽(yáng)性結(jié)果，有較高的準(zhǔn)確性和比普通 PCR迅速、靈敏、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。因此，熒光PCR 可為臨床病情觀察和治療提供可靠的依據(jù)[3-4]。本研究所用的犬瘟熱病毒（CDV）核酸RT-PCR熒光探針試劑盒，陽(yáng)性和陰性參考品的符合率均為100%，最低檢測(cè)限為5.0×102copies/ml，批內(nèi)，批間精密檢測(cè)Ct值的變異系數(shù)（CV）均小于等于3%，符合試驗(yàn)要求。

（2）目前，在犬瘟熱中藥治療方面，只有方愛(ài)國(guó)等少數(shù)人進(jìn)行了嘗試[5-6]。前期，課題組已研發(fā)出治療犬瘟熱的中藥膠囊，且進(jìn)行了為期一年的臨床效果研究，研究發(fā)現(xiàn)，課題組研發(fā)的中藥膠囊對(duì)犬瘟熱病犬有較好的輔助治療效果。本研究通過(guò)RT-PCR熒光探針技術(shù)對(duì)比檢測(cè)僅用西藥治療和應(yīng)用中藥輔助治療的患病犬的外周血血清中犬瘟熱病毒含量，研究結(jié)果表明中藥輔助治療14d后，中藥輔助治療組陽(yáng)性率比常規(guī)西藥組下降38.71%，這說(shuō)明中藥輔助治療可有效地殺滅患犬體內(nèi)的犬瘟CDV，為前期課題組所研發(fā)的治療犬瘟熱的中藥膠囊的臨床應(yīng)用提供了一定理論依據(jù)，也為犬瘟熱的中藥臨床治療研究提供一定的參考。

（3）犬瘟熱病屬于瘟熱之邪，課題組所研發(fā)的中藥膠囊中含黃芩、大黃、魚(yú)腥草、炙麻黃、杏仁、生石膏、知母、浙貝母、桔梗、柴胡、葶藶等中藥，中醫(yī)理論認(rèn)為黃芩、大黃、魚(yú)腥草、生石膏都性寒，有清熱解毒的作用，主治溫?zé)岵?，中醫(yī)研究表明黃芩、大黃、魚(yú)腥草等都具有抗病毒作用[7-9]，本研究表明黃芩、大黃、魚(yú)腥草等具有抗CDV的作用。

（4）本研究采用先將確診犬瘟熱的186只病犬，分成兩組治療；第一組96只，用常規(guī)西藥治療；第二組90只，在第一組治療的基礎(chǔ)之上，用前期研發(fā)的中藥膠囊進(jìn)行輔助治療。后從中隨機(jī)選取62只（每組各取31只）進(jìn)行RT-PCR熒光探針技術(shù)檢測(cè)治療效果研究，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)上的隨機(jī)原則。

[1] 韓博.犬貓疾病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2011：20-24.

[2] Wall S J，Edward D R.Quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction（TR-PCR）：A comparison of prime-dropping，competitive，and real-time RT-PCR[J].Anal Biochem，2002，300（2）：269-273.

[3] 歐陽(yáng)松應(yīng)，楊冬，歐陽(yáng)紅生，等.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)及其應(yīng)用[J].生命的化學(xué)，2004，24（1）：74-76.

[4] 張賀，李波，周虛，等.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)研究進(jìn)展及應(yīng)用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，（27）：5-12.

[5] 王傳春，沈美艷.中藥治療犬瘟熱的體會(huì)[J].山東畜牧獸醫(yī)，2017，38（6）：97.

[6] 方愛(ài)國(guó)，王和平.中藥清開(kāi)靈注射液對(duì)犬瘟熱的療效觀察[J].養(yǎng)犬，2008，（1）：21.

[7] 熊海蓉，楊占秋.大黃抗炎抗病毒作用的研究[J].醫(yī)學(xué)新知，2014，（3）：159-160.

[8] 王羽儂，金葉智.黃芩及其成分抗流感病毒感染的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，14（27）：5365-5369.

[9] 王健，史玉.魚(yú)腥草不同部位提取物的抗菌抗病毒作用比較[J].河北工程大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，27（2）：104-106.

宜的養(yǎng)殖用地也難以承擔(dān)1.2萬(wàn)元/667m2的土地復(fù)耕保證金。

4.3 政府未設(shè)置畜禽糞污治理專項(xiàng)資金

畜禽養(yǎng)殖污染重在防，防污與未染，這就要求建設(shè)沉淀池、沼氣池、管網(wǎng)等設(shè)施設(shè)備，需要不菲的資金。2014年1月1日頒布的《畜禽規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)污染防治條例》規(guī)定，各級(jí)人民政府應(yīng)采取措施，加大資金投入，扶持畜禽養(yǎng)殖污染防治以及畜禽養(yǎng)殖廢棄物綜合利用；縣級(jí)以上人民政府應(yīng)當(dāng)采取示范獎(jiǎng)勵(lì)等措施，扶持規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化畜禽養(yǎng)殖，支持畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)（小區(qū)）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化改造和污染防治設(shè)施建設(shè)與改造，但目前財(cái)政資金投入嚴(yán)重不足，也未設(shè)置畜禽糞污治理專項(xiàng)資金。如果遵循“誰(shuí)投資誰(shuí)受益”的市場(chǎng)法則，由利潤(rùn)不高的養(yǎng)殖戶來(lái)支付恐無(wú)力承擔(dān)。

5 推進(jìn)生態(tài)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的意見(jiàn)建議

5.1 加大宣傳，共筑生態(tài)健康養(yǎng)殖氛圍

通過(guò)會(huì)議、網(wǎng)絡(luò)、印發(fā)明白紙等多種形式向廣大養(yǎng)殖場(chǎng)戶宣傳生態(tài)健康養(yǎng)殖重要意義，使生態(tài)健康養(yǎng)殖成為養(yǎng)殖場(chǎng)的自覺(jué)行動(dòng)。并利用科技入戶項(xiàng)目將生態(tài)健康養(yǎng)殖新技術(shù)、新模式、新經(jīng)驗(yàn)，面對(duì)面地宣講到場(chǎng)戶，為畜牧生態(tài)健康養(yǎng)殖奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。同時(shí)也讓政府部門(mén)看到生態(tài)養(yǎng)殖的成效，接收生態(tài)養(yǎng)殖無(wú)污染。

5.2 加強(qiáng)政策扶持、強(qiáng)化組織領(lǐng)導(dǎo)

一是統(tǒng)籌安排現(xiàn)有項(xiàng)目，如畜禽標(biāo)準(zhǔn)化示范場(chǎng)創(chuàng)建、特色效益農(nóng)業(yè)切塊資金項(xiàng)目等方面的資金，加大對(duì)生態(tài)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的支持力度。二是創(chuàng)新拓寬融資渠道，采取貸款擔(dān)保、政策保險(xiǎn)、貸款貼息等方式，建立生態(tài)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展投融資和擔(dān)保體系。三是強(qiáng)化科技支撐，培育品牌，加強(qiáng)典型示范，積極引導(dǎo)社會(huì)資本發(fā)展生態(tài)養(yǎng)殖業(yè)。四是強(qiáng)化組織領(lǐng)導(dǎo)，加強(qiáng)公共服務(wù)，構(gòu)建政府主導(dǎo)、多方參與、靈活高效的投入新機(jī)制，推進(jìn)生態(tài)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。五是以獎(jiǎng)代補(bǔ)引導(dǎo)治污，政府可以采取“以獎(jiǎng)代補(bǔ)”等多種形式，扶持養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）更新設(shè)備。

上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研資助項(xiàng)目（KY1-0000-14-07）

張永霞（1977-），女，碩士，副教授，主要從事分子病理檢測(cè)和中藥治療方面的教學(xué)與研究工作。