張嘉妮 李玉星 楊磊 肖子曾 戴冰

摘要：目的 建立HPLC同時測定六味地黃湯及方中山茱萸-牡丹皮藥對莫諾苷、獐芽菜苷、芍藥苷、馬錢苷含量的方法，探討全方與該藥對主要藥效成分之間的關(guān)聯(lián)性。方法 采用Hypersil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動相為甲醇-水（24∶76），流速1.0 mL/min，檢測波長236 nm，柱溫30 ℃。結(jié)果 莫諾苷、獐牙菜苷、芍藥苷和馬錢苷分別在0.480～7.680 ?g（r=0.999 3）、0.103～1.650 ?g（r=0.999 5）、0.120～1.920 ?g（r=0.999 1）、0.227～3.630 ?g（r=0.999 7）范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為102.79%、102.29%、100.99%、102.48%，RSD分別為1.73%、1.48%、1.32%、0.75%。六味地黃湯中莫諾苷、獐芽菜苷、芍藥苷含量略高于山茱萸-牡丹皮藥對，馬錢苷含量基本相同。結(jié)論 本方法簡便可靠、重復(fù)性好，可用于六味地黃湯及山茱萸-牡丹皮藥對苷類成分含量測定。山茱萸-牡丹皮藥對含有六味地黃湯補(bǔ)腎作用的核心苷類成分。

關(guān)鍵詞：六味地黃湯；山茱萸-牡丹皮藥對；莫諾苷；獐芽菜苷；芍藥苷；馬錢苷；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.013

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）11-0057-05

Abstract： Objective To establish an HPLC method for the content determination of morroniside， sweroside， paeoniflorin and loganin of Liuwei Dihuang Decoction and its Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple； To discuss the relationship between the whole prescription and the couple of main pharmacodynamic components. Methods The HPLC method was used at Hypersile C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m）； the mobile phase consisted of methanol-water （24：76）； the detective wavelength was 236 nm； the flow rate was 1.0 mL/min； the column temperature was 30 ℃. Results The linear ranges of morroniside， sweroside， paeoniflorin and loganin were among 0.480–7.680 ?g （r=0.999 3）， 0.103–1.650 ?g （r=0.999 5）， 0.120–1.920 ?g （r=0.999 1） and 0.227–3.630 ?g （r=0.999 7）， respectively. The average recovery rates and RSD were 102.79%， 102.29%， 100.99%， 102.48%， and 1.73%， 1.48%， 1.32%， 0.75%， respectively. The contents of morroniside， sweroside and paeoniflorin in Liuwei Dihuang Decoction were slightly higher than that in Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple， and the contents of loganin were almost the same. Conclusion The method is simple， stable， accurate and reproducible. It can be used for content determinate of glycosides in Liuwei Dihuang Decoction and Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple. Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple has the glycosides with tonifying kidney effect of Liuwei Dihuang Decoction.

Keywords： Liuwei Dihuang Decoction； Cornus Officinalis - Cortex Moutan couple； morroniside； sweroside； paeoniflorin； loganin； HPLC

六味地黃丸由錢乙在《小兒藥證直訣》中首創(chuàng)，是金匱腎氣丸減桂、附而成，由熟地黃、酒萸肉、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓6味藥組成，是滋陰補(bǔ)腎的經(jīng)典方，臨床多用于腎陰虧損、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、盜汗遺精、消渴等[1]。六味地黃湯主要含有莫諾苷、獐牙菜苷、馬錢苷、芍藥苷等苷類成分，熊果酸、沒食子酸等有機(jī)酸類成分，以及丹皮酚等有效成分[2]。根據(jù)六味地黃湯相反相成的組方特點，該方可拆成3組補(bǔ)瀉藥對，即熟地黃-澤瀉、山茱萸-牡丹皮、山藥-茯苓。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯的3組補(bǔ)瀉藥對中，僅山茱萸-牡丹皮藥對可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)下丘腦-垂體-腎上腺軸、下丘腦-垂體-甲狀腺軸和下丘腦-垂體-性腺軸中各激素水平來改善腎陰虛，可能是該方改善腎陰虛的主要藥效組成部分[3-5]，而山茱萸-牡丹皮藥對的主要有效成分及其含量、與六味地黃湯全方比較有何區(qū)別和聯(lián)系，還需進(jìn)一步研究。因此，本研究采用HPLC對六味地黃湯及山茱萸-牡丹皮藥對中的苷類成分進(jìn)行含量測定，建立HPLC同時測定莫諾苷、獐芽菜苷、芍藥苷、馬錢苷含量的方法，并探究全方與該藥對中主要藥效成分之間的關(guān)聯(lián)性，為六味地黃湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和組方原理的研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，安捷倫科技（中國）有限公司；Hypersile ODS2 C18色譜柱，大連依利特分析儀器有限公司）；SK5200H型超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；JY3002型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

莫諾苷對照品（批號140301）、獐牙菜苷對照品（批號111742-200501）、芍藥苷對照品（批號110736- 200731）、馬錢苷對照品（批號111640-201005），中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；重蒸水（實驗室自制）。山藥（批號CS15020203）、熟地黃（批號CS14120109）、茯苓（批號JC15051201）、酒萸肉（批號NG14122602）、牡丹皮（批號NG15030903）、鹽澤瀉（批號SH15040701）飲片，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Hypersil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動相為甲醇-水（24∶76），檢測波長為236 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 ?L[6]。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取莫諾苷、獐牙菜苷、芍藥苷和馬錢苷對照品適量，加甲醇分別制成濃度為960.00 ?g/mL莫諾苷對照品溶液、206.25 ?g/mL獐牙菜苷對照品溶液、240.00 ?g/mL芍藥苷對照品溶液和453.75 ?g/mL馬錢苷對照品溶液。

2.3 供試品溶液1的制備

按六味地黃湯處方中山茱萸-牡丹皮藥對比例（4∶3）稱取酒萸肉12 g、牡丹皮9 g，加6倍量水浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，合并水煎液，濃縮至1.5 g原藥材/mL。再精密量取該水煎液2 mL，加入適量80%甲醇溶液，超聲提?。üβ?00 W，頻率53 kHz）30 min，過濾，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，再用80%甲醇定容至刻度，過0.45 ?m微孔濾膜，取續(xù)濾液，備用。

2.4 供試品溶液2的制備

按六味地黃湯處方稱取熟地黃24 g、酒萸肉12 g、山藥12 g、澤瀉9 g、牡丹皮9 g、茯苓9 g，加6倍量水浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，合并水煎液，濃縮至1.5 g原藥材/mL。再精密量取濃縮液5 mL，按“2.3”項下自“加入適量80%甲醇溶液”起方法制備，即得。

2.5 陰性對照溶液的制備

按六味地黃湯處方稱取除山茱萸-牡丹皮藥對外的其他飲片，加6倍量水浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，合并水煎液，濃縮至1.5 g原藥材/mL。再精密量取濃縮液5 mL，按“2.3”項下自“加入適量80%甲醇溶液”起方法制備，即得。

2.6 專屬性試驗

取莫諾苷、獐牙菜苷、芍藥苷、馬錢苷對照品溶液、供試品溶液1、供試品溶液2和陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1～圖4。

結(jié)果表明，供試品溶液1、2的色譜圖中，在與莫諾苷、獐牙菜苷、芍藥苷和馬錢苷對照品色譜圖相應(yīng)的位置上，有相同保留時間的色譜峰，而陰性對照溶液色譜圖在相對應(yīng)的保留時間處無色譜峰，表明陰性對照無干擾。

2.7 線性關(guān)系考察

精密量取莫諾苷、獐牙菜苷、芍藥苷和馬錢苷對照品溶液各0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL，分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到不同濃度梯度的對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件，分別進(jìn)樣10 ?L，測定峰面積。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。莫諾苷：Y=5.075 1X+113.822 0，r=0.999 3；獐牙菜苷：Y=5.481 9X+42.856 2，r=0.999 5；芍藥苷：Y=7.260 2X+49.248 7，r=0.999 1；馬錢苷：Y=5.761 4X+15.189 2，r=0.999 7。結(jié)果表明，莫諾苷在0.480～7.680 ?g、獐芽菜苷在0.103～1.650 ?g、芍藥苷在0.120～1.920 ?g、馬錢苷在0.227～3.630 ?g范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.8 精密度試驗

精密量取莫諾苷、獐牙菜苷、芍藥苷和馬錢苷對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，各連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算得RSD分別為1.08%、1.19%、1.18%和1.01%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.9 重復(fù)性試驗

取同一批山茱萸-牡丹皮藥對飲片，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，并計算其含量。結(jié)果莫諾苷含量的平均值為0.776%，RSD=1.39%；獐牙菜苷含量的平均值為0.049%，RSD=1.95%；芍藥苷含量的平均值為0.085%，RSD=1.11%；馬錢苷含量的平均值為0.353%，RSD=1.35%。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，在室溫條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定莫諾苷、獐牙菜苷、芍藥苷和馬錢苷的峰面積，計算得RSD分別為1.18%、1.83%、1.14%和0.93%，結(jié)果表明，供試品溶液中莫諾苷、獐牙菜苷、芍藥苷和馬錢苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.11 加樣回收率試驗

取已知莫諾苷、獐牙菜苷、芍藥苷和馬錢苷含量的山茱萸-牡丹皮藥對供試品溶液，共6份，加入等同于供試品溶液中含量的4種對照品，按“2.3”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，計算平均回收率，結(jié)果見表1～表4。

2.12 樣品含量測定

按“2.3”“2.4”項下方法制備山茱萸-牡丹皮藥對及六味地黃湯供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別測定莫諾苷、獐牙菜苷、芍藥苷和馬錢苷的含量，平行測定3次。按原藥材量計算，得山茱萸-牡丹皮藥對中莫諾苷含量為0.780%、獐牙菜苷含量為0.050%、芍藥苷含量為0.097%、馬錢苷含量為0.364%，見表5。按山茱萸-牡丹皮藥對的原藥材量計算，得六味地黃湯中莫諾苷含量為0.897%、獐牙菜苷含量為0.081%、芍藥苷含量為0.104%、馬錢苷含量為0.363%，見表6。

3 討論

本試驗分別對莫諾苷、獐牙菜苷、芍藥苷和馬錢苷對照品溶液進(jìn)行紫外掃描測定，結(jié)果莫諾苷、獐牙菜苷、芍藥苷、馬錢苷分別在242、247、230、236 nm波長處有最大吸收。再分別在這4個波長處對樣品進(jìn)行檢測，選擇基線平穩(wěn)且所含有效組分指紋峰峰數(shù)適中的檢測波長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在236 nm波長條件下，樣品色譜圖基線穩(wěn)定，出峰個數(shù)多且峰型較高，故最終確定檢測波長為236 nm。

在選擇流動相時，參照文獻(xiàn)[7-8]和前期研究中的流動相條件加以調(diào)整、改進(jìn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲醇與水的比例為24∶76時，各色譜峰保留時間適宜，且各成分分離效果較好。雖然莫諾苷、獐牙菜苷、芍藥苷和馬錢苷的出峰時間間隔較短，但山茱萸-牡丹皮藥對和六味地黃湯在該流動相條件下各苷類成分色譜峰的分離度均大于1.5，且陰性對照色譜圖中在與上述各成分相對應(yīng)的保留時間處無干擾，故最終選用甲醇-水（24∶76）作為流動相。

本試驗采用HPLC測定六味地黃湯及山茱萸-牡丹皮藥對中莫諾苷、獐牙菜苷、芍藥苷和馬錢苷含量，該方法簡單、快速、重復(fù)性好，可為六味地黃湯中山茱萸-牡丹皮藥對的質(zhì)量控制提供可靠的檢測手段。

現(xiàn)代研究表明，六味地黃湯中苷類成分對T、B淋巴細(xì)胞有不同程度促增殖作用[9]，對生殖內(nèi)分泌功能紊亂及免疫功能下降具有防治作用[10]，對培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞有促增殖作用[11]，可改善糖尿病腎陰虛證大鼠脂代謝[12]，并可能通過調(diào)節(jié)2型糖尿病大鼠脂肪組織PI3K/Akt信號通路來干預(yù)2型糖尿病胰島素抵抗[13]；還有研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯對氫化可的松致大鼠腎虛模型的保護(hù)作用，其中苷類成分中的獐芽菜苷、馬錢苷、莫諾苷為該方補(bǔ)腎作用的核心成分[14]。2015年版《中華人民共和國藥典》明確規(guī)定，馬錢苷、莫諾苷為六味地黃丸含量測定的指標(biāo)成分[15]，故六味地黃湯中苷類成分是該方補(bǔ)腎藥效評價和質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯中山茱萸-牡丹皮藥對是該方改善腎陰虛證的主要藥效組成部分[3-5]。本研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸-牡丹皮藥對中含有補(bǔ)腎作用的核心苷類成分（莫諾苷0.780%，獐牙菜苷0.050%，芍藥苷0.097%，馬錢苷0.364%）；但與山茱萸-牡丹皮藥對比較，六味地黃湯中莫諾苷、獐芽菜苷、芍藥苷的含量分別為0.897%、0.081%、0.104%，均略有增加，而馬錢苷的含量變化不大（0.363%）。由此表明，六味地黃湯中除山茱萸-牡丹皮藥對外的其他4味飲片，在煎煮過程中可影響該藥對中苷類各成分的煎出量，從而影響六味地黃湯的藥效，這可能是六味地黃湯全方補(bǔ)腎作用優(yōu)于山茱萸-牡丹皮藥對的原因之一。

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