陳靜波+張響英+金彩蓮+李騰騰+沈鳴揚(yáng)+楊二軍+尹最難

摘要： 在豬卵子的體外生產(chǎn)方面，關(guān)于卵子的體外成熟和體外受精技術(shù)目前還存在著不足，特別是豬的受精卵體外生產(chǎn)方面存在復(fù)雜的細(xì)胞質(zhì)成熟、多精子侵入率較高以及前核形成受到抑制等問題。為改善豬卵子體外成熟體系，將轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，簡(jiǎn)稱TGFβ）添加到體外成熟的培養(yǎng)液中，研究TGFβ對(duì)裸卵和卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體成熟率的影響。在沒有添加TGFβ的體外成熟培養(yǎng)液中，裸卵和卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體被成熟培養(yǎng)24 h，結(jié)果沒有卵子達(dá)到M-Ⅱ時(shí)期，但是在添加TGFβ的體外成熟培養(yǎng)液中，觀察到有卵子達(dá)到M-Ⅱ時(shí)期。另一方面，當(dāng)卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體在體外成熟培養(yǎng)時(shí)，將TGFβ添加到不同培養(yǎng)階段（0～24 h或24～48 h）的培養(yǎng)液時(shí)，卵子的成熟率沒有差別。對(duì)裸卵在體外成熟培養(yǎng) 24 h 時(shí)，當(dāng)在前半期添加TGFβ時(shí)（0～24 h），卵子的成熟率為59%；當(dāng)在后半期添加TGFβ時(shí)（24～48 h），卵子的成熟率為57%。同樣在裸卵組中，當(dāng)在全期添加TGFβ時(shí)（0～48 h），卵子的成熟率為27%；當(dāng)無添加TGFβ時(shí)，卵子的成熟率為38%。前2組與后2組相比，卵子成熟率有顯著差異。

關(guān)鍵詞： 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β；體外成熟；體外受精；豬卵子；卵丘卵母細(xì)胞

中圖分類號(hào)： S828.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）22-0176-03

哺乳動(dòng)物卵子的成熟發(fā)生在胎兒時(shí)期并且停止于前I期的雙線期，這個(gè)時(shí)期將一直持續(xù)到排卵前期[1]。在這段休止期卵子是無法完成受精的。卵子具有受精能力是在完成減數(shù)分裂到達(dá)M-Ⅱ時(shí)期，釋放第一極體的時(shí)候。哺乳動(dòng)物卵子的生長(zhǎng)必須要有外圍包裹著的卵丘細(xì)胞才能成熟。卵子在排卵之前都會(huì)保持GV期（germinal vesicle）卵母細(xì)胞狀態(tài)，在促性腺激素的作用下引起生理上的反應(yīng)完成排卵。卵子開始恢復(fù)細(xì)胞核的成熟，主要表現(xiàn)在卵母細(xì)胞發(fā)生生發(fā)泡破裂（germinal vesicle breakdown，簡(jiǎn)稱GVBD）、同源染色體的分離、第一極體的排出。在細(xì)胞質(zhì)成熟過程中，胞漿內(nèi)積累多種蛋白質(zhì)和穩(wěn)定的mRNA，線粒體會(huì)發(fā)生有效重排[2]。到排卵時(shí)，包裹著卵子的卵丘細(xì)胞已經(jīng)完全膨脹，卵子已經(jīng)達(dá)到了 M-Ⅱ 時(shí)期。這是因?yàn)樵诖冱S體生成素（luteinizing hormone，簡(jiǎn)稱LH）的作用下，使卵子恢復(fù)了減數(shù)分裂以及卵丘細(xì)胞的膨脹[3]。然而發(fā)生這些變化的原因也可能是在排卵之前，其他分子參與控制這些機(jī)制作用而導(dǎo)致卵子發(fā)生變化。

最近研究表明，在某些動(dòng)物的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體和由卵泡包裹的卵子中，減數(shù)分裂的恢復(fù)是由表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，簡(jiǎn)稱EGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α（transforming growth factor-α，簡(jiǎn)稱TGFα）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，簡(jiǎn)稱TGFβ）所引起的[4-6]。TGFβ是一種多功能的細(xì)胞活化素并且具有多種形式。它們屬于一個(gè)大的基因家族，在細(xì)胞生長(zhǎng)方面扮演著許多角色，比如分化、遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)的形成、細(xì)胞表面分子表達(dá)的調(diào)節(jié)。對(duì)不同的基因，TGFβ也有許多種類。據(jù)報(bào)道，1985年已經(jīng)克隆出來人類的TGFβ的cDNA序列，現(xiàn)在稱之為TGFβ-1[7]。 1987年從牛骨頭里分離出1種多肽物質(zhì)，能合成膠原蛋白，與TGFβ-1表現(xiàn)出71%的同源性，后來被命名為 TGFβ-2。第3種TGFβ被命名為TGFβ3，與TGFβ-1和TGFβ-2 相比，分別表現(xiàn)出76%和80%的同源性。在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞里3種TGFβ都能得以表達(dá)。TGFβ-1是由390個(gè)氨基酸組成的。實(shí)際上所有的細(xì)胞都具有TGFβ-1接受體，它們能控制細(xì)胞的許多功能。據(jù)報(bào)道有9個(gè)膜蛋白和TGFβ相結(jié)合。

調(diào)解卵子成熟的主要是卵丘細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，卵丘細(xì)胞提供給卵子營(yíng)養(yǎng)和其他物質(zhì)，以及完成相互通信是通過縫隙連接完成的。卵丘細(xì)胞和卵子之間縫隙連接對(duì)于細(xì)胞間的相互作用，特別是對(duì)旁分泌和內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)是非常重要的。因此，本研究主要探討TGFβ對(duì)與體外成熟培養(yǎng)的卵子以及卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體成熟率的影響。

1 材料與方法

1.1 卵子的準(zhǔn)備

豬的卵巢取自江蘇省泰州市城郊屠宰場(chǎng)，放入35～37 ℃的085%生理鹽水中帶回實(shí)驗(yàn)室。試驗(yàn)人員在顯微鏡下用嘴吸住特制吸管，將存在于TALP緩沖液（Tyrodes Albumin Lactate Pyruvate：紅細(xì)胞裂解液，含0.1%的聚乙烯醇）的卵丘卵母細(xì)胞吸出。每15個(gè)卵子放進(jìn)100 μL不含牛血清的NCSU23培養(yǎng)液中。此培養(yǎng)液中含有10%的豬卵泡液、0.6 mmol/L 半胱氨酸、10 IU/mL人體絨毛促性腺激素、10 IU/mL 孕馬血清促性腺激素，培養(yǎng)液小滴被礦物油所覆蓋，在 38.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在第1個(gè)試驗(yàn)中，將不同濃度的TGFβ-1（0、1、5、 10 ng/mL）添加到成熟培養(yǎng)液中，評(píng)定卵丘卵母細(xì)胞的成熟率。

在第2個(gè)試驗(yàn)中，將裸卵和卵丘卵母細(xì)胞保存在含有和不含有TGFβ-1（1 ng/mL）的培養(yǎng)液中24、48 h后，評(píng)定裸卵和卵丘卵母細(xì)胞的成熟率。

在第3個(gè)試驗(yàn)中，將裸卵或卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體培養(yǎng)在含有或者不含有TGFβ-1（1 ng/mL）的培養(yǎng)液中。將 TGFβ-1添加到培養(yǎng)液中的時(shí)間段分別是體外培養(yǎng)0～24 h、24～48 h、0～48 h。

1.3 卵子成熟的評(píng)估

試驗(yàn)最后，用吸管反復(fù)去除卵丘細(xì)胞，把裸卵放在載玻片的中心，蓋上蓋玻片。將載玻片放入25%的醋酸中浸泡2～3 d，加1%的苔紅素染色，浸泡在45%的醋酸中。用酰基甘油除去多余的染料，并放在倒位相位差顯微鏡下，放大200～400倍觀察。endprint

卵子被分為GV期（germinal vesicle）、P-Ⅰ期（prophase- Ⅰ）、M-Ⅰ期（metaphase-Ⅰ）、T-Ⅰ期（telophase-Ⅰ）和M-Ⅱ期（metaphase-Ⅱ）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與分析，應(yīng)用ANOVA作方差分析（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

在第1個(gè)試驗(yàn)中，當(dāng)將卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體培養(yǎng)在添加不同濃度的TGFβ-1培養(yǎng)液時(shí)，卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體到達(dá) M-Ⅱ時(shí)期的比例分別是53%（42/79）、69%（61/88）、64%（57/89）、52%（31/60）（表1）。

為檢測(cè)TGFβ和卵丘細(xì)胞對(duì)卵子體外成熟率的影響，將裸卵和卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體體外成熟培養(yǎng)24 h，在裸卵和卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體中，一組在培養(yǎng)液中添加TGFβ，而另一組不在培養(yǎng)液中添加TGFβ。結(jié)果表明，無論是裸卵還是卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，在培養(yǎng)液中添加TGFβ的組中，卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體和裸卵的成熟率分別是5%、4%，而沒有添加TGFβ的培養(yǎng)液中，卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體和裸卵的成熟率均是0（表2）。

然而在體外成熟培養(yǎng)48 h后，在添加TGFβ、未添加TGFβ組中卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體達(dá)到M-Ⅱ成熟階段的比例分別是70%、52%；裸卵組中的成熟率分別是35%、26%，卵丘卵母細(xì)胞組的成熟率比裸卵組的成熟率有所提高（表3）。

在第3個(gè)試驗(yàn)中，將卵子培養(yǎng)在含有或不含有TGFβ（1 ng/mL）的各個(gè)時(shí)間段培養(yǎng)液中。在卵丘卵母細(xì)胞組中，卵子的成熟率無顯著差異。然而，當(dāng)卵子處于裸卵狀態(tài)時(shí)，與TGFβ暴露在培養(yǎng)液的時(shí)間是0～24 h、24～48 h時(shí)（卵子成熟率為27%），以及在這2個(gè)時(shí)間段中均無添加TGFβ的培養(yǎng)液（卵子的成熟率38%）相比，當(dāng)TGFβ暴露在培養(yǎng)液的時(shí)間分別是0～24 h（卵子成熟率為59%）、24～48 h（卵子成熟率為57%）時(shí)，后2組卵子成熟率有顯著提高（表4）。

3 結(jié)論與討論

卵子為受精做準(zhǔn)備，不僅要發(fā)生減數(shù)分裂而且細(xì)胞質(zhì)也要經(jīng)歷極重要的變化，包括卵子將獲得支持精子染色質(zhì)的去凝縮作用和隨后的雄性前核形成的能力。盡管在體外卵子核的成熟能夠自發(fā)地完成，但是體外成熟的卵子可能缺少使精子去凝縮和雄性前核形成的能力。Yoshida等認(rèn)為卵丘細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)成熟方面扮演了一個(gè)重要的角色[4]。Zheng等認(rèn)為，當(dāng)被卵丘細(xì)胞包裹的卵子在含有卵泡液和卵泡膜細(xì)胞的培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，會(huì)加強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)的成熟[5]。這些結(jié)果表明，卵泡細(xì)胞能通過旁分泌和自分泌來分泌一些能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)成熟的因子。生長(zhǎng)因子類似轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGFβ），已經(jīng)被證實(shí)能夠刺激或加強(qiáng)卵子細(xì)胞核的成熟。最近的研究主要集中在解釋TGFβ-1的信號(hào)傳播途徑方面。據(jù)證明，Type-Ⅰ和Type-Ⅱ受體依靠TGFβ-1形成了1個(gè)異側(cè)的復(fù)合體。TGFβ-1連接Type-I和Type-Ⅱ受體的復(fù)合體觸發(fā)了 Type-Ⅱ組的絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶區(qū)域。這些蛋白激酶的活性是刺激磷脂酸C（phospholipase C，簡(jiǎn)稱PLC）來打斷細(xì)胞膜的纖維醇磷脂從而形成纖維醇三磷酸鹽（inositol phosphate three，簡(jiǎn)稱IP3）[6]。鈣的濃度對(duì)維持抑制哺乳動(dòng)物的卵子減數(shù)分裂具有重要的作用。在小鼠的裸卵及倉(cāng)鼠的裸卵和卵丘卵母細(xì)胞中，細(xì)胞外高濃度的鈣會(huì)使抑制卵子減數(shù)分裂的作用消失。然而卵子減數(shù)分裂的發(fā)展進(jìn)程依靠于細(xì)胞外部鈣的濃度，最近研究表明主要集中在細(xì)胞內(nèi)部鈣的運(yùn)用和減數(shù)分裂的恢復(fù)。表明這種關(guān)系非直接的證據(jù)是運(yùn)用新霉素，一種假定的磷酸肌醇逆轉(zhuǎn)率抑制劑，在豬和牛的卵子中它能阻止卵母細(xì)胞發(fā)生生發(fā)泡破裂。這就意味著纖維醇三磷酸鹽（IP3）可能與引發(fā)減數(shù)分裂恢復(fù)有關(guān)。

本研究探討TGFβ對(duì)卵子和卵丘細(xì)胞成熟的作用效果。然而，將卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體添加到不同濃度的TGFβ-1的培養(yǎng)液時(shí)，卵子的成熟率沒有差別（表1）。在其他研究中表明，TGFβ能刺激大鼠和小鼠的成熟。TGFβ能在結(jié)構(gòu)和功能上調(diào)節(jié)EGF，一種能在體外刺激豬卵母細(xì)胞成熟的激素。

TGFβ能因物種、培養(yǎng)條件以及被評(píng)估的類固醇不同而刺激或者抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)或者分化。TGFβ抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力應(yīng)該與細(xì)胞的分化狀態(tài)有關(guān)。體外培養(yǎng)4 d后，牛卵丘細(xì)胞在細(xì)胞周期功能上的分化、形態(tài)上的改變以及生成類固醇應(yīng)答等方面的弱化，可能反映出牛卵丘細(xì)胞上TGFβ受體缺乏或者其對(duì)TGFβ敏感性的減弱。

結(jié)果表明，TGFβ不會(huì)影響體外成熟培養(yǎng)24 h的裸卵和卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的成熟率（表2）。然而，當(dāng)體外培養(yǎng) 24 h 后，TGFβ對(duì)裸卵和卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體恢復(fù)減數(shù)分裂具有一種有效的刺激作用。相反，繆勒管抑制物質(zhì)能關(guān)閉對(duì)于TGFβ的同源性，抑制大鼠卵子的自然成熟。盡管TGFβ單獨(dú)對(duì)于大鼠的自發(fā)卵子成熟沒有作用，但是它能在體外抑制LH引導(dǎo)的卵子成熟。

卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體是由卵丘細(xì)胞和卵子構(gòu)成的，二者之間在形態(tài)和功能上的連接是通過異種間的縫隙連接完成的。據(jù)報(bào)道，卵丘細(xì)胞和卵子之間通過縫隙連接進(jìn)行雙向的信息交換。對(duì)于縫隙連接關(guān)于減數(shù)分裂成熟的關(guān)系有2種解釋。第1種理論認(rèn)為，縫隙連接作為一種媒介可以從卵丘細(xì)胞傳送抑制物質(zhì)給卵子。第2種理論認(rèn)為，由于激素的作用會(huì)對(duì)卵丘細(xì)胞產(chǎn)生刺激，這種刺激又是通過縫隙連接傳給卵子而刺激其成熟。由于TGFβ不能直接支持裸卵或者卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的自發(fā)成熟，這一結(jié)果似乎更接近于第2種理論假設(shè)。

本研究結(jié)果表明，當(dāng)將TGFβ添加到培養(yǎng)液的不同階段時(shí)，TGFβ能促進(jìn)體外成熟培養(yǎng)時(shí)豬裸卵的成熟（表4）。由于TGFβ和卵丘細(xì)胞間的相互作用，TGFβ在豬卵子體外成熟培養(yǎng)時(shí)需要24 h，免疫組織化學(xué)的研究表明，TGFβ存在于大鼠和牛的莢膜細(xì)胞、細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞中以及大鼠排卵之前的卵泡中。

綜上所述，TGFβ能刺激豬卵子細(xì)胞核的成熟。這些結(jié)果意味著對(duì)體外成熟的豬卵子，卵丘細(xì)胞是關(guān)鍵的，但是TGFβ能促進(jìn)裸卵的成熟。endprint

本研究主要探討TGFβ和卵丘細(xì)胞對(duì)豬卵子體外成熟的影響。將卵母細(xì)胞放在不同濃度的TGFβ培養(yǎng)液中體外成熟培養(yǎng)時(shí)，不同濃度的TGFβ對(duì)卵子的成熟率沒有差異。當(dāng)體外成熟培養(yǎng)24 h后，在添加TGFβ的培養(yǎng)液中，裸卵發(fā)展到 M-Ⅱ階段。在添加TGFβ組中，裸卵和卵丘卵母復(fù)合體中，體外成熟培養(yǎng)48 h后，卵子的成熟率分別為35%、70%；在不添加TGFβ組中，裸卵和卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的成熟率分別是26%、52%。當(dāng)將TGFβ添加到不同培養(yǎng)階段的培養(yǎng)液中體外成熟培養(yǎng)時(shí)，卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的成熟率在添加TGFβ不同階段時(shí)，成熟率達(dá)到了54%～71%。在裸卵組中，當(dāng)添加TGFβ在0～24 h時(shí)，卵子的成熟率為59%，當(dāng)添加TGFβ在24～48 h時(shí)，卵子的成熟率是57%。在裸卵中，0～48 h階段均未添加TGFβ，裸卵的成熟率為38%，可見，添加TGFβ組的裸卵的成熟率（57%和59%）與0～48 h階段均未添加TGFβ的組（38%）相比，差異顯著?？傊?，TGFβ能促進(jìn)豬卵子細(xì)胞核的成熟，卵丘細(xì)胞對(duì)卵子成熟起到關(guān)鍵作用，同時(shí)TGFβ能促進(jìn)裸卵的成熟。

參考文獻(xiàn)：

[1] Knobil E，Neill J D. The Physiology of Reproduction[M]//Wassarman P M. The mammalian ovum. New York：Ravan Press，69-102.

[2]張 莉. 豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)及孤雌發(fā)育研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2005.

[3]Tsafriri A，Dekel N，Bar-Ami S. The role of oocyte maturation inhibitor in follicular regulation of oocyte maturation[J]. Journal of Reproduction and Fertility，1982，64（2）：541-551.

[4]Yoshida M，Ishizaki Y，Kawagishi H，et al. Effects of pig follicular fluid on maturation of pig oocytes in vitro and on their subsequent fertilizing and developmental capacity in vitro[J]. Journal of Reproduction and Fertility，1992，95（2）：481-488.

[5]Zheng Y S，Sirard M A. The effect of sera，bovine serum albumin and follicular cells on in vitro maturation and fertilization of porcine oocytes[J]. Theriogenology，1992，37（4）：779-790.

[6]Okragly A，Balwit J M，Haak-Frendscho M，et al. Transforming growth factor β-1（TGF-β-1）：a biological prardox[J]. Promega Notes Magazine，1994（10）：1-7.

[7]徐夢(mèng)思，黃 濤，馬 亮，等. 豬TGFβ1和TGFβRⅠ 基因多態(tài)性與產(chǎn)活仔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：38-41.endprint