黃艷艷+李悅+張琳+馬鑫鑫+許傳田+張秀美+劉思當(dāng)+吳家強(qiáng)

摘要：為了研究聚肌胞是否能夠增強(qiáng)油乳劑滅活疫苗免疫后雞群的體液免疫應(yīng)答，將3個(gè)不同來源的聚肌胞產(chǎn)品與H5亞型禽流感病毒滅活抗原相混合，使用輕質(zhì)礦物油乳化制備疫苗，分別免疫21日齡SPF雞，同時(shí)設(shè)置添加抗菌肽的疫苗免疫組、常規(guī)油乳劑疫苗免疫組以及不免疫對照組。在免疫后第14、21、28、35 d分別翅下靜脈采集SPF雞抗凝血，通過血凝抑制試驗(yàn)檢測雞血清中禽流感抗體的水平，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評價(jià)疫苗中添加聚肌胞對雞群體液免疫反應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加了聚肌胞或抗菌肽的疫苗免疫后，雞血清中禽流感抗體水平顯著高于普通油苗組。另外，不同來源的聚肌胞產(chǎn)品（PIC-1、PIC-2和PIC-3）免疫增強(qiáng)作用存在差異，以PIC-1免疫增強(qiáng)效果最好。在PIC-1疫苗免疫后，雞血清抗體增長快，且可維持較高水平。總之，本研究表明聚肌胞是良好的禽病毒性疫苗免疫增強(qiáng)劑；不同廠家的聚肌胞產(chǎn)品質(zhì)量有差異，應(yīng)擇優(yōu)使用。

關(guān)鍵詞：聚肌胞；免疫增強(qiáng)劑；雞；禽流感；疫苗

中圖分類號：S852.4文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2017）12-0100-04

Abstract To evaluate the efficacy of poly I∶C （PIC） as adjuvant for avian influenza vaccines， three different sources of PIC were mixed with viral antigens of H5 avian influenza virus， and oil emulsion vaccines were developed. Twenty-one-day-old specific-pathogen-free （SPF） chickens were vaccinated with either vaccine. Meanwhile， an unvaccinated chicken group， a cecropin-added oil emulsion vaccine group and a common oil emulsion vaccine （vaccine control） group were set. Chicken blood was collected on the 14th， 21st， 28th and 35th day after vaccination to test serum antibody levels against avian influenza by hemagglutination inhibition assay. Statistic analysis showed that chickens vaccinated with PICs or cecropin adjuvant developed significantly higher antibody level compared to the vaccine control group. Further， PIC of different sources （PIC-1， PIC-2 and PIC-3） showed varied immune-enhancing effects and that of PIC-1 was the best. After vaccinated with PIC-1， the serum antibody of chickens increased fast and could maintain at higher level. In conclusion， PIC is a better promising adjuvant for chicken viral vaccine， and its efficacy may vary due to the sources.

Keywords Poly I∶C；Immunopotentiator； Chicken； Avian influenza； Vaccine

禽流感是危害我國養(yǎng)禽業(yè)的一類重要傳染病，我國采取滅活疫苗免疫和撲殺相結(jié)合的措施應(yīng)對高致病性禽流感在家禽中的傳染[1]。疫苗的普遍采用極大程度上降低了禽流感易感家禽的比例，對禽流感的防控起到了積極作用。油乳劑滅活疫苗與活疫苗相比，免疫保護(hù)產(chǎn)生得慢，因此生產(chǎn)上迫切需要改進(jìn)型的禽流感滅活疫苗，以縮短疫苗免疫后的保護(hù)空白期，提高疫苗對雞群的保護(hù)效率。新型免疫增強(qiáng)劑如干擾素、白介素、細(xì)胞模式識別受體激動劑等可有效增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞/體液免疫應(yīng)答，縮短疫苗使用后的免疫保護(hù)空白期，因此成為近年來的研究熱點(diǎn)[2，3]。

聚肌胞（poly I∶C， PIC）是人工合成的病毒雙鏈RNA（double-stranded RNA， dsRNA）類似物，可替代病毒dsRNA用作Toll樣受體3（TLR3）和維甲酸誘導(dǎo)基因I受體（RLR）的激動劑[4]，目前已有多個(gè)含PIC的抗病毒和抗腫瘤藥物的報(bào)道[5]。本課題組以雞源細(xì)胞和SPF雞為模型所做的試驗(yàn)表明，PIC轉(zhuǎn)染后可迅速激活細(xì)胞和雞體的固有免疫應(yīng)答，引起細(xì)胞模式識別受體（TLR3和MDA5）和細(xì)胞因子（IFN-β、IFN-γ和IL-6）基因轉(zhuǎn)錄水平的迅速上調(diào)（另文報(bào)道）。此外，有研究表明PIC對獲得性免疫也有顯著增強(qiáng)作用[6]。國內(nèi)也有將PIC用作家禽抗病毒藥物和疫苗佐劑的報(bào)道，但應(yīng)用效果不一[7-11]。本研究中，筆者在禽流感油乳劑滅活疫苗中添加不同來源的聚肌胞，檢測其對雞體液免疫應(yīng)答的影響，為禽流感滅活疫苗的改進(jìn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 免疫增強(qiáng)劑溶液的配制

丁胺卡那霉素耦合聚肌胞PIC-1、PIC-2和PIC-3分別購自國內(nèi)3個(gè)生產(chǎn)廠家，使用pH 7.4 PBS配制2 mg/mL的溶液。作為對照的天蠶素抗菌肽（Cecropin）為中農(nóng)穎泰產(chǎn)品，使用滅菌生理鹽水配制2 mg/mL的溶液。置于-20℃保存?zhèn)溆?。endprint

1.2 病毒、抗原、白油和疫苗配制

H5亞型禽流感油乳劑疫苗（普通油苗）和添加免疫增強(qiáng)劑的禽流感油乳劑疫苗，均在某疫苗公司定制，使用進(jìn)口低粘度白油作為佐劑（法國道達(dá)爾公司產(chǎn)品）。血凝抑制試驗(yàn)（hemagglutinin-inhibitation test， HI）抗原亦由上述疫苗公司提供。添加免疫增強(qiáng)劑的禽流感油乳劑疫苗的制備工藝如下：將聚肌胞或抗菌肽分別與含4%Tween-20的病毒抗原混合作為疫苗水相，白油中加入Span-80作為油相，水相和油相以2∶5的比例混合，乳化制苗。疫苗中PIC的終濃度為170 μg/mL，抗菌肽的終濃度為15 μg/mL。

1.3 SPF雞和采血器材

21日齡SPF白色來航雞，購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF雞研究中心。一次性蝶形采血針和EDTA抗凝真空采血管，為北京美科美加生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 SPF雞免疫試驗(yàn)

試驗(yàn)分為6組（表 1），其中包括普通油苗免疫組1個(gè)、含免疫增強(qiáng)劑油苗免疫組4個(gè)以及健康對照組1個(gè)，每組各10只雞。除健康對照外，其它組別的雞只通過頸部皮下接種相應(yīng)的疫苗（0.3 mL/只）。在免疫后第14、21、28、35 d，分別經(jīng)翅下靜脈采集每只雞的血液并以EDTA抗凝，然后分離血清，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 疫苗免疫后雞血清抗體產(chǎn)生情況分析方法

HI試驗(yàn)檢測雞血清的禽流感病毒抗體效價(jià)，比較不同疫苗免疫后血清抗體產(chǎn)生速度和水平：（1）比較含免疫增強(qiáng)劑油苗和普通油苗免疫后的抗體情況，評價(jià)疫苗中添加免疫增強(qiáng)劑對雞體液免疫的作用；（2）比較含不同免疫增強(qiáng)劑的疫苗免疫后的抗體情況，評價(jià)不同免疫增強(qiáng)劑對雞體液免疫的作用。使用t檢驗(yàn)（Students t-test，Microsoft Excel 2007）的單因子方差分析對各試驗(yàn)組抗體水平進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異非常顯著，P<0.001為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)期間雞群狀況和雞血清抗體檢測結(jié)果

試驗(yàn)期間，所有雞只采食、飲水正常，疫苗免疫后雞群未見有不良反應(yīng)。健康對照組的雞只在4次抗體檢測中均未測到禽流感HI抗體，而各免疫組血清抗體水平隨著時(shí)間推移逐漸增高（表1）。

2.2 禽流感抗體水平差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

表2為單因子方差分析疫苗中添加免疫增強(qiáng)劑的作用結(jié)果，表明在免疫后第14 d，PIC-1和PIC-3組抗體水平顯著或非常顯著高于普通油苗對照組；在免疫后第21 d，添加了聚肌胞的各免疫組血清抗體水平顯著或極顯著高于普通油苗組；在免疫后第28 d，PIC-1疫苗組的血清抗體水平非常顯著高于普通油苗組（P<0.01）；在免疫后第35 d，PIC-1和PIC-2免疫組的血清抗體水平顯著或非常顯著高于普通油苗組。

不同免疫增強(qiáng)劑組間，在4次檢測中PIC-1免疫組HI抗體水平有1～2次顯著高于其它免疫增強(qiáng)劑組；而PIC-2、PIC-3和天蠶抗菌肽組之間的血清抗體水平無顯著差異（P>0.05）。

3 討論與結(jié)論

本研究將含有聚肌胞或抗菌肽的H5亞型禽流感油乳劑滅活疫苗免疫SPF雞，檢測了免疫后5周內(nèi)禽流感血清抗體的產(chǎn)生情況。研究發(fā)現(xiàn)，在疫苗水相中添加免疫增強(qiáng)劑能夠顯著增強(qiáng)疫苗免疫后雞抗體應(yīng)答水平，聚肌胞相比抗菌肽對雞體液免疫的刺激作用更強(qiáng)。

聚肌胞已被證實(shí)具有良好的細(xì)胞免疫刺激作用[4，12]。由于抗體監(jiān)測是臨床上評價(jià)禽流感疫苗免疫效果的主要手段，本研究從體液免疫的角度著手，測定和分析了添加聚肌胞是否會增強(qiáng)禽流感油乳劑疫苗的體液免疫效果。為避免聚肌胞產(chǎn)品差異對試驗(yàn)結(jié)果的影響，研究選取了3個(gè)不同廠家的聚肌胞進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，3個(gè)聚肌胞產(chǎn)品對禽流感油乳劑疫苗的免疫增強(qiáng)作用的確有差異：其中PIC-1疫苗組在全部4次采樣檢測時(shí)的抗體水平與普通油苗組均有顯著差異，表明PIC-1的體液免疫增強(qiáng)效果優(yōu)于其它2個(gè)PIC產(chǎn)品。

總之，本研究表明聚肌胞可促進(jìn)禽流感油乳劑疫苗免疫后雞體的體液免疫應(yīng)答，疫苗生產(chǎn)實(shí)踐中需甄別PIC產(chǎn)品質(zhì)量，擇優(yōu)使用。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Chen H， Bu Z. Development and application of avian influenza vaccines in China[J]. Curr. Top. Microbiol. Immunol.， 2009， 333：153-162.

[2] Huo S， Zuo Y， Li N， et al.Chicken IL-7 as a potent adjuvant enhances IBDV VP2 DNA vaccine immunogenicity and protective efficacy[J]. Vet. Microbiol.， 2016， 193：145-155.

[3] Taha-Abdelaziz K， Alkie T N， Hodgins D C， et al. Characterization of host responses induced by Toll-like receptor ligands in chicken cecal tonsil cells[J]. Vet. Immunol. Immunopathol.， 2016， 174：19-25.

[4] Burke M L， Veer D M， Pleasance J， et al. Innate immune pathways in afferent lymph following vaccination with poly（I∶C）-containing liposomes[J]. Innate. Immun.， 2013， 20（5）：501-510.endprint

[5] Nagato T， Celis E. A novel combinatorial cancer immunotherapy： poly-IC and blockade of the PD-1/PD-L1 pathway[J]. Oncoimmunology， 2014， 3：e28440.

[6] Kang X， Chen J， Qin Q， et al. Isatis tinctoria L. combined with co-stimulatory molecules blockade prolongs survival of cardiac allografts in alloantigen-primed mice[J]. Transpl. Immunol.， 2010， 23（1-2）：34-39.

[7] 呂英軍，倪嘉寧，鮑恩東. 聚肌胞誘導(dǎo)雞胚成纖維細(xì)胞和雞胚及肉雞抵抗新城疫病毒感染的研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 32（2）：97-101.

[8] 盧宇，呂芳，張娣，等. TLR3激動劑對雞IBDV活疫苗免疫的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 41（7）：205-207.

[9] 唐應(yīng)華，陸吉虎，吳培培，等. 免疫增強(qiáng)劑提高禽流感疫苗效力的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2014， 30（2）：344-348.

[10]王磊，許巧麗，俞吉杰，等. 聚肌胞不同給藥方式對雞α干擾素誘生作用的研究[J]. 中國免疫學(xué)雜志， 2008， 24（5）：407-408.

[11]李鳳艷，葛銘，董新榮，等. 聚肌胞注射液對雞新城疫感染的保護(hù)率試驗(yàn)[J]. 甘肅畜牧獸醫(yī)， 2007， 37（1）：17-19.

[12]Marketion W J I，Corry J. Poly I∶C and respiratory syncytial virus （RSV） inhibit glucocorticoid receptor （GR）-mediated transactivation in lung epithelial， but not monocytic， cell lines[J]. Virus Res.，2013，176（1/2）：303-306.endprint