張亮+王基隆+丁家波+解曉莉+劉來興+谷祖燁+楊美+楊宏軍

摘要：布魯氏菌病是一種世界范圍內廣泛分布的嚴重人畜共患病。疫苗免疫和血清學診斷是有效控制和凈化該病的兩種重要措施，但疫苗免疫對血清學診斷存在較大影響。因此，弄清楚不同疫苗免疫在不同檢測方法下的抗體消減規(guī)律顯得尤為重要。本研究選取15頭6月齡健康母牛，隨機分為5個試驗組，每組3頭，分別為600億單位A19疫苗注射組、600億單位A19疫苗口服組、500億單位S2疫苗口服組、500億單位S2疫苗注射組和對照組。對不同組試驗牛進行隔離飼養(yǎng)，免疫完成后進行一次帶牛環(huán)境消毒。免疫完成后每月采集牛血制備血清保存，連續(xù)采集6個月，分別使用RBPT（虎紅平板凝集實驗）、iELISA、cELISA進行檢測。結果表明，相比口服免疫方式，注射免疫方式的疫苗抗體峰值水平更高，抗體持續(xù)時間更長；注射免疫方式下，S2疫苗的抗體峰值水平高于A19苗，但抗體持續(xù)時間較短；口服免疫A19疫苗，6個月內三種方法均未檢測到抗體?？梢?，疫苗免疫對布魯氏菌病血清學診斷有明顯的干擾作用，但對cELISA檢測的影響時間較短，采用cELISA可有效區(qū)分疫苗免疫和野毒感染。針對不同免疫方式的不同疫苗，應選擇合適的時間節(jié)點。

關鍵詞：布魯氏菌??； 疫苗； 抗體消長規(guī)律；檢測方法

中圖分類號：S852.5文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）12-0126-04

Abstract Brucellosis is a serious zoonosis that occurs in worldwide. Vaccine and sero-detection are two effective and common methods for its control in dairy herds. However， its sero-diagnosis is interfered by vaccine immunization， so it is important to know the dynamic changes of antibodies after being immunized with different vaccines based on various detection methods. Fifteen six-month-old healthy cows were randomly divided into five groups on average. Four treatment groups were inoculated by injection and oral immunization of 6×1010 unit A19 vaccine and 5×1010 unit S2 vaccine， respectively. Every group was separately kept after vaccination and environmental disinfection. The serum samples were monthly collected in six months and detected by RBPT， iELISA and cELISA. The results showed that the injected groups had a higher antibody peak level and longer antibody duration time compared with oral groups， and the S2 groups had a higher antibody peak level and shorter antibody duration time than A19 groups. No antibody was detected for A19 oral group by three methods in six months. All the results showed that vaccine immunization had obvious interference effect on sero-diagnosis. But the influencing time on cELISA was short， thus the vaccine immunization and wild strain infection could be effectively distinguished by cELISA. For different vaccines with different modes of immunization， the appropriate time node should be selected.

Keywords Brucellosis； Vaccines； Dynamical changes of antibody； Detection method

布魯氏菌?。╞rucellosis）是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種以流產和發(fā)熱為特征的人獸共患傳染病，對人類健康和公共衛(wèi)生構成了巨大威脅。布魯氏菌病患者會出現(xiàn)骶髂關節(jié)炎及其它骨關節(jié)受損傷的痕跡，同時對生殖能力具有嚴重損害，家畜中，牛、羊、豬最常發(fā)生。布魯氏菌可以寄生在乳腺和淋巴結內，病原體被不斷地分泌到乳中，感染布魯氏菌病的動物最常出現(xiàn)的臨床癥狀是流產、死胎、早產或者弱胎，產奶量下降。動物感染布魯氏菌病主要是通過接觸感染、垂直傳播、配種或呼吸道感染。布魯氏菌具有胞內寄生的特性，因此被感染的人或動物一般需要接受長時間的抗生素治療，而往往會留下嚴重的后遺癥。目前，布魯氏菌病并無治療特效藥，牧場對其清除多采用陽性檢出淘汰配合疫苗免疫防護為主。疫苗預防接種是控制該病的良好手段，目前美洲國家使用的是用粗糙型布魯氏菌RB51 制備的弱毒疫苗，該疫苗免疫動物后可以與自然感染的強毒相區(qū)分。目前，國內用于奶牛布魯氏菌病防控的疫苗主要為S2株和A19株弱毒疫苗，兩種疫苗適用的宿主廣泛，毒力弱，免疫效果優(yōu)良，前者免疫方法多以口服為主，后者采用注射免疫。臨床上，疫苗免疫和血清學診斷是有效控制和凈化該病的兩種重要措施，但疫苗免疫對血清學診斷存在較大影響。另外，不同疫苗通過不同途徑免疫，其抗體水平和保護率存在顯著差異。因此，弄清楚不同疫苗免疫在不同檢測方法下的抗體消減規(guī)律，將有助于科學選擇合適的疫苗、正確的免疫方式和合理的檢測方法，對我國布魯氏菌病的防控與凈化具有至關重要的作用。endprint

1 材料與方法

1.1 試驗材料

6月齡育成母牛15頭；虎紅平板凝集抗原，購自中國獸醫(yī)監(jiān)察所；布魯氏菌競爭酶聯(lián)免疫吸附實驗（cELISA）抗體檢測試劑盒，牛布魯氏菌間接酶聯(lián)免疫吸附實驗（iELISA）抗體檢測試劑盒，購自瑞典SVANOVIR公司；牛布魯氏菌S2疫苗，購自金宇保靈生物藥品有限公司（20頭份/瓶）；牛布魯氏菌A19疫苗，購自中牧實業(yè)股份有限公司（20頭份/瓶）。

1.2 試驗方法

將15頭試驗奶牛平均分為5組，每組3頭，分別為A19注射600億單位組、A19口服600億單位組、S2口服500億單位組、S2注射500億單位組和對照組，免疫劑量參照疫苗使用說明書。對不同組試驗牛進行隔離飼養(yǎng)，注射前采血檢測全部為布病陰性，免疫完成后進行一次帶牛環(huán)境消毒。免疫完成后每月采集牛血制備血清保存，連續(xù)采集6個月，分別使用RBPT（虎紅平板凝集實驗）、iELISA、cELISA進行檢測。

1.2.1 RBPT 將采集的血清用生理鹽水進行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)分別為20、21、22、23、24、25、26、27，分別取每個濃度的血清50 μL滴在干凈的玻璃板上，滴加等量虎紅平板凝集抗體晃動玻璃板，使抗原和血清充分混勻，4 min內觀察結果。結果判定：凡是出現(xiàn)凝集者記為陽性，記錄出現(xiàn)凝集的最大稀釋倍數(shù)，陰性記作-1。

1.2.2 間接ELISA檢測方法 按照iELISA檢測試劑盒說明書進行檢測，計算陽性百分率（PP），大于40記為陽性。

PP=檢測樣本或陰性對照OD值/陽性對照OD值×100

1.2.3 競爭ELISA檢測方法 按照cELISA試劑盒說明書進行檢測，計算PI值，大于20的記為陽性。

PI=100-Mean ODsamples/ctrl×100/ Mean ODconjugate control Cc

2 結果與分析

2.1 虎紅平板凝集試驗結果

虎紅平板凝集結果（圖1）顯示，除A19疫苗口服組外，其它試驗組在免疫1個月后，虎紅抗體達到峰值，抗體水平隨時間推移而降低。布魯氏菌A19疫苗通過口服方式免疫牛只后，并不引起機體產生凝集抗體，這表明A19疫苗不能通過口服方式進行免疫。 A19疫苗與S2疫苗注射6個月后檢測仍為陽性，S2疫苗口服3個月虎紅檢測轉陰，這表明S2疫苗口服免疫對臨床常規(guī)血清學檢測的干擾較小。

2.2 間接ELISA檢測結果

間接ELISA檢測結果（圖2）顯示，除A19口服組外，其他試驗組在免疫后2個月，抗體水平達到最大值，隨后抗體水平隨時間推移而降低，其中S2口服組在免疫后第6個月，判定值接近臨界值。

2.3 競爭ELISA檢測結果

競爭ELISA檢測結果（圖3）顯示，A19注射組和S2注射組分別在免疫3個月后和免疫2個月后cELISA檢測結果轉陰，而S2口服組cELISA檢測未出現(xiàn)陽性。

3 討論與結論

本研究結果表明，免疫1個月后，A19疫苗注射組、S2疫苗注射組和S2疫苗口服組抗體水平都能達到峰值，之后抗體會隨時間的推移逐漸回落。采用三種檢測方法檢測兩種疫苗免疫1個月后的血清均顯示陽性，這時采用血清學診斷無法區(qū)分疫苗免疫和野毒感染，但干擾持續(xù)時間存在明顯差異。本試驗條件下疫苗免疫對cELISA檢測持續(xù)時間僅為3個月，而對虎紅平板凝集試驗和iELISA檢測的干擾將持續(xù)至6個月以上。造成差異的主要原因是不同檢測方法的診斷原理不同，虎紅平板凝集試驗檢測布魯氏菌凝集反應抗體水平，iELISA檢測布魯氏菌脂多糖（LPS）抗體水平，這兩種檢測方法所檢測的抗體為布魯氏菌的普遍性抗體，在疫苗株和野毒株之間無明顯差異；cELISA檢測則是基于粗糙型和光滑型兩類布魯氏菌的差異位點抗體（LPS的O鏈抗體），而大多數(shù)疫苗株為粗糙型，野毒株為光滑型，這預示著cELISA可用于育成牛疫苗免疫后的布魯氏菌感染診斷。

從抗體水平情況來看，S2疫苗注射組虎紅和iELISA檢測抗體水平最高，A19疫苗注射組其次，S2疫苗口服組最低，這表明注射免疫方式能夠更好地激發(fā)體液免疫。另外，A19疫苗口服組的試驗數(shù)據(jù)顯示，三種檢測方法的結果都呈現(xiàn)陰性，說明口服A19疫苗不能有效引起免疫應答反應，即口服A19疫苗無免疫保護效果。從抗體消長情況來看，后續(xù)監(jiān)測顯示，A19疫苗注射組虎紅和iELISA檢測結果在11個月時全部轉陰，S2疫苗注射組在7個月時全部轉陰，這表明A19疫苗的抗體持續(xù)時間要遠長于S2疫苗，佐證了A19疫苗保護期長于S2疫苗的事實。

總之，注射法比口服法在操作上比較方便（本試驗口服法用去針頭注射器直接注入口內），且不同牛間效果差異小，抗體水平較高，抗體維持時間長，為首選免疫方式。A19疫苗與S2疫苗在毒力和適用對象上有所區(qū)別，A19疫苗毒力較強，多用于3月以上的育成牛使用，不能用于孕牛；S2疫苗毒力較小，多用于成牛使用，口服對孕牛安全。S2疫苗在抗體水平上要高于A19疫苗，但在保護時間上次于A19疫苗，故在免疫時應根據(jù)牛群的差異有選擇性地使用。依據(jù)本試驗數(shù)據(jù)，建議有布魯氏菌免疫需求的牧場，可采取犢牛3～6月齡A19疫苗首次免疫，9～12月齡A19疫苗加強免疫一次，成年牛采用S2口服免疫。

本試驗受試驗場地和牛只結構單一的影響，不能完全代表牛群疫苗免疫后的全部情況。然而，本研究從實驗的角度上分析了兩種疫苗不同免疫方式對布魯氏菌血清學檢測的影響，對牛場布病監(jiān)測和疫苗免疫方案的制定具有指導意義，可使牧場更準確地掌握自身實際情況，制定針對性的合理防控方案。

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