童軍衛(wèi) 劉補(bǔ)興 胡小銘 李 燁 劉正敏 蔡清風(fēng)△

［1.浙江省臺州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）恩澤醫(yī)院，浙江 臺州 318050；2.浙江省臺州醫(yī)院，浙江臺州 317000］

腦外傷（TBI）屬于神經(jīng)外科疾病，其致死致殘率占全身創(chuàng)傷的首位［1］。TBI常見的治療方法是開顱手術(shù)治療，術(shù)后的會引發(fā)顱內(nèi)感染，因此探尋降低顱內(nèi)感染的藥物成為研究的重點(diǎn)［2］。燈盞花素具有擴(kuò)張腦血管、降低腦血管阻力、增加腦血流量、改善微循環(huán)、抗血小板聚集等作用［3］。近年來，不少學(xué)者將燈盞花素應(yīng)用于TBI的治療中，研究表明，燈盞花素可以提高重度腦損傷患者生活質(zhì)量，減少并發(fā)癥和后遺癥的發(fā)生［4］。然而燈盞花素對TBI大鼠神經(jīng)元自噬和炎癥損傷的影響及其分子機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究通過建立TBI大鼠模型，探究燈盞花素對神經(jīng)元自噬和炎癥損傷的影響及其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD雄性大鼠70只，SPF級，8～10周齡，體質(zhì)量（150±20）g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，許可證號：SYXK（京）2015-0037。

1.2 試藥與儀器 燈盞花素（國藥準(zhǔn)字Z20053907，昆明龍津藥業(yè)股份有限公司，批號20160604，規(guī)格20 mg/支）；米諾環(huán)素（批號0209833，日本昭和發(fā)酵工業(yè)株式會社）；RNA提取和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶購自NEB公司；兔抗大鼠Beclin1多克隆抗、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和TNF-αELISA試劑盒購自上海賽默科技生物發(fā)展有限公司；引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 分組與造模 將造模成功的大鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，分別命名為為模型組、米諾環(huán)素組（45mg/kg）、燈盞花素低劑量組 （0.1 mg/kg）、燈盞花素中劑量組（0.5 mg/kg）、燈盞花素高劑量組（1 mg/kg），假手術(shù)組及模型組注射等量容積0.9%氯化鈉注射液，持續(xù)治療2周。腦外傷動物模型建立：依據(jù)文獻(xiàn)［5］，將大鼠腹腔注射4%水合氯醛進(jìn)行麻醉，剪毛消毒后將大鼠固定，于頭皮正中切開，剝離右側(cè)顱頂骨膜，用顱骨鉆刺1個(gè)4mm的骨窗，剝開硬腦膜，在腦表面放置1枚墊片，從20 cm高度落下40 g的祛碼撞擊墊片，建立腦外傷模型；假手術(shù)組僅切開頭皮、左頂部開骨窗，不致腦外傷，模型組和假手術(shù)組均用牙科水泥固定骨孔處，縫合頭皮，然后將大鼠收回飼養(yǎng)。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 大腦皮層組織分離：持續(xù)治療2周后，將大鼠麻醉，消毒后用剪刀剪開頭皮及顱骨，取出全腦，用10%甲醛溶液室溫下固定24 h，然后去除腦膜及血管，從中分離大腦皮層組織，置于-80℃冰箱，備用。1）甲苯胺藍(lán)染色檢測皮質(zhì)神經(jīng)元存活率：在冰凍切片機(jī)將大腦皮層組織切成8μm的薄片，室溫干燥后，用PBS漂洗，干燥后用1%甲苯胺藍(lán)染色20 min，水洗后放入0.5%鹽酸乙醇溶液中分化，經(jīng)梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明（25min），以中性樹膠封片。計(jì)錄存活神經(jīng)元數(shù)量，計(jì)算皮質(zhì)神經(jīng)元存活率。2）qRT-PCR檢測Beclin1 mRNA表達(dá)情況：提取大腦皮層組織總RNA，并將其反轉(zhuǎn)成cDNA，引物序列：F：5′-TGGATCTGGACCAGG-3′。R：5′-CAAATAATTAAATC CTTCCACATCT-3′，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行qRTPCR。 反應(yīng)體系：5×緩沖液 10μL，TaqDNA聚合酶1 μL，F(xiàn) 2 μL，R 2 μL，10 mM dNTPmix 1 μL，cDNA 1μL，ddH2O 33μL。 反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性 5 min，95℃變性30 s，59℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)，延伸時(shí)讀取光密度（D）值，計(jì)算Beclin1 mRNA的相對表達(dá)量。3）免疫組化檢測Beclin1蛋白的表達(dá)：制作大腦皮層石蠟切片（不超過5 mm），將組織切片在92～98℃條件下存放20 min，滴加正常山羊血清后，在組織玻片上分別滴加Beclin1一抗，于4℃過夜放置，復(fù)溫后在組織玻片上滴加二抗，顯色后，用蘇木素復(fù)染，觀察Beclin1在大腦皮層組織中的表達(dá)情況。4）ELSA檢測血清中炎癥因子IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)情況：采集各組大鼠眼眶靜脈血，離心分離血清。采用IL-6和TNF-αELISA試劑盒檢測血清中IL-6和TNF-α的表達(dá)情況。5）Western blot檢測TLR4和核因子-κB（NF-κB）表達(dá)情況：取大腦皮層組織，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣體積20μL，電泳結(jié)束后，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜50 min，分別滴加兔抗鼠TLR4和NF-κB多克隆抗體，置于4℃下過夜，滴加二抗37℃放置1 h。加入ECL發(fā)光劑進(jìn)行顯影，利用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。采用Gel-Pro analyzer4軟件對SDSPAGE電泳圖目的條帶進(jìn)行掃描，分析TLR4和NF-κB表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組甲苯胺藍(lán)染色檢測皮質(zhì)神經(jīng)元存活率比較見表1。模型組皮質(zhì)神經(jīng)元存活率顯著低于假手術(shù)組（P＜0.05）；米諾環(huán)素組和燈盞花素組皮質(zhì)神經(jīng)元存活率顯著高于模型組（P＜0.05）；隨燈盞花素劑量增加，皮質(zhì)神經(jīng)元存活率提高，呈劑量依賴性。

表1 各組甲苯胺藍(lán)染色檢測皮質(zhì)神經(jīng)元存活率比較（±s）

表1 各組甲苯胺藍(lán)染色檢測皮質(zhì)神經(jīng)元存活率比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與米諾環(huán)素組比較，#P＜0.05；與燈盞花素低劑量組比較，$P＜0.05；與燈盞花素中劑量組比較，&P＜0.05。

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 10米諾環(huán)素組 10皮質(zhì)神經(jīng)元存活率（%）85.62±6.56 24.36±4.32*42.12±4.78△燈盞花素低劑量組 10 45.38±4.23△燈盞花素中劑量組 10 62.72±5.17△#$燈盞花素高劑量組 10 78.36±5.36△#$&

2.2 各組qRT-PCR檢測Beclin1 mRNA表達(dá)情況比較 見表2。模型組Beclin1mRNA表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）；米諾環(huán)素組和燈盞花素組Beclin1 mRNA表達(dá)水平顯著低于模型組（P＜0.05）；隨燈盞花素劑量增加，Beclin1mRNA表達(dá)水平降低，呈劑量依賴性。

表2 各組qRT-PCR檢測大腦皮層Beclin1mRNA表達(dá)情況比較（±s）

表2 各組qRT-PCR檢測大腦皮層Beclin1mRNA表達(dá)情況比較（±s）

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 10米諾環(huán)素組 10 Beclin1mRNA/GAPDH 0.21±0.02 0.96±0.12*0.78±0.08△燈盞花素低劑量組 10 0.74±0.07△燈盞花素中劑量組 10 0.56±0.05△#$燈盞花素高劑量組 10 0.38±0.04△#$&

2.3 各組免疫組化檢測Beclin1蛋白表達(dá)情況比較見圖1。模型組Beclin1的表達(dá)水平高于假手術(shù)組；米諾環(huán)素組和燈盞花素組Beclin1的表達(dá)水平低于模型組；隨燈盞花素劑量的增加，Beclin1的表達(dá)水平降低，呈劑量依賴性。

圖1 免疫組化檢測大腦皮層Beclin1蛋白的表達(dá)水平（200倍）

2.4 各組ELSA檢測血清中炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)情況比較 見表3。模型組IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）；米諾環(huán)素組和燈盞花素組IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著低于模型組 （P＜0.05）；隨燈盞花素劑量的增加，IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著降低，呈劑量依賴性。

2.5 各組 Western blot檢測大腦皮層 TLR4、NF-κB表達(dá)情況比較 見表4。模型組TLR4和NF-κB表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）；米諾環(huán)素組和燈盞花素組TLR4、NF-κB表達(dá)水平顯著低于模型組 （P＜0.05）； 隨燈盞花素劑量增加，TLR4、NF-κB表達(dá)水平降低，呈劑量依賴性。

表3 各組ELSA檢測血清中炎癥因子IL-6和TNF-α表達(dá)情況比較（μg/L，±s）

表3 各組ELSA檢測血清中炎癥因子IL-6和TNF-α表達(dá)情況比較（μg/L，±s）

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 10米諾環(huán)素組 10燈盞花素低劑量組 10燈盞花素中劑量組 10燈盞花素高劑量組 10 IL-6 TNF-α 0.67±0.14 0.56±0.11 3.18±0.24* 2.98±0.24*2.78±0.17△ 2.72±0.19△2.76±0.17△ 2.71±0.17△1.75±0.14△#$ 1.58±0.14△#$0.97±0.12△#$& 0.83±0.13△#$&

表4 各組Western blot檢測TLR4和NF-κB表達(dá)情況比較（±s）

表4 各組Western blot檢測TLR4和NF-κB表達(dá)情況比較（±s）

組 別 n假手術(shù)組 10模型組 10米諾環(huán)素組 10燈盞花素低劑量組 10燈盞花素中劑量組 10燈盞花素高劑量組 10 IL-6/GAPDH TNF-α/GAPDH 0.62±0.06 0.53±0.04 2.56±0.23* 2.44±0.20*2.16±0.17△ 2.03±0.15△2.14±0.15△ 2.00±0.12△1.62±0.10△#$ 1.48±0.08△#$0.86±0.06△#$& 0.73±0.04△#$&

3 討 論

腦外傷是指腦部因暴力所傷，導(dǎo)致血絡(luò)受損［6］?；诖死碚?，本研究采用祛碼撞擊的方法建立腦外傷大鼠模型，并以此為研究對象探究燈盞花素對腦外傷大鼠神經(jīng)元自的噬影響。研究表明，燈盞花素注射液能夠降低腦外傷患者血液黏度，疏通微循環(huán)［7］。然而燈盞花素對腦外傷大鼠神經(jīng)元自的噬影響尚未見報(bào)道。Beclin1是判斷自噬活性的重要指標(biāo)。Ng G研究表明，Beclin1和Bcl-2共同參與組成Ⅲ型PI3復(fù)合物調(diào)控自噬［8］。張志雄研究表明，下調(diào) Beclin1基因的表達(dá)可以抑制大鼠海馬神經(jīng)元自噬［9］。本研究表明，燈盞花素能夠提高腦外傷大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的存活率，且隨燈盞花素劑量增加，皮質(zhì)神經(jīng)元的存活效率增加；同時(shí)，燈盞花素能夠降低大腦皮層中Beclin1表達(dá)水平，且隨燈盞花素劑量增加，Beclin1的表達(dá)水平顯著降低。

腦外傷出血部位和周圍的炎癥反應(yīng)是引發(fā)腦損傷的重要環(huán)節(jié)［10］，其中參與炎癥反應(yīng)的炎癥因子有IL-6、TNF-α，因此TNF-α和IL-6是評估腦外傷患者炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)［11-12］。有研究表明，腦外傷大鼠大腦組織中TNF-α和IL-6表達(dá)水平顯著升高，下調(diào)TNF-α和IL-6表達(dá)可以減少大鼠組織細(xì)胞的損傷，進(jìn)而發(fā)揮對腦組織的保護(hù)作用［13］。本研究表明，模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組，提示腦外傷會引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)綜合征；燈盞花素組血清中IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著低于模型組，且呈劑量依賴性，提示燈盞花素能減弱腦外傷大鼠的炎癥反應(yīng)。

TLRs能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［14］。 研究表明，IL-6和TNF-α是由TLR4/NF-κB信號通路調(diào)控的，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)TLR4被激活時(shí)，能夠與熱休克蛋白60（HSP 60）結(jié)合，進(jìn)而激活 NF-κB［15］。 汪春研究表明，蛛網(wǎng)膜下腔出血可引發(fā)TLR4和NF-κB上調(diào)表達(dá)，同時(shí)可介導(dǎo)炎癥因子增加［16］。本研究表明，燈盞花素能夠抑制TLR4/NF-κB信號通路中TLR4和NF-κB蛋白的表達(dá)水平，且隨燈盞花素劑量增加，TLR4和NF-κB表達(dá)水平顯著降低，且呈劑量依賴性。

綜上所述，燈盞花素能夠減弱腦外傷大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元自噬和炎癥損傷，推測這一作用是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路來實(shí)現(xiàn)的，為腦外傷靶向藥物的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

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