申麗媛，徐冬梅*，劉瀟涵，楊 玫，文亞玲

(1.重慶市婦幼保健院 婦產(chǎn)科，重慶 400021； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，重慶 400016)

研究論文

長春瑞濱誘導(dǎo)人上皮性卵巢癌細(xì)胞系SKOV3凋亡及降低端粒酶活性

申麗媛1，徐冬梅1*，劉瀟涵2，楊 玫1，文亞玲1

(1.重慶市婦幼保健院 婦產(chǎn)科，重慶 400021； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，重慶 400016)

目的探討長春瑞濱對人上皮性卵巢癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞凋亡、端粒酶活性及亞單位人端粒酶反轉(zhuǎn)酶mRNA(hTERT mRNA)表達(dá)的影響。方法將不同濃度的長春瑞濱作用于SKOV3細(xì)胞后，用CCK- 8法檢測細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞計量術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；端粒重復(fù)序列擴增酶聯(lián)免疫吸附試驗(TRAP-ELISA)檢測端粒酶活性； RT-PCR檢測細(xì)胞中hTERT mRNA表達(dá)。結(jié)果長春瑞濱可抑制SKOV3細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P<0.01)，降低SKOV3細(xì)胞中端粒酶活性及hTERT mRNA的表達(dá)(P<0.01)，且存在濃度-時間依賴關(guān)系。結(jié)論檢測端粒酶的活性及hTERT mRNA表達(dá)，可能有助于判定長春瑞濱誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞凋亡的敏感性。

上皮性卵巢癌；長春瑞濱；凋亡；端粒酶活性

目前，腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和聯(lián)合化療是中晚期卵巢癌的主要治療策略，但因其廣泛的盆腹腔轉(zhuǎn)移，極大降低了手術(shù)的滿意率，因此，發(fā)現(xiàn)有效的化療藥物具有重要意義[1]。長春瑞濱是第3代長春花堿類藥物，在分子水平，它干擾細(xì)胞微管的動態(tài)平衡，與微管蛋白單體結(jié)合，抑制微管的形成，在有絲分裂中期阻斷細(xì)胞活動，進(jìn)而使細(xì)胞停滯在有絲分裂中期或使細(xì)胞死亡，為細(xì)胞周期特異性藥物[2]。

端粒位于真核細(xì)胞染色體的末端，在維持染色體的穩(wěn)定性、完整性和細(xì)胞活性有重要作用。端粒酶是由核苷酸和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，能延長縮短的端粒，從而增強細(xì)胞的增殖能力，hTERT是端粒酶的催化亞基，其表達(dá)情況與端粒酶的活性相關(guān)[3]。近年研究表明，多數(shù)化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與端粒酶的活性有關(guān)[4]，長春瑞濱發(fā)揮抗癌作用的機制與端粒酶活性密切相關(guān)[5]，本實驗觀察長春瑞濱對人上皮性卵巢癌細(xì)胞系SKOV3凋亡的誘導(dǎo)作用及對細(xì)胞端粒酶活性的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵巢癌細(xì)胞系SKOV3(中科院上海細(xì)胞庫)；小牛血清(杭州四季青公司)；長春瑞濱(Pierre Farmos公司)；CCK- 8(上海生物公司)；Annexin V-FITC(凱基公司)；引物由上海生工合成，端粒酶活性檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生公司)；將10 mg長春瑞濱溶于0.9%氯化鈉溶液，配成1 mmol/L液體，使用前稀釋成所需濃度。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理：取對數(shù)增殖期卵巢癌細(xì)胞SKOV3，實驗設(shè)對照組、長春瑞濱組和調(diào)零組。對照組加入20 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，長春瑞濱組加入等體積長春瑞濱藥物，使其濃度為1、5和10 μg/mL，調(diào)零組加入與長春瑞濱組等量的PBS。

1.2.2 CCK- 8法檢測細(xì)胞增殖：以1×104個/ mL細(xì)胞接種于96孔板中，每孔200 μL，各組均設(shè)5個復(fù)孔，分別在24、48及72 h取樣，每孔加入CCK- 8 20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育，2 h后酶標(biāo)儀檢測吸光度(570 nm)，計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率%=[1-(A給藥組-A空白組)/(A陰性對照組-A空白組)]×100%，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞計量術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：以5×105個/mL細(xì)胞接種于24孔板，分別在24、48及72 h用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，依次加入500 μL 結(jié)合緩沖液、5 μL Annexin V/FITC及5 μL PI溶液，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 端粒重復(fù)序列擴增酶聯(lián)免疫吸附試驗(TRAR-ELISA)檢測端粒酶活性：收集各實驗組細(xì)胞，用冷PBS洗滌2次，加入冰冷裂解緩沖液40 μL，4 ℃離心(600 r/min)，收集上清，按試劑盒說明進(jìn)行PCR擴增實驗。分別取陰性、陽性及待測樣本各2.5 μL，加入變性劑10 μL，靜置10 min后加入雜交緩沖液100 μL，吹打均勻，取100 μL混合液至親和素包被的微孔板中，37 ℃中孵育2 h。洗滌3次后加入抗體100 μL，靜置30 min，依次加入TMB顯色液及終止液。酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm和690 nm處的吸光度值，依據(jù)公式：A=A450-A690計算端粒酶活性。

1.2.5 RT-PCR檢測端粒酶hTERT mRNA水平：hTERT mRNA擴增引物序列：上游引物5′-CGGAAG AGTGTCTGGAGCAA-3′，下游引物5′-GGATGAAGCG GAGTCTGGA-3′。GAPDH作為內(nèi)參照：上游引物5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3′，下游引物5′-CCTG GAAGATGGTGATGGGATT-3′。收集各實驗組細(xì)胞，按Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴增條件：94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 長春瑞濱對卵巢癌細(xì)胞SKOV3的抑制作用

長春瑞濱可呈時間及劑量依賴性抑制SKOV3細(xì)胞增殖(圖1)。

圖1 長春瑞濱對卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖抑制的影響Fig 1 Inhibition of SKOV3 by different concentration of vinorelbine

2.2 長春瑞濱對細(xì)胞SKOV3凋亡的影響

長春瑞濱呈時間-濃度依賴性誘導(dǎo)SKOV3凋亡(表1)。

2.3 長春瑞濱對卵巢癌細(xì)胞端粒酶活性的影響

1 μg/mL長春瑞濱作用48和72 h時，端粒酶活性明顯降低(P<0.01)。5和10 μg/mL長春瑞濱作用24、48及72 h后，端粒酶活性相比對照組明顯降低(P<0.01)(表2)。

表1 長春瑞濱對卵巢癌細(xì)胞SKOV3凋亡率的影響

*P<0.01 compared with control.

表2 長春瑞濱對卵巢癌細(xì)胞SKOV3端粒酶活性的影響

*P>0.05，**P<0.01 compared with control.

2.4 長春瑞濱對卵巢癌細(xì)胞hTERT mRNA的影響

長春瑞濱處理的卵巢癌細(xì)胞中hTERT mRNA表達(dá)隨時間延長及濃度升高而降低(圖2，表3)。

表3 長春瑞濱對卵巢癌細(xì)胞SKOV3 hTERTmRNA的影響

*P<0.01 compared with control.

3 討論

端粒酶是一種特殊核糖蛋白復(fù)合體，可將端粒重復(fù)序列整合到染色體末端，具有維持腫瘤細(xì)胞永生化的能力[6]，抑制端粒酶的活性能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而抑制腫瘤形成[7- 8]。因此，研究端粒酶的表達(dá)和活性及其在腫瘤細(xì)胞藥物敏感性中的規(guī)律，為腫瘤的檢測和治療提供了新的臨床思路。長春瑞濱針對復(fù)發(fā)和難治性上皮性卵巢癌有顯著療效[9- 10]。目前與長春瑞濱治療上皮性卵巢癌相關(guān)的基礎(chǔ)研究鮮有報道。

hTERT mRNA是調(diào)控端粒酶活性的關(guān)鍵因子，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[11]。研究表明，hTERT與端粒酶活性具有一致性[12- 13]，本實驗在不同時間用不同濃度的長春瑞濱作用SKOV3細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)長春瑞濱與SKOV3細(xì)胞的凋亡及增殖抑制作用呈時間-濃度效應(yīng)關(guān)系。1 μg/mL長春瑞濱作用24 h即可顯著下調(diào)上皮性卵巢癌細(xì)胞中hTERT mRNA的表達(dá)，然而端粒酶活性未見明顯改變，1 μg/mL長春瑞濱作用48 h才見端粒酶活性的降低，5和10 μg/mL長春瑞濱在各時間點，均可見hTERT mRNA和端粒酶活性的下降，提示hTERT mRNA表達(dá)的改變比端粒酶活性更敏感，更有助于判定長春瑞濱治療上皮性卵巢癌的療效。

M.marker；1.control；2.1 μg/mL vinorelbine；3.5 μg/mL vinorelbine；4.10 μg/mL vinorelbine圖2 1、5和10μg/mL長春瑞濱作用卵巢癌SKOV3細(xì)胞24、48和72 h時hTERT mRNA表達(dá)情況Fig 2 Expression of hTERT mRNA in SKOV3 by different concentration of vinorelbine in different time

端粒酶是目前較廣泛、特異性強的腫瘤標(biāo)志物，其活性與惡性腫瘤的生存預(yù)后顯著相關(guān)，有報道端粒酶可能通過下調(diào)hTERT表達(dá)抑制其活性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]，與本研究結(jié)果相符。研究顯示，hTERT mRNA和端粒酶在SKOV3細(xì)胞株及上皮性卵巢癌患者中顯著高表達(dá)[14]，因此，通過檢測患者病理性滲出物、血液及腫瘤脫落細(xì)胞等臨床標(biāo)本中hTERT mRNA表達(dá)和端粒酶活性，可能有助于上皮性卵巢癌的治療療效監(jiān)測及預(yù)后的判斷，亦可為上皮性卵巢癌的治療提供新的靶點。

綜上所述，長春瑞濱在SKOV3細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡且下調(diào)hTERT的表達(dá)，其作用機制可能是通過下調(diào)hTERT mRNA抑制端粒酶活性，從而促使腫瘤細(xì)胞凋亡。與端粒酶活性相比較，hTERT表達(dá)更靈敏。因此，其可作為長春瑞濱治療上皮性卵巢癌的理想監(jiān)測指標(biāo)，其具體作用機制待進(jìn)一步研究。

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Vinorelbine induces apotosis and decreases telomerase activity in human epithelial ovarian cancer cells line SKOV3

SHEN Li-yuan1, XU Dong-mei1*, LIU Xiao-han2, YANG Mei1, WEN Ya-ling1

(1.Dept. of Gynaecology and Obstetrics，Chongqing Health Cencer for Women and Children, Chongqing 400021;2.the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China)

ObjectiveTo investigate the effect of different concentrations of vinorelbine on apoptosis,telomerase activity and expression of human telomerase-reverse transcriptase gene (hTERT) in human epithelial ovarian cancer cells SKOV3.MethodsOvarian cancer cells SKOV3 were treated with vinorelbine under different concentrations. The cell proliferation was measured by cell counting kit- 8 (CCK- 8) assay, and the cell apoptosis was detected by flow cytometry. The telomerase activity of SKOV3 cells was determined by TRAP-PAGE-silver staining; The mRNA expression of hTERT was performed by RT-PCR assay.ResultsVinorelbine could significantly inhibited the proliferation of SKOV3 cells,induce cell apoptosis(P<0.01)，reduce the telomerase activity and expression of hTERT mRNA(P<0.01), in dependent of a concentration-time manner.ConclusionsThe detection of telomerase activity and the mRNA expression of hTERT might be vital for predicting the prognosis of patients with epithelial ovarian cancer.

epithelial ovarian cancer; vinorelbine; apotosis；telomerase activity

2017- 08- 24

2017- 11- 17

*通信作者(correspondingauthor)：76548265@qq.com

1001-6325(2018)01-0087-04

R711.75

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