郗艷麗 ， 吳啟坤 ， 魏振奇 ， 鄭曉娟 ， 劉正陽 ， 李 澍 ， 王 迪 ， 王舒然

(吉林醫(yī)藥學院公共衛(wèi)生學院 ， 吉林 吉林 132013)

鉛是一種物質(zhì)蓄積性毒物，攝入后會使機體發(fā)生多種生理變化，產(chǎn)生毒性效應(yīng)。鉛的毒性效應(yīng)與其在機體內(nèi)的半衰期較長有關(guān)。當鉛的代謝速度低于吸收速度時，隨著接觸劑量的增加或者接觸時間的延長，機體內(nèi)的鉛水平會不斷增加，達到亞臨床水平就會對機體組織產(chǎn)生不利影響。此外，鉛還是一種多親合性毒物，對全身組織器官有廣泛的親和力，其中神經(jīng)系統(tǒng)最易因鉛暴露損傷。相對于成年人，兒童的神經(jīng)系統(tǒng)對鉛的敏感性更高，會導(dǎo)致兒童出現(xiàn)多動、注意力不集中、記憶力下降、憂郁、煩躁等臨床癥狀，嚴重的還會影響兒童智力的發(fā)育[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，兒童的血鉛水平越高，對智力的影響越大，血鉛水平與智商IQ呈負相關(guān)[3]。鉛會使組織細胞的氧化還原反應(yīng)發(fā)生改變并生成大量的自由基，自由基堆積引起的氧化損傷是鉛導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)中毒的重要作用機制之一[4-5]。齊墩果酸(Oleanolic acid，OA)是木犀科植物女貞子中的有效活性成分，其對DPPH自由基的清除率可達到70.96%，對過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)誘導(dǎo)的人氣道平滑肌細胞株ASMC氧化損傷有保護作用，對氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞株HUVECS氧化損傷也有保護作用[6-8]。齊墩果酸對自由基的清除能力表明其對鉛暴露引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷也會有影響，但關(guān)于這方面的研究未見報道。本文就齊墩果酸對鉛暴露小鼠腦組織中H2O2、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的含量進行分析，同時觀察腦組織中鉛含量，分析齊墩果酸與腦組織鉛含量及氧化應(yīng)激指標之間的關(guān)系，為齊墩果酸對鉛所致神經(jīng)系統(tǒng)毒性影響的機制探討提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 齊墩果酸(西安文竹生物科技有限公司)；醋酸鉛(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司)；硝酸(北京市北辰驊躍化學試劑廠)；氧化鑭(鄭州生?；ぎa(chǎn)品有限公司)；鋅、錳、銅和鎂標準儲備液(天津市光復(fù)精細化工研究所)；鉛、鈣和鐵標準儲備液(中國計量科學研究院)；H2O2、NOS、CAT、NO、SOD和MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)； T10高速組織分散機(IKA公司)；TAS-990原子吸收分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)； Synergy H1M 酶標儀(BioTek 公司)；MARS6微波消解儀(美國CEM公司)；BS224S-CW電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；24UV 超純水器(美國Millipore 公司)；IMS-40全自動雪花制冰機(常熟市雪科電器有限公司)；5430R高速冷凍離心機(艾本德中國有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及處理 40只剛斷乳昆明系小鼠，購自長春生物制品研究所有限責任公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(吉)2011-0007，體重13～16 g，飼養(yǎng)于吉林醫(yī)藥學院實驗動物中心，合格證號：SYXK(吉)2012-0004。飼養(yǎng)條件：溫度18 ℃～22 ℃，濕度45%～65%，12 h明暗交替。按體重隨機分為對照組、醋酸鉛模型組、齊墩果酸組和齊墩果酸+醋酸鉛組，每組10只，雌雄各半。對照組按0.1 ml/10 g體重給予豆油溶液灌胃，飲用自來水；模型組按體重給予0.1ml/10 g豆油溶液灌胃，用2 g/L醋酸鉛溶液(添加少許醋酸以防止產(chǎn)生絮狀沉淀)作飲用水造模；齊墩果酸組按0.1ml/10g體重給予1 g/L齊墩果酸豆油溶液灌胃，飲用自來水；齊墩果酸+醋酸鉛組按0.1 ml/10 g體重給予1 g/L齊墩果酸豆油溶液灌胃，用2 g/L醋酸鉛溶液作飲用水。模型組和齊墩果酸+醋酸鉛組飲用醋酸鉛水造模1周后，各組每天分別給予豆油溶液和齊墩果酸豆油溶液灌胃1次，同時用醋酸鉛作飲用水。對照組和齊墩果酸組給予自由飲水1周后，給予豆油溶液或者齊墩果酸豆油溶液每天灌胃1次。連續(xù)灌胃3周后用自來水代替醋酸鉛作為飲用水并禁食過夜，稱重后處死小鼠，取出腦組織進行指標檢測。

1.2.2 微波消解處理和測定 準確稱取0.2 g新鮮腦組織，剪碎后移入反應(yīng)罐中，加入5 mL硝酸，用微波消解儀進行消化處理(400 W升溫5 min，120 ℃消解5 min，800 W升溫5 min，150 ℃消解10 min，800 W升溫10 min，180 ℃消解10 min)。將冷卻至室溫的消解液定容至10 mL，同時設(shè)置只加消化液和稀釋液的空白對照組。用石墨爐原子吸收分光光度法測定鉛的吸光度，火焰原子吸收分光光度法測定鈣、鐵、鋅、銅、鎂和錳的吸光度，并用標準曲線法計算出各元素的含量。

1.2.3 CAT、H2O2、NOS、NO、SOD和MDA含量的測定 把剩余新鮮腦組織與生理鹽水按1∶9的比例混合后勻漿成懸濁液并離心，取上清液進行H2O2、CAT、NO、NOS、SOD和MDA的測定，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 各試驗組小鼠體重、腦組織質(zhì)量及其系數(shù)變化 試驗初始時每組共有小鼠10只，試驗結(jié)束時每組小鼠剩余10只。鉛暴露并未引起小鼠死亡，齊墩果酸經(jīng)口灌胃也未引起小鼠死亡。小鼠初始體重均值為(14.50±1.56)g，試驗結(jié)束時各組小鼠體重均有增加，但各組體重差異不明顯(P>0.05)。試驗中各組小鼠營養(yǎng)狀況良好，被毛光澤，體溫及呼吸頻率正常。試驗結(jié)束后處死小鼠，取腦組織并用生理鹽水洗去血污，濾紙蘸干水分后稱重。通過計算臟器系數(shù)發(fā)現(xiàn)鉛暴露并未引起腦組織質(zhì)量改變。齊墩果酸組以及齊墩果酸+醋酸鉛組小鼠腦組織臟器系數(shù)與對照組相比較，也未發(fā)現(xiàn)有明顯差異(P>0.05)。這表明齊墩果酸對小鼠腦組織質(zhì)量也未產(chǎn)生明顯影響(見表1)。

表1各試驗組小鼠終末體重、腦組織質(zhì)量及臟器系數(shù)

組別小鼠終末體重(g)腦組織濕重(g)腦臟器系數(shù)(%)對照組18.73±1.310.4662±0.322.50±0.21醋酸鉛模型組20.78±2.300.4599±0.452.24±0.37齊墩果酸組19.01±2.820.4621±0.282.47±0.32齊墩果酸+醋酸鉛組18.79±2.270.4651±0.252.49±0.18

2.2 各試驗組小鼠腦組織鉛、鈣、鋅和錳含量變化 由表2可知，醋酸鉛模型組小鼠腦組織鉛含量明顯高于對照組(P<0.05)，這一結(jié)果表明，醋酸鉛模型組造模成功。齊墩果酸組小鼠腦組織鉛含量明顯低于醋酸鉛模型組(P<0.05)，齊墩果酸+醋酸鉛組小鼠腦組織鉛含量低于醋酸鉛模型組(P<0.05)。這一結(jié)果表明，小鼠給予齊墩果酸后降低了小鼠腦組織鉛含量。醋酸鉛組小鼠腦組織鈣含量明顯低于對照組(P<0.05)，齊墩果酸組和齊墩果酸+醋酸鉛組小鼠腦組織鈣含量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。齊墩果酸組小鼠腦組織鈣含量高于醋酸鉛模型組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。齊墩果酸+醋酸鉛組小鼠腦組織鈣含量明顯高于醋酸鉛模型組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這表明齊墩果酸對鈣含量沒有影響，但卻可以降低鉛對鈣的影響。在各試驗組小鼠腦組織中，鋅和錳含量沒有發(fā)生明顯改變(P>0.05)。

表2 各試驗組小鼠腦組織鉛、鈣、鋅和錳含量

注：與對照組比較，*P<0.05； 與醋酸鉛模型組比較，#P<0.05，表4同

2.3 各試驗組小鼠腦組織銅、鎂和鐵含量變化 如表3所示，與對照組比較，醋酸鉛模型組、齊墩果酸組和齊墩果酸+醋酸鉛組小鼠腦組織銅、鎂和鐵的含量變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與醋酸鉛模型組比較，齊墩果酸組和齊墩果酸+醋酸鉛組小鼠腦組織銅、鎂和鐵含量的變化均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與齊墩果酸組比較，齊墩果酸+醋酸鉛組小鼠腦組織這3種元素含量變化差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 各試驗組小鼠腦組織銅、鎂和鐵含量

2.4 各試驗組小鼠腦組織H2O2、CAT、NO和NOS含量變化 如表4所示，與對照組比較，醋酸鉛模型組小鼠腦組織H2O2和CAT水平明顯降低，NO和NOS水平顯著升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，齊墩果酸組和齊墩果酸+醋酸鉛組小鼠腦組織H2O2、CAT、NO和NOS水平無明顯變化(P>0.05)。與醋酸鉛模型組比較，齊墩果酸組小鼠腦組織H2O2和CAT水平明顯升高，NO和NOS水平明顯降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，齊墩果酸+醋酸鉛組小鼠腦組織H2O2和CAT水平明顯降低(P<0.05)，NO和NOS水平?jīng)]有明顯變化(P>0.05)。齊墩果酸+醋酸鉛組小鼠腦組織H2O2、CAT、NO和NOS水平與齊墩果酸組比較也沒有明顯差異(P>0.05)。

2.5 各試驗組小鼠腦組織SOD和MDA含量變化 如表5所示，與對照組比較，醋酸鉛模型組小鼠腦組織SOD水平明顯降低(P<0.05)，MDA水平明顯升高(P<0.05)。齊墩果酸組小鼠腦組織SOD和MDA水平與對照組比較沒有明顯差別(P>0.05)。齊墩果酸組小鼠腦組織SOD水平明顯高于醋酸鉛模型組(P<0.05)，MDA水平明顯低于醋酸鉛模型組(P<0.05)。齊墩果酸+醋酸鉛組小鼠SOD水平低于對照組(P<0.05)，但明顯高于醋酸鉛模型組(P<0.05)；MDA水平高于對照組和齊墩果酸組(P<0.05)，但明顯低于醋酸鉛模型組(P<0.05)。

表4各試驗組小鼠腦組織H2O2、CAT、NO和NOS含量

組別H2O2(mmol/g)CAT(U/mg)NO(Umol/g)NOS(U/mg)對照組80.55±10.160.80±0.171.29±0.440.44±0.17醋酸鉛模型組65.60±6.00*0.58±.22*2.24±0.40*0.63±0.13*齊墩果酸組81.21±11.89#0.83±0.18#1.46±0.26#0.43±0.08#齊墩果酸+醋酸鉛組78.94±11.48#0.75±0.31#1.85±0.340.57±0.05

表5 各實驗組小鼠腦組織SOD和MDA含量

注：與對照組比較，*P<0.05；與醋酸鉛模型組比較，#P<0.05；與齊墩果酸組比較，▼P<0.05

3 討論

鉛是一種在工業(yè)和日常生活中被廣泛應(yīng)用的重金屬，廣泛分布在水、土壤、空氣和食物中，可以通過呼吸道、消化道和皮膚吸收。進入機體的鉛對神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等有明顯毒性，其中對神經(jīng)系統(tǒng)的毒效應(yīng)最強[9]。發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)對鉛暴露非常敏感。鉛暴露造成的腦發(fā)育異常具有持久且不可逆的特性。鉛對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的誘導(dǎo)，細胞的增殖、遷移、分化，突觸形成和神經(jīng)元回路建立以及神經(jīng)細胞壞死等過程都會產(chǎn)生影響，可導(dǎo)致兒童神經(jīng)行為以及智力改變，嚴重的可導(dǎo)致癡呆[10]。鉛的神經(jīng)毒性防治研究具有重要的科學價值。本研究通過給予剛斷乳小鼠飲用醋酸鉛水的方式模擬兒童發(fā)育階段的鉛暴露，同時給予齊墩果酸干預(yù)，觀察處理后小鼠腦組織鉛含量以及鈣、鐵和鋅等元素的變化，觀察齊墩果酸對鉛暴露小鼠的影響，為防治鉛中毒提供理論依據(jù)。

通過觀察發(fā)現(xiàn)，醋酸鉛飲水造模4周后，小鼠腦組織鉛含量明顯高于對照組，這表明鉛暴露模型造模成功。通過齊墩果酸干預(yù)3周后發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸能降低腦組織中鉛含量，有較好的排鉛作用。此外，齊墩果酸干預(yù)后升高了鉛暴露引起的腦組織鈣水平降低。鈣與鉛同為二價陽離子，在體內(nèi)有相似的代謝過程，鉛可以占據(jù)電壓依賴性鈣通道而抑制鈣轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致鈣無法被運輸而水平降低。由于鉛的占用，許多鈣通道會永久失活，造成不可逆性改變[11]。齊墩果酸對鈣含量的影響表明其可能逆轉(zhuǎn)了鈣通道被鉛占用，減少了鈣的丟失。

除了鈣以外，本研究還觀察了鐵、鋅、銅、鎂和錳元素在腦組織中的變化。這些元素在體內(nèi)都有重要功能，其含量高低直接關(guān)系到人體健康。鐵是血紅蛋白的主要成分[12]，鋅是多種解毒酶的功能成分或激活劑，銅可參與造血和鐵的代謝，鎂是多種酶的輔助因子，錳在體內(nèi)一部分作為金屬酶的組成成分，一部分作為酶的激活劑發(fā)揮作用[13-14]。鉛暴露可以影響這5種元素的轉(zhuǎn)運，引起元素代謝的紊亂。本研究發(fā)現(xiàn)鉛暴露后并未引起小鼠腦組織中這5種元素含量的改變，這表明鉛暴露4周，尚不足以引起腦組織中這些元素發(fā)生紊亂。齊墩果酸干預(yù)也未明顯改變這些元素在腦組織中的含量。

鉛對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷作用與鉛誘導(dǎo)產(chǎn)生大量自由基有關(guān)。體內(nèi)自由基包括活性氧自由基和活性氮自由基，其中H2O2是活性氧自由基的典型代表，NO是活性氮自由基的典型代表。由自由基引起的蛋白質(zhì)損傷與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有關(guān)。酶抗氧化系統(tǒng)被抑制以及自由基的大量生成共同導(dǎo)致了神經(jīng)系統(tǒng)受損。H2O2可以與體內(nèi)二價金屬離子發(fā)生Fenton反應(yīng)，生成毒性更強的羥自由基(hydroxyl free radical，·OH)。本研究發(fā)現(xiàn)，同樣為二價金屬的鉛大量進入機體，在誘導(dǎo)H2O2大量生成的同時也消耗掉了H2O2，生成了毒性更強的自由基，這可能是導(dǎo)致醋酸鉛模型組小鼠腦組織中H2O2水平比對照組低的原因?！H的大量生成會進一步加重腦組織的氧化損傷。CAT是機體內(nèi)負責清除H2O2和·OH的主要活性酶之一，大量生成的自由基誘發(fā)了氧化應(yīng)激，導(dǎo)致解毒酶CAT的活性降低，自由基無法被及時清除而大量堆積，氧化損傷進一步加重。齊墩果酸降低了腦組織中鉛含量，減輕了H2O2生成量以及鉛與H2O2反應(yīng)生成·OH的量，因此齊墩果酸+醋酸鉛組腦組織H2O2水平比醋酸鉛組高，但比對照組低。齊墩果酸通過升高CAT的水平實現(xiàn)了降低鉛對腦組織的損傷。醋酸鉛模型組NO水平比模型組高，這表明鉛對腦組織產(chǎn)生損傷的過程中，活性氮自由基也發(fā)揮了重要作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，醋酸鉛模型組NOS的活性比對照組高，這可能與NOS是調(diào)控NO生成的酶有關(guān)。齊墩果酸有較強的抗氧化作用，可以清除體內(nèi)產(chǎn)生的NO自由基。因此，齊墩果酸+醋酸鉛組NO水平低于醋酸鉛模型組，NOS的水平也低于醋酸鉛模型組。齊墩果酸通過抗氧化作用降低了鉛損傷，對腦組織起到了保護作用。

綜上所述，齊墩果酸對鉛所致小鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有一定的保護作用，其降低自由基引起氧化損傷的同時，對鉛暴露所導(dǎo)致的鈣流失也有抑制作用，但對鋅、鐵、錳、鎂和銅元素的影響不大。齊墩果酸具有能改善鉛毒性引起的氧化損害，對其他元素在體內(nèi)的代謝影響小以及本身的毒性作用小等優(yōu)點，可以作為一種優(yōu)良的天然防治鉛損害的功能活性物質(zhì)被開發(fā)利用。

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