韓寧寧 , 戴 青 , 于麗娜 , 王靜文 , 徐 嫄 , 趙 暉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ， 北京 海淀 100081)

效價(jià)測定的三劑量法一般應(yīng)用于抗生素類標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)定賦值。由于該方法為生物檢定法，操作步驟繁多，影響因素眾多。如何提高標(biāo)準(zhǔn)品賦值的準(zhǔn)確性是標(biāo)準(zhǔn)品制備者所關(guān)心的問題之一。本文根據(jù)《測量不確定度評定與表示》(JJF1059.1—2012)[1]中有關(guān)規(guī)定，以三劑量濁度法測定慶大霉素原料效價(jià)為例，對該方法的不確定度來源和大小進(jìn)行分析及評定，從而為評價(jià)賦值結(jié)果提供科學(xué)依據(jù)，也為提高賦值準(zhǔn)確性指引方向。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 WBS-100微生物比濁法測定儀(北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司)；XS205分析天平(Mettler Toledo)。

1.2 菌株、樣品、培養(yǎng)基與試劑 金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003(中國食品藥品檢定研究院)。慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品(來源/批號/含量：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所/K0071502/630單位/mg)。慶大霉素原料藥(來源/批號/估計(jì)效價(jià)：煙臺只楚藥業(yè)有限公司/160310073/600單位/mg)?？股貦z定III號培養(yǎng)基、pH值7.8的磷酸鹽緩沖液、生理鹽水及滅菌水均由北京中海生物科技有限公司提供配制。

2 方法

根據(jù)中華人民共和國獸藥典二〇一五年版一部附錄抗生素微生物檢定法[2]，對該批慶大霉素原料進(jìn)行三劑量濁度法的效價(jià)測定。

檢定菌株CMCC(B)26003處理方法為營養(yǎng)瓊脂大試管(3 cm×15 cm)培養(yǎng)22 h后用6 mL生理鹽水洗脫，將該菌懸液用生理鹽水進(jìn)行1∶10稀釋，得稀釋菌懸液，抗生素檢定III號培養(yǎng)基菌懸液濃度為稀釋菌懸液的0.2%。

慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品及原料藥的稀釋過程均為取適量樣品，精密稱定，置25 mL量瓶(V1)中，加水溶解并稀釋至刻度，配制成1 000單位/mL溶液。用5 mL移液管(V2)精密量取上述溶液5.00 mL置100 mL量瓶(V3)中，加pH值7.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，得50單位/mL的溶液。用5 mL移液管(V4)精密量取上述溶液5.00 mL置100 mL量瓶(V5)中，加pH值7.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，得2.5單位/mL的溶液。用5 mL刻度吸管(V6)分別量取上述溶液5.0、4.0、3.2 mL置50 mL量瓶(V7)中，加pH值7.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，分別得0.25、0.2、0.16單位/mL的溶液。

用微量移液器各移取上述溶液1.00 mL(V8)置比色皿中。之后每個(gè)比色皿中用10 mL刻度吸管(V9)加入帶菌培養(yǎng)基9.0 mL，蓋上蓋子，置預(yù)熱至37 ℃的微生物比濁法測定儀中培養(yǎng)3～4 h，待符合要求[3]平均可信限率≤7.0%，回歸具有顯著性差異(P<0.01)，偏離平行不具有顯著性差異(P>0.05)，二次曲線不具有顯著性差異(P>0.05)，反二次曲線不具有顯著性差異(P>0.05))時(shí)，打印報(bào)告。

3 結(jié)果與分析

S2、S3分別為標(biāo)準(zhǔn)品低、中、高濃度所有吸光度值的總和；T1、T2、T3分別為供試品低、中、高濃度所有吸光度值的總和；I為高濃度與中濃度或中濃度與低濃度比值的對數(shù)，在三劑量法中I=log1.25=0.096 9。

由Pt=P×D×At導(dǎo)出如下公式：u2(Pt)rel=u2(P)rel+u2(D)rel+u2(At)rel(公式1)。

u(P)rel由儀器對吸光度值的重復(fù)測量及稀釋過程中移液管、刻度吸管、微量移液器、量瓶的標(biāo)準(zhǔn)操作而產(chǎn)生；u(D)rel及u(At)rel由天平稱量的標(biāo)準(zhǔn)操作而產(chǎn)生。

3.2 各分量的不確定度

3.2.1 運(yùn)算系數(shù)P的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(P)rel運(yùn)算系數(shù)P的不確定度u(P)rel的來源有3個(gè)：吸光度值重復(fù)測量引入的不確定度u測量1、儀器最大允許誤差引入的不確定度u測量2和稀釋過程的標(biāo)準(zhǔn)操作引入的不確定度u(I)。故u2(P)rel=u2測量1rel+u2測量2rel+u2(I)rel(公式2)。

3.2.1.1 儀器對吸光度值的重復(fù)測量引入的不確定度

本試驗(yàn)測得高中低濃度標(biāo)準(zhǔn)品和供試品各吸光值如表1所示。效價(jià)測定結(jié)果為639單位/mg。

在三劑量法中，由于每份報(bào)告是由n個(gè)平行樣組成，吸光度重復(fù)測量引入的不確定度分量為實(shí)際

表1 三劑量濁度法測定慶大霉素原料吸光度值

其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u測量1rel=u測量1/y=0.155/639=2.43×10-4

3.2.1.2 供試品與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋過程中的標(biāo)準(zhǔn)操作引入的不確定度

u(I)2rel=u(V1)2rel+u(V2)2rel+u(V3)2rel+u(V4)2rel+u(V5)2rel+u(V6)2rel+u(V7)2rel+u(V8)2rel+u(V9)2rel(公式3)。

u(V4)rel=u(V5)rel=u(V2)rel=1.77×10-3；

代入公式(3)得：u(I)rel=1.10×10-2。

代入公式(2)得：u(P)rel=1.11×10-2。

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)際濃度與理論濃度的比值D的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(D)rel

代入公式(4)得u(D)=4.83×10-2。標(biāo)準(zhǔn)品的稱樣量為39.85 mg，故u(D)rel=u(D)/39.85=1.21×10-3。

3.2.3 供試品的估計(jì)效價(jià)引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度 u(At)relu(At)為供試品稱量過程中的標(biāo)準(zhǔn)操作引起的不確定度。其計(jì)算方法與3.2.2公式(4)相同。供試品的稱樣量為41.98 mg，故u(At)rel=u(At)/41.98=1.15×10-3。

3.3 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展相對不確定度的計(jì)算 將上述各值代入公式(1)得u(Pt)rel=0.011。實(shí)驗(yàn)所得慶大霉素原料的效價(jià)為639單位/mg，則測量結(jié)果的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為U(Pt)=0.011×639=7單位；取包含因子k=2，則測定結(jié)果的擴(kuò)展相對不確定度為U=2×7單位=14單位。慶大霉素原料的測定結(jié)果可以表示為639±14單位，k=2。

4 討論

4.1 各分量對測量準(zhǔn)確度的影響 比較各不確定度分量可知，u(P)rel>u(D)rel≈u(At)rel，而u(P)rel中，u(I)rel所占不確定度分量較大，提示影響測量準(zhǔn)確度的主要因素為稀釋過程的標(biāo)準(zhǔn)操作。因此，標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)定人員應(yīng)注意效價(jià)測定過程中稀釋定容的操作手法，并保證供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的手法一致性。

4.2 本試驗(yàn)不確定度分析中的零項(xiàng)[6]三劑量濁度法效價(jià)測定中各比色皿的加樣順序一般為S3→T3→S2→T2→S1→T1，同時(shí)要求加入抗生素溶液后立即快速加入含有菌懸液的培養(yǎng)基，以避免在不同比色皿中細(xì)菌的生長時(shí)間差異引起培養(yǎng)基吸光度值的差異。在本試驗(yàn)操作中，還注意將培養(yǎng)基預(yù)先放置于5 ℃冰箱冷藏以進(jìn)一步抑制試驗(yàn)開始前細(xì)菌的生長。故加樣順序?qū)е碌臅r(shí)間差異做零項(xiàng)處理。

WBS-100型微生物比濁法測定儀溫度均勻度為±0.3 ℃。采用國際通行的拉丁方陣排列比色皿，可消除不同位置的溫度差異，避免系統(tǒng)誤差。故培養(yǎng)溫度的差異做零項(xiàng)處理。

[1] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. 測量不確定度評定與表示[S]. JJF1059.1-2012, 2012.

[2] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典[S]. (2010年版一部). 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 294-296.

[3] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典[S]. (2015年版一部). 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 352-355.

[4] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. 常用玻璃量器檢定規(guī)程[S]. JJG196-2006, 2006.

[5] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. 電子天平檢定規(guī)程[S]. JJG1036-2008, 2008.

[6] 常艷. 抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的定值及其不確定度評定[D]. 北京: 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院, 2011.