丁海麥， 白 羽， 石松利

(1.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040； 2.包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040)

蒙古扁桃(Amygdalusmongolica)為薔薇科(Rosaceae)桃屬(Amygdalus)植物，是亞洲中部戈壁荒漠區(qū)特有的旱生落葉灌木、國(guó)家三級(jí)瀕危保護(hù)植物[1]。蒙古扁桃是荒漠區(qū)重要牧草，其葉、嫩枝、花及果實(shí)均為家畜喜食，在植被稀疏干旱少雨荒漠區(qū)，草原牧民稱(chēng)之為“救命草”[2]。同時(shí)，蒙古扁桃為傳統(tǒng)的中藥材，以種仁入藥，性苦，味平，主治干咳、咽喉干燥、支氣管炎及陰虛便秘，還可制成止痛劑和鎮(zhèn)靜劑，對(duì)糖尿病、高血壓、神經(jīng)衰弱、肺炎等有一定療效[3-4]。由此可見(jiàn)，蒙古扁桃具有廣闊的開(kāi)發(fā)價(jià)值。蒙古扁桃的研究目前主要集中在有效成分提取分離、鑒定分析技術(shù)、藥理性等方面，且均取得一定成果，但對(duì)于蒙古扁桃資源的各地品種遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)研究仍不多。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間(inter simplese quencerepeat，簡(jiǎn)稱(chēng)ISSR)是在微衛(wèi)星技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)，是一種簡(jiǎn)單高效的遺傳標(biāo)記方法，具有多態(tài)性高、產(chǎn)物特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[5]，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于作物、花卉、中藥材遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究中。ISSR原理是利用錨定的SSR-DNA作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)而檢測(cè)相鄰S(chǎng)SR之間基因組DNA序列的差異。由于ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是基于PCR技術(shù)開(kāi)發(fā)的，影響擴(kuò)增結(jié)果的因素包括引物、模板DNA濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq酶活性等，對(duì)于不同的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，ISSR的結(jié)果是不同的[6]。因此，為確保ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定和準(zhǔn)確，需對(duì)此擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。本研究主要針對(duì)ISSR反應(yīng)體系的5個(gè)因素，在4個(gè)水平上對(duì)內(nèi)蒙古包頭趙長(zhǎng)城遺址瀕危植物蒙古扁桃進(jìn)行ISSR-PCR體系優(yōu)化，以期建立適合蒙古扁桃ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系，為今后利用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)蒙古扁桃資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)和種質(zhì)資源鑒定等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所取材料為蒙古扁桃的嫩葉，采集于內(nèi)蒙古包頭市趙長(zhǎng)城遺址。

1.2 試劑和儀器

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、10×PCR Buffer(Mg2+free)、MgCl2、TaqDNA聚合酶、dNTPs、ISSR引物840(5′-GAGAGAGAGAGAGAYT-3′)等，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR儀，由Biometra公司生產(chǎn)；微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，NanoDrop；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1 總DNA的提取 采用改進(jìn)的CTAB法提取蒙古扁桃葉基因組總DNA，采用微量紫外分光光度計(jì)及0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取DNA的純度和濃度。

1.3.2 ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序 采用25 μL PCR反應(yīng)體系，基本擴(kuò)增程序如下：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，47 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35次循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存，電泳檢測(cè)。

1.3.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化 在普通PCR反應(yīng)體系基礎(chǔ)上采用L16(45)正交設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)，對(duì)Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶活性、dNTPs濃度、引物835濃度和DNA模板質(zhì)量進(jìn)行5因素4水平篩選(表1)，最終確定最佳反應(yīng)體系。在總體積為25 μL的體系中，除表1中各主要因素之外，每管中加入10×PCR Buffer(Mg2+free)2.5 μL，補(bǔ)加ddH2O直至總體積為25 μL。其模板為趙長(zhǎng)城遺址蒙古扁桃嫩葉基因組DNA。在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物選用1.5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后將膠體放入凝膠成像系統(tǒng)中觀(guān)察并拍照保存。試驗(yàn)結(jié)果參照賀石林的統(tǒng)計(jì)方法[7]，對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果依據(jù)電泳條帶的強(qiáng)弱、多少及背景清晰程度進(jìn)行打分，效果最佳的得16分，最差的得1分，效果居中的得 2～15分。

表1 PCR反應(yīng)的L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4 UBC840最佳退火溫度 依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，將優(yōu)化的反應(yīng)體系在梯度PCR模式下設(shè)定退火溫度為41～53 ℃，依據(jù)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，確定最優(yōu)的退火溫度。

1.3.5 最佳反應(yīng)體系驗(yàn)證 選擇已篩選的ISSR引物UBC840和7個(gè)不同居群蒙古扁桃不同的樣品，檢測(cè)優(yōu)化的ISSR-RCR體系及擴(kuò)增程序的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA檢測(cè)

用1%瓊脂糖凝膠于80 V電泳50 min，檢測(cè)所提取DNA的完整性。結(jié)果如圖1所示，可見(jiàn)提取的DNA樣品較純，無(wú)降解。所提取的蒙古扁桃葉DNA樣品用微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得D260 nm/D280 nm值在1.80～1.85之間，符合PCR的要求。將DNA濃度稀釋至50 ng/μL備用。

2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交設(shè)計(jì)直觀(guān)分析

參照賀石林的統(tǒng)計(jì)方法[7]，對(duì)16個(gè)組合正交試驗(yàn)結(jié)果(圖1)進(jìn)行分析，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果打分，效果最佳的得16分，最差的得1分，各體系得分依次為7、7、5、6、15、14、2、14、12、14、8、13、16、15、11、1分。Mg2+濃度、引物濃度、dNTPs濃度、模板DNA用量、Taq酶活性這5個(gè)因素正交試驗(yàn)得分的多重比較結(jié)果(極差)分別為5.50、6.25、4.25、2.50、6.50，可見(jiàn)在本試驗(yàn)設(shè)置的因素水平范圍內(nèi)，5個(gè)因子間各水平具有不同顯著性，其影響順序依次為T(mén)aq酶活性>引物濃度>Mg2+濃度>dNTPs濃度>模板DNA用量。

2.3 同一因素內(nèi)不同水平對(duì)PCR結(jié)果的影響

2.3.1 Mg2+濃度對(duì)PCR結(jié)果的影響 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有明顯影響。由表2可知，本試驗(yàn)中Mg2+濃度對(duì)結(jié)果的影響較大，在1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L 4個(gè)Mg2+濃度處理之間得分均值差異明顯，且隨著Mg2+濃度的增加，得分均值在一定范圍內(nèi)逐漸增大，高濃度的Mg2+降低了Taq酶活性，使反應(yīng)的產(chǎn)物減少。因此，本試驗(yàn)以2.0 mmol/L為最佳Mg2+濃度。

2.3.2Taq酶濃度對(duì)PCR結(jié)果的影響Taq酶是Mg2+依賴(lài)性酶，Mg2+濃度可影響酶的活性和專(zhuān)一性。由表3、圖1可知，本試驗(yàn)中Taq酶濃度對(duì)結(jié)果的影響最大，不同濃度Taq酶的得分均值明顯不同。綜合考慮，本試驗(yàn)以2.0 U為最佳Taq酶用量。

表2 Mg2+濃度與得分均值的關(guān)系

2.3.3 引物濃度對(duì)PCR結(jié)果的影響 引物是PCR反應(yīng)體系

表3 Taq酶活性與得分均值的關(guān)系

的關(guān)鍵成分，PCR產(chǎn)物的特異性由引物與模板DNA的互補(bǔ)程度決定；引物濃度偏高可引起非特異性擴(kuò)增，同時(shí)也會(huì)增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。由表4可知，本試驗(yàn)范圍內(nèi)的不同引物濃度的得分均值存在明顯差異，得分均值在引物濃度為0.40～0.80 μmol/L范圍內(nèi)隨著引物濃度的提高而逐漸增大。綜合考慮，本試驗(yàn)以0.80 μmol/L為最佳引物濃度。

表4 引物濃度與得分均值的關(guān)系

2.4 引物840最佳退火溫度選擇

梯度PCR結(jié)果表明，溫度低時(shí)特異性較差，產(chǎn)生條帶相對(duì)較多，同時(shí)又缺失小片段；退火溫度較高時(shí)，引物與模板的結(jié)合性差，又造成大片段的缺失，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增產(chǎn)物譜帶數(shù)減少，同時(shí)亮度減弱。因此UBC840的最佳退火溫度范圍為第4～5泳道，最終選擇49 ℃(圖2)。

2.5 ISSR-PCR最優(yōu)體系的驗(yàn)證

以UBC840為引物，利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化的蒙古扁桃 ISSR-PCR反應(yīng)體系，對(duì)7份不同種質(zhì)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR條帶數(shù)目多且清晰，能區(qū)分7份蒙古扁桃種質(zhì)(圖3)。由結(jié)果可知，優(yōu)化的蒙古扁桃ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，可應(yīng)用于蒙古扁桃資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)和種質(zhì)資源鑒定。

3 討論

ISSR分子標(biāo)記是從SSR發(fā)展而來(lái)的，是一種微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)[8-9]，一般每個(gè)引物可以擴(kuò)增出6條左右的條帶，為保證ISSR-PCR試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性、穩(wěn)定性，要充分考慮反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序及不同物種的影響[10]。

本研究表明，在蒙古扁桃ISSR-PCR反應(yīng)體系中，Taq酶、引物和Mg2+濃度是影響ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)果很重要的3個(gè)因素。Taq酶的濃度關(guān)系到PCR擴(kuò)增反應(yīng)的成敗，酶濃度過(guò)低時(shí)擴(kuò)增速率低，條帶少且條帶模糊，甚至無(wú)擴(kuò)增條帶[11]，酶濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生非特異條帶。引物濃度對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性有明顯影響，濃度較高容易產(chǎn)生非特異條帶，濃度較低則不能擴(kuò)增[12]。Mg2+作為T(mén)aq酶的輔助因子，其濃度不但影響Taq酶活性，而且可與反應(yīng)體系中的dNTPs相結(jié)合，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量均有顯著影響，其濃度過(guò)高時(shí)，多余的Mg2+鰲合dNTPs，使dNTPs消耗殆盡，擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)單鏈化，非特異性條帶產(chǎn)量增加；Mg2+濃度過(guò)低時(shí)，則由于dNTPs鰲合Mg2+降低Taq酶活性，使擴(kuò)增產(chǎn)物減少。本研究?jī)?yōu)化后的 25 μL 反應(yīng)體系如下：Taq酶活性2.0 U，引物濃度 0.80 μmol/L，Mg2+濃度2.0 mmol/L，dNTPs濃度 0.25 mmol/L，模板DNA質(zhì)量50 ng。本試驗(yàn)優(yōu)化的ISSR-PCR體系為進(jìn)一步利用ISSR技術(shù)對(duì)蒙古扁桃資源遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)和種質(zhì)資源鑒定等奠定了基礎(chǔ)。

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