王 濤

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院麻醉科，江蘇 南京 210014）

缺血再灌注損傷（Ischemia-reperfusion injury，IRI）是指在缺血后一段時(shí)間血液回到組織后引起的組織損傷[1]。骨科止血帶的應(yīng)用可以減少肢體手術(shù)術(shù)中失血，保持手術(shù)視野，然而其應(yīng)用也是導(dǎo)致IRI的重要原因。骨骼肌對(duì)缺血性改變非常敏感，臨床評(píng)估不足以衡量止血帶引起的缺血性組織損傷程度。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類(lèi)短的，保守的，單鏈非編碼的RNAs，通過(guò)抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解而作為靶基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子[2]。MiRNA逐漸被認(rèn)為與缺血再灌注損傷有關(guān)，本研究擬觀察miR-141對(duì)骨科止血帶所致缺血再灌注損傷的氧化應(yīng)激和炎癥因子的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選擇2016年1月～2017年12月XXX醫(yī)院骨科收治的下肢手術(shù)患者80例為研究對(duì)象，入組標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)椎管內(nèi)麻醉禁忌，無(wú)肝、腎、心臟等主要臟器功能異常，無(wú)糖尿病，無(wú)惡性腫瘤，無(wú)結(jié)核、肝炎等傳染性疾病。所有患者及其家屬均知情同意，并由本醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施此研究。

1.2 麻醉方法

患者術(shù)前常規(guī)禁食、禁水，以鼻導(dǎo)管2 L/min吸氧并及時(shí)建立外周靜脈通過(guò)，監(jiān)測(cè)心電圖、脈搏血氧飽和度、血壓及心率。以兩點(diǎn)穿刺腰硬聯(lián)合麻醉，感覺(jué)平面固定于T10以下，20 G留置針行股靜脈穿刺并固定，肝素封管?；贾蚪亩蓑?qū)血后于大腿中上1/3處放置止血帶，壓力為術(shù)前收縮壓加100 mmHg，時(shí)間60 min。術(shù)中以10 ml/（kg·h）復(fù)方氯化鈉注射液進(jìn)行補(bǔ)液。

1.3 標(biāo)本采集及觀察指標(biāo)

止血帶使用前后15 min抽取手術(shù)側(cè)靜脈血，離心獲得血清，以ELISA法測(cè)定患者血清超氧化物氣化酶（superoxide dismutase，SOD）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白介素-8（interleukin-8，IL-8）；以Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后以Real-time PCR檢測(cè)血清miR-141表達(dá)水平，U6為內(nèi)參。引物序列：miRNA-141上游引物5'-AAGGATCACCCGTAATCCG-3'，下游引物5'-GTGCAGGTCCGGGTATTC-3'；U6：上游引物5'-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3'，下游引物5'-GTGCAGGGTCCGAG GT-3'。反應(yīng)條件：95℃，3 min；40個(gè)PCR循環(huán)（95℃，15 s；55℃，20 s；72℃，20 s；83.5℃，15 s）。95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s；繪制熔解曲線，以2-△△CT值法進(jìn)行相對(duì)定量分析。以患者血清miR-141相對(duì)表達(dá)中位數(shù)為臨界值，分為miR-141高表達(dá)組39例及低表達(dá)組41例，兩組患者年齡、性別等一般資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 止血帶使用前后miR-141表達(dá)

止血帶使用后，患者血清miR-141相對(duì)表達(dá)明顯上升[（1.314±0.091）vs（0.963±0.084）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 miR-141與氧化應(yīng)激標(biāo)志物SOD的關(guān)系

止血帶使用后，患者血清S O D水平明顯降低（122.1±20.1） U/mLvs（182.1±18.3） U/mL（P＜0.05）。miR-141高表達(dá)組患者SOD表達(dá)明顯低于miR-141低表達(dá)組患者（116.6±20.3）U/mLvs（131.2±20.5）U/mL（P＜0.05）。Spearman相關(guān)分析提示miR-141表達(dá)與SOD表達(dá)負(fù)相關(guān)（r=-0.329，P=0.000）。

2.3 miR-141與炎癥因子TNF-α及IL-8的關(guān)系

止血帶使用后，血清T N F-α及I L-8表達(dá)明顯上升（6.9±1.2）pg/mLvs（2.3±0.6） pg/mL、（1 5 0.8±11.8）p g/m L v s（1 3.8±3.2）p g/m L（P＜0.05）。miR-141高表達(dá)組炎癥因子TNF-α及IL-8較低表達(dá)組明顯升高（7.7±0.6）pg/mLvs（5.6±0.4）pg/mL、（166.3±11.6）pg/mLvs（136.2±9.1）pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MiR-141表達(dá)與TNF-α及IL-8水平正相關(guān)（r=0.284，0.421，P=0.016，0.000）。

3 討 論

目前，骨骼肌的IRI評(píng)估并不能滿足臨床需要，miRNA相關(guān)研究的深入，為揭示IRI的機(jī)制和動(dòng)力學(xué)提供了新的思路。本研究發(fā)現(xiàn)miR-141在IRI發(fā)生后出現(xiàn)了明顯的表達(dá)水平升高（P＜0.05）。說(shuō)明miR-141可以監(jiān)測(cè)骨科止血帶應(yīng)用所致的IRI，提供更多的臨床信息。

IRI的發(fā)生機(jī)制被認(rèn)為與氧自由基過(guò)量產(chǎn)生有關(guān)，再灌注恢復(fù)過(guò)程中，過(guò)量的氧自由基可導(dǎo)致細(xì)胞的功能障礙。SOD是清除氧自由基的主要酶類(lèi)，miR-141的表達(dá)升高與SOD的降低具有明顯的相關(guān)性（P＜0.05），SOD不足是IRI加重的重要原因。MiR-141過(guò)表達(dá)與SOD減少的具體機(jī)制還不明確，還有待進(jìn)一步探究。

IRI的嚴(yán)重程度與炎癥因子失衡有關(guān)，TNF-α及IL-8是經(jīng)典的促炎因子，miR-141可以調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶1（Mitogen-Activated Protein Kinase 1，MAPK1），MAPK1的表達(dá)可以增加TNF-α、IL-8的過(guò)表達(dá)，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[3]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，miR-141的過(guò)表達(dá)也造成了TNF-α、IL-8的表達(dá)增加，這可能是miR-141影響骨科止血帶所致IRI嚴(yán)重程度的機(jī)制之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-141在IRI發(fā)生時(shí)常出現(xiàn)高表達(dá)，其高表達(dá)意味著更嚴(yán)重的自由基清除酶SOD缺乏和炎癥因子TNF-α、IL-8上調(diào)，而其具體調(diào)控機(jī)制還有待更多大樣本的基礎(chǔ)研究。

[1]馮吉杰,王 珂,陳彤宇,等.針刺調(diào)控炎性反應(yīng)在抗缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展[J].針刺研究,2017,42(06):552-556.

[2]劉 沖,楊偉俊,陳 文.miRNA在心肌缺血再灌注損傷中作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù),2017,24(02):163-166.

[3]劉 棣,宋玲琴,張寅斌,等.miRNA-141對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制調(diào)節(jié)作用[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2018,(09):1344-1347.