陳靄延

（廣西梧州市皮膚病防治院 廣西 梧州 543000）

梅毒是人類獨有的疾病，梅毒螺旋體(T.pallidum，TP)是梅毒的病原體，患者是梅毒唯一傳染源。梅毒有先天性和獲得性兩種，前者TP通過胎盤由母體傳染胎兒；后者主要經(jīng)性接觸傳播，也可經(jīng)輸血引起輸血后梅毒。本病病程長，在發(fā)展過程中可侵犯任何器官和組織，引起多種多樣的癥狀和體征，甚至危及生命。另外，梅毒作為一個極其容易潛伏的疾病，往往患者患病多年都無非常明顯的癥狀凸顯[1]。梅毒的實驗室檢測包括病原學(xué)檢查、血清學(xué)檢查和梅毒的核酸檢查三大類。近年來，隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得快速、敏感、特異的梅毒診斷方法不斷更新完善，有利于廣泛開展流行病學(xué)調(diào)查、預(yù)防控制以及指導(dǎo)臨床及時治療，以控制梅毒的傳播流行。

1.病原學(xué)檢查方法

病原學(xué)檢測及梅毒螺旋體檢查，適用于I、Ⅱ期梅毒有病損者的患者。主要有三種方式，暗視野顯微鏡檢查、鍍銀染色檢查以及直接免疫熒光試驗（DFA）檢查，是診斷早期梅毒首選的方法，孕婦的羊水作暗視野顯微鏡檢查TP，對先天梅毒具有診斷價值[2]。病原學(xué)檢測有利于早期患者早日確診，不耽誤治療的有效時間，減輕了患者的痛苦，降低了疾病的惡化率，為后期預(yù)防和進一步傳播有著十分重要的意義。

1.1 暗視野顯微鏡檢查法

臨床醫(yī)學(xué)中暗視野顯微鏡檢查法是早期梅毒患者最主要的病原學(xué)的檢測方法。其原理是顯微鏡聚光鏡中央有擋光片，利用光的散射現(xiàn)象，使照明光線不直接進入物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。通過硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損部位組織液或淋巴結(jié)穿刺術(shù)得到的組織液，在暗視野顯微鏡下檢查，見到運動活潑，沿其長軸滾動、屈伸、旋轉(zhuǎn)、前后移行等的螺旋體，可作為梅毒的確診依據(jù)。假若是陰性，需要在3周不同的3日內(nèi)進行再次采樣檢測，最終若依舊是陰性才能進行確診[3]。該檢測方法受取材及特殊顯微鏡限制，準確性受操作者的經(jīng)驗、病灶中活螺旋體的數(shù)量以及口腔、肛門破損處存在的非致病性螺旋體等因素的影響。

1.2 鍍銀染色法

從臨床意義來看與暗視野顯微鏡檢查法一致。因螺旋體具有親銀性，高倍顯微鏡螺旋體呈現(xiàn)棕黑色的顯像，背景為黃色。

1.3 直接免疫熒光法（DFA）

特異性和敏感性均優(yōu)于暗視野顯微鏡檢查法和鍍銀染色法，國外臨床醫(yī)學(xué)采用較多，直接免疫熒光法，通過異硫氰酸熒光素標記TP單克隆抗體，使得其與TP進行結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)蘋果綠色進行確診，此法普遍用于區(qū)分TP和其他非致病性或條件致病性螺旋體[4]。

2.血清學(xué)檢查方法

血清學(xué)檢查法有梅毒螺旋體抗原血清試驗和非梅毒螺旋體抗原血清試驗兩類。

2.1 非梅毒螺旋體抗原血清試驗

非梅毒螺旋體抗原血清試驗的以類脂質(zhì)作為抗原，測定病人血清中反應(yīng)素（抗脂質(zhì)抗體）。從臨床醫(yī)學(xué)劃分此試驗主要有四種，原理基本相同[5]，（1）性病研究實驗室玻片試驗（VDRL）：其原理以膽固醇為載體，包被上心脂質(zhì)構(gòu)成VDRL顆粒，與血清中的反應(yīng)素結(jié)合后出現(xiàn)現(xiàn)凝集反應(yīng)，結(jié)果需要低倍顯微鏡觀察。腦脊液VDRL試驗是神經(jīng)梅毒可靠性診斷依據(jù)。此方法待檢樣品需經(jīng)56℃滅活，試劑需要現(xiàn)場配制，即配即用，存在相應(yīng)的局限性，此類方法國內(nèi)的采用的較少。（2）不加熱血清反應(yīng)素試驗（USR）：是VDRL抗原的改良，即將VDRL抗原用稀釋液稀釋后離心沉淀，于沉淀中加入EDTA、氯化膽堿和防腐劑，敏感性及特異性與VDRL相似。EDTA可使抗原在半年內(nèi)不變性，氯化膽堿可滅活補體等，使用血清可不必加熱滅活?？乖槐孛刻炫渲?，在4～8℃冰箱中可保存半年。此種試驗雖然沒有較高的要求，但是現(xiàn)今較少使用。（3）快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗（RPR）：也是是改良的VDRL實驗，其原理使用未經(jīng)處理的活性炭顆粒（直徑3～5um）吸附VDRL抗原。此顆粒如與待檢血清中的反應(yīng)素結(jié)合，形成肉眼可見的黑色凝集塊。（4）甲苯胺紅不加熱試驗（TRUST）：以更易觀察的紅色甲苯胺紅作為輔料進行試驗，最終結(jié)果更易辨識。

2.2 非梅毒螺旋體抗原血清試驗的缺陷

（1）特異性：某些疾病例如麻風(fēng)、結(jié)核、傳紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的患者，皆會出現(xiàn)與梅毒類似的反應(yīng)素，在進行試驗時會出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，對最終確診帶來干擾[6]，特異性較差。（2）敏感性：當感染梅毒螺旋體后機體特異性梅毒螺旋體抗體要早于反應(yīng)素出現(xiàn)，使得一期梅毒的漏檢率較高，增加了患者病情惡化的系數(shù)[7]。另外晚期梅毒患者的反應(yīng)素轉(zhuǎn)陰率較高，再加上這類試驗不利于隱性梅毒的確診，對于梅毒進行篩選排查的漏檢率高。

2.3 非梅毒螺旋體抗原血清試驗的優(yōu)點

若已確診為陽性患者，對于臨床開展工作有較好的時效治療性；非梅毒螺旋體抗原血清試驗可以有效的作為療效觀察的指標，來觀察患者梅毒病癥的發(fā)展；此類方法所用費用較低，減輕了患者的醫(yī)療費用負擔(dān)[8-9]。

2.4 梅毒螺旋體抗原血清試驗

用活的或死梅毒螺旋體作為抗原測定血清中抗螺旋體IgM和/或IgG抗體，其敏感性和特異性優(yōu)于非梅毒螺旋體抗原血清試驗，但不能用于療效觀察。梅毒螺旋體抗原血清試驗一般采用以下幾種方法[10-11]：（1）熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗（FTAABS）；（2）梅毒螺旋體血球凝集試驗（TPHA）；（3）梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA）；（4）梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗（TP-ELISA）；（5）梅毒螺旋體化學(xué)發(fā)光免疫測定（TPCLIA）；（6）梅毒螺旋體快速診斷試驗（TP-RT）；（7）梅毒螺旋體免疫印跡法（WB）。

2.5 熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）

FTA-ABS是一種間接熒光抗體法。試驗前先用Reiter密螺旋體超聲波裂解物處理待檢血清，以去除非特異性類屬抗原，再與TP作用，然后加用熒光素標記的羊抗人丙種球蛋白，在熒光顯微鏡下觀察，是否有熒光的TP，從而檢測有無特異性抗體。FTA-ABS譽為檢測梅毒的“金標準”，敏感性和特異性在所有螺旋體試驗中尤為突出[12]。但是，此試驗操作相對較難，對于操作人員的職業(yè)技能要求較高，一般用于篩選實驗陽性標本的確診實驗。

2.6 血球凝集試驗、明膠凝集試驗

梅毒螺旋體血球凝集試驗（TPHA）以超聲裂解的TP為抗原，由此致敏紅細胞與人血清或血漿中的梅毒螺旋體抗體結(jié)合，進而產(chǎn)生反應(yīng)進行檢測。若進行大樣本批量檢測時，TPHA優(yōu)于FTA-ABS[13-14]。缺點：需主觀判斷結(jié)果，主觀性較高。梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA）在TPHA基礎(chǔ)上進行升級，將梅毒螺旋體Nichols株的精細菌體成分包被在人工合成的惰性明膠顆粒取代TPHA中的紅細胞作為進行試驗的載體。TPPA包含了梅毒螺旋體的所有片段，敏感性更高，結(jié)果更易觀察。TPHA試劑保存時間短，批間差大，TPPA試劑穩(wěn)定性、特異性、敏感性和批間差均優(yōu)于TPHA。

2.7 梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗（TP-ELISA）

2.7.1 TP-ELIS通過TP抗原包被聚丙乙烯板，再加入待檢血清以及酶標記抗原，形成雙抗原夾心，同時檢測1gG和IgM抗體[15]。敏感性和特異性就較高，影響因素少，可采用自動化操作，費用較低廉，因此臨床上常用于大量樣品的篩查和臨床診斷。

2.7.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測梅毒螺旋體IgM抗體，該試驗采用間接法或捕獲法。以捕獲法的敏感性和特異性為佳。由于血液中IgG的量高于IgM，為避免交叉反應(yīng)所引起的假陽性，需對樣本進行預(yù)處理，除去其中的IgG再進行IgM測定。分離去除1gG的常用方法為以抗人IgG等為沉淀劑的柱層析法或免疫沉淀法。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測梅毒螺旋體IgM抗體一般用于先天性梅毒的診斷，活動性梅毒（新近感染）的診斷及療效觀察，梅毒再感染的診斷[16]。

2.8 梅毒螺旋體化學(xué)發(fā)光免疫測定（TP-CLIA）

TP-CLIA是新近發(fā)展的一種體外快速診斷技術(shù)，其原理與ELISA方法基本相同，只是以化學(xué)發(fā)光底物取代了發(fā)色底物，檢測的信號則由光密度（A值）變?yōu)楣庾訑?shù)，較之 ELISA方法，其分析敏感性更低，可報告范圍更寬[17]。

2.9 梅毒螺旋體快速檢測試驗（TP-RT）

TP-RT多數(shù)用于緊急和實驗條件欠佳的場合，在臨床應(yīng)用中多采用膠體金進行標記，同時檢測IgG、IgM抗體或單測IgG抗體。無需高精端儀器，試驗過程簡單快速，但測定結(jié)果受溫度和時間影響較大。

2.10 梅毒螺旋體免疫印跡法（WB）

WB將TP-Nichols株菌體細胞破碎，使用凝膠電泳將梅毒螺旋體各種抗原成分轉(zhuǎn)印到膜條上作為固相，膜條與待測血清和酶標抗體孵育，底物顯色后，當血清中存在梅毒特異性抗體時，則在印跡膜上相應(yīng)的特異性多肽抗原位置出現(xiàn)顯色條帶。該方法特異性強，敏感性高，很少出現(xiàn)假陽性和可疑反應(yīng)是理想的梅毒確認實驗[18]。但試劑價格昂貴，該方法在基層醫(yī)療機構(gòu)還未廣泛推廣應(yīng)用。

3.其他方法

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：梅毒PCR檢測方法分為常規(guī)PCR，巢式PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR，多重PCR和實時PCR。能對生殖器潰瘍進行早期鑒別診斷。PCR是直接檢測TP-DNA，PCR檢測尤其適用于微量TP的檢測，其檢測的敏感性和特異性均高于血清學(xué)試驗，缺點是假陽性較高。此外，有將PCR用于孕婦產(chǎn)前診斷和神經(jīng)梅毒診斷的報道[19-20]。PCR的設(shè)計主要針對編碼梅毒螺旋特異性抗原和TpN47的DNA開放編碼區(qū)，由于PCR的非特異性、TpN47的保守性，這種設(shè)計的PCR雖然不能區(qū)分梅毒和雅司；但可區(qū)分梅毒螺旋體和引博氏疏螺旋體。逆轉(zhuǎn)錄PCR是針對梅毒螺旋體的16srRNA366bp片段的設(shè)計，其污染少，特異性和敏感性高，但是檢驗費用稍高。

4.小結(jié)

結(jié)合上述相關(guān)資料顯示可知，在梅毒試驗中由于受到方法學(xué)自身的局限性、患者自身狀況的特殊性、實驗器材以及相關(guān)因素的影響，無論何種梅毒檢測方法，在進行標本檢測時，都具有相應(yīng)的誤差，此種誤差暫時無法避免，另外在結(jié)果判讀時，假陰性或假陽性情況的出現(xiàn)亦有存在。綜合分析血清學(xué)檢測檢測方法仍是臨床上梅毒實驗診斷的主要方法。多年來通過大量的研究工作，建立了許多檢測TP的方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)和免疫印跡技術(shù)為梅毒的診斷提供了新的檢測手段。未來針對梅毒的檢測技術(shù)，必將朝著快速、簡便、低成本、高檢測率的方向推進。