汪紀(jì)楠，施 偉，宋 偉，張亞琦，張寅生，徐宏江

(江蘇省抗病毒靶向藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司研究院，南京 210042)

乙型肝炎病毒(HBV)感染動(dòng)物模型是抗乙肝藥物研發(fā)成功的關(guān)鍵因素之一，也是深刻理解乙型肝炎發(fā)病機(jī)制的重要組成部分，前人在建立乙型肝炎病毒感染動(dòng)物模型方面做了大量的研究工作[1-5]。鴨乙型肝炎病毒(DHBV)的基因組、復(fù)制方式和發(fā)病機(jī)制與人乙型肝炎病毒(HHBV)相似，且DHBV的天然宿主容易獲得、價(jià)格低廉、感染成功率高，因此DHBV感染動(dòng)物模型是篩選抗HBV藥物、研究藥理和病理機(jī)制的理想模型。本文就近年國(guó)內(nèi)外利用DHBV動(dòng)物模型在藥學(xué)領(lǐng)域中的研究應(yīng)用進(jìn)行綜述，為相關(guān)人員提供參考。

1 藥物研發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用

DHBV感染動(dòng)物模型通常利用DHBV陽(yáng)性鴨血清感染鴨胚或雛鴨，使其肝臟中DHBV DNA持續(xù)復(fù)制，肝功能出現(xiàn)異常，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等明顯升高。由于鴨病毒復(fù)制機(jī)制和病理機(jī)制非常類似于HBV[2]，因此廣泛用于篩選抗乙肝病毒藥物、評(píng)價(jià)藥物作用機(jī)制以及組合治療效果[3]。

1.1 體內(nèi)研究

美國(guó)百時(shí)美施貴寶(BMS)公司曾經(jīng)回顧抗乙肝病毒藥物恩替卡韋(ETV)的開(kāi)發(fā)歷程[4]。ETV于2005年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，此前歷經(jīng)10年研發(fā)之路，多種動(dòng)物模型被用來(lái)測(cè)試化合物的抗病毒能力。彼時(shí)，研究者提出慢性感染土撥鼠乙肝病毒(WHV)的土撥鼠可以作為動(dòng)物模型來(lái)研究抗HBV藥物，BMS公司利用此模型進(jìn)行研究得到了較好的效果[5]。隨后研究人員在DHBV感染的北京鴨模型中觀察到相似的效果[6]，并在持續(xù)DHBV感染鴨模型中評(píng)估了ETV聯(lián)合DNA疫苗的抗病毒功效[7]。通過(guò)多年的抗乙肝病毒藥物研發(fā)工作，該公司研究人員認(rèn)為創(chuàng)新性動(dòng)物模型是ETV研發(fā)成功的3大關(guān)鍵因素之一。

正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司研究院的科研人員使用DHBV感染的北京鴨研究了自主研發(fā)的替諾福韋前藥富馬酸替諾福韋雙特戊酯(BP0018)的體內(nèi)抗病毒作用[8]，檢測(cè)了用藥前后5和10 d、停藥后3 d鴨血清中DHBV DNA的水平，并提取給藥10 d后鴨肝臟樣本中的總DNA進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，BP0018能使血清和肝臟中的DHBV DNA顯著降低，且停藥后無(wú)明顯反跳現(xiàn)象，表明其可抑制感染雛鴨體內(nèi)DHBV DNA的復(fù)制。研究結(jié)果也證實(shí)，BP0018對(duì)感染鴨無(wú)明顯不良反應(yīng)，動(dòng)物耐受性良好。此外，該課題組還應(yīng)用此動(dòng)物模型進(jìn)行TLR7受體激動(dòng)劑、恩曲他濱類似物和共價(jià)閉環(huán)DNA(cccDNA)抑制劑等化合物的體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)(研究結(jié)果未發(fā)表)，側(cè)面說(shuō)明此動(dòng)物模型具有較高的可靠性。

除核苷類似的小分子化合物以外，核酸聚合物也是一大類抗HBV化合物，此類化合物的研究也常用DHBV感染動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行。法國(guó)里昂大學(xué)的研究人員在一項(xiàng)臨床前研究中評(píng)估了核酸聚合物REP 2139-Ca(REP 2139的鈣螯合物)與替諾福韋(TDF)和恩替卡韋(ETV)的組合在DHBV動(dòng)物模型體內(nèi)的藥效[9]，重點(diǎn)關(guān)注這種新的藥物組合清除肝臟中的病毒表面抗原的能力。利用雛鴨感染DHBV的慢性DHBV攜帶模型，單用REP 2139-Ca或TDF，REP 2139-Ca+TDF組合以及REP 2139-Ca+TDF+ETV組合，處理28日齡鴨子4周，停藥后繼續(xù)跟蹤8周。利用ELISA方法監(jiān)測(cè)血清DHBsAg 和anti-DHBsAg抗體并利用qPCR技術(shù)監(jiān)測(cè)血清DHBV DNA、肝臟DHBV DNA和共價(jià)閉環(huán)DNA(cccDNA)，評(píng)估藥物組合的抗病毒活性。結(jié)果顯示，相比于單用TDF組，組合治療組在停藥后2個(gè)月內(nèi)顯著減少了大部分鴨子的肝臟中病毒DNA和cccDNA數(shù)量，達(dá)到了對(duì)感染的持續(xù)性控制。更重要的是，組合治療還清除了所有鴨子肝臟中的DHBsAg，顯示出功能性控制。研究人員還觀察到了REP 2139-Ca與TDF或者TDF+ETV的協(xié)同效果。此外，早在2003年該研究組成員就曾利用DHBV慢性感染北京鴨模型研究了阿德福韋(ADV)聯(lián)合DNA疫苗的抗病毒效果[10]，并于2015年報(bào)道了多種核酸聚合物的抗DHBV感染能力[11]，最近又報(bào)道了REP 2139單體與TDF和ETV的組合抗DHBV感染的協(xié)同效果[12]。

1.2 體外研究

DHBV感染動(dòng)物模型除了用于進(jìn)行體內(nèi)研究以外，還可以進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)大規(guī)模篩選化合物。美國(guó)德雷克塞爾大學(xué)醫(yī)學(xué)院的郭海濤和郭巨濤等通過(guò)基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)篩選特異性抑制cccDNA形成[13]和抑制HBV核衣殼組裝[14]的小分子抑制劑。在前一項(xiàng)研究中，他們采用了創(chuàng)新性的基于細(xì)胞的cccDNA實(shí)驗(yàn)篩選了包含8.5×104萬(wàn)個(gè)類藥化合物，得到了兩個(gè)能夠抑制cccDNA產(chǎn)生的雙取代磺胺類化合物(DSS)。進(jìn)一步機(jī)制研究中證實(shí)DSS化合物既不直接抑制HBV DNA復(fù)制也不降低病毒聚合酶活性，而是同時(shí)降低cccDNA與其可能的前體“脫蛋白松弛環(huán)狀DNA(DP-rcDNA)”的水平，其機(jī)制可能為妨礙rcDNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏ccDNA。此外證明了其中一個(gè)化合物能夠減少DHBV陽(yáng)性鴨血清感染的1周齡雛鴨原代肝細(xì)胞中cccDNA的生物合成。后一項(xiàng)研究中，他們?cè)俅瓮ㄟ^(guò)基于細(xì)胞的篩選實(shí)驗(yàn)，篩選了包含26 900個(gè)小分子的化合物庫(kù)，發(fā)現(xiàn)一系列氨磺酰苯甲酰胺(SBA)衍生物能夠顯著減少細(xì)胞質(zhì)中HBV DNA的數(shù)量。構(gòu)效關(guān)系(SAR)研究發(fā)現(xiàn)了一組雙氟取代SBA對(duì)人肝癌細(xì)胞中的HBV具有亞微摩爾級(jí)抗病毒活性。通過(guò)機(jī)制分析揭示了這些化合物可以劑量依賴性地抑制HBV而非WHV和DHBV的核衣殼蛋白形成。雖然研究工作是在人肝癌細(xì)胞中進(jìn)行的，但是同時(shí)評(píng)估不同物種的乙肝病毒對(duì)將來(lái)選擇合適的動(dòng)物模型以研究化合物的體內(nèi)抗病毒功效具有重要意義。

近日，中國(guó)鄭州大學(xué)的研究人員設(shè)計(jì)、合成和評(píng)估了一系列新的抗HBV核苷衍生物[15]。在細(xì)胞模型中5 μmol/L的合成化合物顯示出與20 μmol/L的陽(yáng)性化合物拉米夫定(LAM)相當(dāng)?shù)幕钚?，在DHBV感染的鴨模型中，化合物1a顯著降低了血清和肝臟DHBV DNA(67.4%和53.3%)。模擬的復(fù)合體結(jié)構(gòu)顯示化合物1a主要通過(guò)氫鍵和范德華力穩(wěn)定與HBV DNA聚合酶的結(jié)合。

綜上，DHBV動(dòng)物模型不論在篩選、評(píng)價(jià)抗病毒化合物，還是評(píng)估組合治療協(xié)同效果方面均具有廣泛的應(yīng)用。此外，DHBV動(dòng)物模型既可以用于體內(nèi)研究也可以用于體外篩選。

2 病理機(jī)制研究中的應(yīng)用

DHBV對(duì)鴨胚和雛鴨的感染效率高，而對(duì)成鴨的感染效率低下，且呈垂直傳播，這與HBV的傳播基本一致。因此利用DHBV感染動(dòng)物模型進(jìn)行機(jī)制研究，可以很好地揭示HBV的作用機(jī)制。

2.1 感染成功率影響因素研究

分析影響DHBV感染效率的因素可以更好地理解和應(yīng)用這一模型。澳大利亞悉尼大學(xué)的研究人員比較了不同日齡(1日齡和28日齡)鴨感染DHBV的早期階段的響應(yīng)情況，以確定感染結(jié)果的差異是否與宿主先天免疫響應(yīng)的差異有關(guān)[16]。在成鴨中接種DHBV的早期階段可以觀察到肝細(xì)胞中α-干擾素的誘導(dǎo)生成，并且通過(guò)招募的效應(yīng)淋巴細(xì)胞得到迅速加強(qiáng)，直接或間接引起感染肝細(xì)胞的凋亡和消除。而在1日齡鴨的肝臟中缺乏淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，表明1日齡鴨的先天免疫網(wǎng)絡(luò)缺乏效率。研究結(jié)果表明在DHBV感染的早期階段，缺乏先天免疫而非獲得性免疫是雛鴨持續(xù)感染DHBV 的重要原因。

中國(guó)華中科技大學(xué)的研究人員探討了不同種雛鴨DHBV感染的影響因素[17]。發(fā)現(xiàn)不同種鴨的DHBV自然感染率不同，實(shí)驗(yàn)用3種鴨的自然感染率在8.75%～17.8%范圍內(nèi)，而不同鴨種對(duì)人工感染率的影響不明顯。研究人員比較了靜脈注射和腹腔注射感染率的差異，發(fā)現(xiàn)二者都可以使雛鴨感染DHBV，但靜脈注射感染率(80%)高于腹腔注射(65%)。實(shí)驗(yàn)中混合喂養(yǎng)中人工感染的雛鴨并不會(huì)使未自然感染的雛鴨被感染，提示DHBV傳播主要以垂直傳播為主，水平傳播途徑對(duì)DHBV的傳播影響較小。雛鴨感染后體內(nèi)高病毒載量可持續(xù)20 d以上，不同種鴨感染DHBV后使用抗病毒藥物處理的效果一致。

2.2 病毒復(fù)制感染機(jī)制研究

相比于轉(zhuǎn)基因HBV小鼠模型，DHBV動(dòng)物模型的優(yōu)勢(shì)之一在于可檢測(cè)到cccDNA，并且其能夠自我復(fù)制，因此可用于研究病毒的復(fù)制感染機(jī)制。澳大利亞阿德萊德大學(xué)的研究人員利用DHBV感染鴨模型研究了殘余DHBV cccDNA的維持是否依賴于正在進(jìn)行的病毒DNA合成[18]。從急性DHBV感染中恢復(fù)的鴨被分為兩組，分別使用抗病毒藥物ETV或者安慰劑處理，90 d后進(jìn)行肝組織活檢，并未觀察到cccDNA的穩(wěn)定性或者殘余cccDNA的水平有顯著差異，說(shuō)明ETV并未使殘余DHBV cccDNA的整體水平下降。結(jié)果提示殘余DHBV cccDNA高度穩(wěn)定，其維持并不依賴于正在進(jìn)行的病毒DNA合成。此外，分析表明殘余的被感染的細(xì)胞以相似的速率轉(zhuǎn)變周圍未被感染的肝細(xì)胞，或許意味著殘余的被感染細(xì)胞中的病毒基因表達(dá)被高度抑制。整體結(jié)果說(shuō)明慢性HBV感染中，殘余DHBV cccDNA穩(wěn)定，其消除可能依賴于免疫介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

法國(guó)里昂大學(xué)的研究人員在DHBV感染鴨模型中研究了細(xì)胞因子(IL-2，IFN-γ)基因與DNA疫苗共遞送對(duì)DHBV DNA復(fù)制的抑制效果，并分析了殘存DHBV cccDNA的肝勻漿的感染性[19]。經(jīng)過(guò)連續(xù)的DNA疫苗接種聯(lián)合白細(xì)胞介素2(IL-2)和干擾素(IFN)-γ質(zhì)粒注射，鴨肝臟中僅可檢測(cè)到痕量cccDNA。然而將這些肝勻漿接種到無(wú)DHBV雛鴨體內(nèi)，則會(huì)引起高水平的DHBV感染。結(jié)果表明IFN-γ可以增強(qiáng)DNA疫苗的免疫治療效果，更重要的是肝臟中微量的cccDNA就可以引起非常高滴度的感染，提示需要預(yù)防肝臟移植導(dǎo)致的HBV傳播。

2.3 治療策略研究

當(dāng)前的乙肝治療策略還無(wú)法根除乙肝病毒的cccDNA，因此提出新的治療策略并應(yīng)用新的技術(shù)手段進(jìn)行研究相當(dāng)重要。cccDNA以游離的微小染色體形式存在于被感染肝細(xì)胞的細(xì)胞核中，充當(dāng)病毒mRNA合成的轉(zhuǎn)錄模板。隨著研究的深入，調(diào)控染色質(zhì)的表觀遺傳學(xué)修飾成為一個(gè)有潛力的方向[20]。德雷克塞爾大學(xué)的郭巨濤等使用DHBV體外細(xì)胞模型進(jìn)行表觀遺傳調(diào)控研究[21]，他們建立了一套實(shí)驗(yàn)方法來(lái)模擬被病毒感染的肝細(xì)胞，在該模型中DHBV的前基因組(pg)RNA轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制只依賴于cccDNA。研究結(jié)果顯示cccDNA轉(zhuǎn)錄需要組蛋白去乙?；富钚裕蓴_素(IFN)-α對(duì)cccDNA轉(zhuǎn)錄的持久抑制與其減少cccDNA微小染色體中的組蛋白H3K9和H3K27的甲基化有關(guān)。此外還觀察到一些組蛋白去乙?；傅囊种苿┛梢砸种芻ccDNA轉(zhuǎn)錄并以劑量依賴方式減少HBV復(fù)制。

最近，規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(CRISPR)/CRISPR相關(guān)蛋白9(Cas9)系統(tǒng)被當(dāng)作強(qiáng)大有效的工具用于病毒基因組編輯。首都醫(yī)科大學(xué)和鄭州大學(xué)的研究者[22]從DHBV感染雛鴨的肝臟中提取原代肝細(xì)胞，研究了CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向抑制DHBV DNA尤其是cccDNA的效果，并且評(píng)估了CRISPR/Cas9系統(tǒng)和ETV的組合效果。研究發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)靶向DHBV基因組的單一導(dǎo)向RNA(sgRNAs)可以成功抑制DHBV總DNA和cccDNA，且ETV可以增強(qiáng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)DHBV總DNA的抑制效果。這一發(fā)現(xiàn)表明靶向DHBV基因組特定位點(diǎn)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)可能成為一種有效技術(shù)用于抑制原代鴨肝細(xì)胞的DHBV感染。此研究還有待于進(jìn)一步的體內(nèi)驗(yàn)證。

中國(guó)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究者設(shè)計(jì)了表達(dá)包膜和衣殼融合蛋白的DHBV DNA疫苗來(lái)增強(qiáng)鴨子的免疫響應(yīng)廣度[23]。用減毒鼠傷寒沙門菌作為載體和佐劑來(lái)提高免疫響應(yīng)的強(qiáng)度?；谶@種策略，產(chǎn)生了新的DNA疫苗(SL7207-pVAX1-LC和SL7207-pVAX1-SC)。接種這種疫苗的鴨體內(nèi)的CD4和CD8 T基因的轉(zhuǎn)錄水平和抗體(IgY)水平均高于單基因遞送組。此外，DHBV感染后的肝臟中cccDNA拷貝數(shù)也證明了融合疫苗可以增強(qiáng)抗DHBV感染的效果。該研究豐富了科研人員對(duì)DHBV的包膜和衣殼融合蛋白抗原性的理解，并展示了鼠傷寒沙門氏菌在遞送DHBV疫苗方面的價(jià)值。

綜上，DHBV感染動(dòng)物模型在機(jī)制研究方面也具有明顯的優(yōu)勢(shì)，為開(kāi)發(fā)新靶點(diǎn)、新機(jī)制的抗HBV藥物、疫苗和治療策略提供了強(qiáng)有力的支持作用。

3 總結(jié)和展望

DHBV感染動(dòng)物模型在藥物研發(fā)領(lǐng)域和疾病機(jī)制研究領(lǐng)域具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用，為廣大科研工作者提供了一種方便、經(jīng)濟(jì)、高效的研究工具。分析其原因主要有以下幾個(gè)方面:(1)模型獲取容易：相比于哺乳動(dòng)物，鴨的來(lái)源更廣泛，飼養(yǎng)條件更簡(jiǎn)單，繁殖周期更短，且DHBV不會(huì)感染人，具有更安全的特點(diǎn)；(2)感染成功率高：不同種屬鴨子的自然感染率雖然存在差異，但是不同鴨種對(duì)人工感染率的影響不明顯，靜脈注射比腹腔注射具有更高的感染率；(3)病毒復(fù)制機(jī)制相似：DHBV的復(fù)制機(jī)制與HBV高度一致，不同于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，DHBV感染鴨體內(nèi)的病毒可自我復(fù)制且可以垂直傳播，此外，由于模型動(dòng)物的血液中存在完整的病毒顆粒且肝臟中存在cccDNA，用鴨血清或肝勻漿接種原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞后可以感染細(xì)胞，因此可以用于大規(guī)模體外實(shí)驗(yàn)；(4)可出現(xiàn)肝臟病理?yè)p傷：DHBV動(dòng)物模型在一定時(shí)間以內(nèi)能夠持續(xù)高表達(dá)DHBV DNA，而且會(huì)引起肝臟的病理性損傷，這也是和HBV全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠最主要的區(qū)別。

綜上所述，DHBV動(dòng)物模型不但可以用于評(píng)價(jià)抗病毒藥物，也能用于研究肝炎、肝癌病理機(jī)制，是目前為止該領(lǐng)域內(nèi)最方便可靠的動(dòng)物模型。雖然DHBV動(dòng)物模型具有諸多優(yōu)勢(shì)，但是不可否認(rèn)目前尚無(wú)任何單一模型可以準(zhǔn)確反映出HBV感染的所有特征，今后的研究中仍需結(jié)合多種模型進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。