張苗苗 郭曉鵬 劉瑞媛 馬良 高越 陸棟 李文建

摘 要 采用超高效液相色譜-電噴霧離子化-質(zhì)譜（UHPLC-ESI-MS）技術(shù)，結(jié)合多元變量及單變量的數(shù)據(jù)分析方法，研究了重離子束輻射后線(xiàn)粒體受損的釀酒酵母（ResD-4）的脂質(zhì)代謝組學(xué)。檢測(cè)了對(duì)照組（Control）及ResD-4的脂質(zhì)代謝物組成，共鑒定出648種脂質(zhì)分子。研究結(jié)果表明，正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）能準(zhǔn)確區(qū)分ResD-4與Control的脂質(zhì)代謝物；通過(guò)變量權(quán)重值（VIP）、變異倍數(shù)（FC）、差異性（p）分析相結(jié)合，最終篩選出甘油二酯（DG）（16∶0/18∶1）、溶血磷脂酰膽堿（LPC）（18∶0）、溶血磷脂乙醇胺（LPE）（16∶0）、溶血磷脂酰肌醇（LPI）（18∶0）、溶血磷脂酰絲氨酸（LPS）（18∶0）、磷脂酸（PA）（16∶0/18∶0）、磷脂酰膽堿（PC）（31∶0）、磷脂酰乙醇胺（PE）（16∶0/10∶0）、磷脂酰肌醇（PI）（15∶0/18∶0）、磷脂酰絲氨酸（PS）（16∶0/16∶0）、硫代異鼠李糖甘油二酯（SQDG）（37：4）和硫代異鼠李糖甘油二酯（SQDG）（15∶0/16∶0/18∶0）共12個(gè)亞類(lèi)、54種顯著性差異脂質(zhì)分子； 顯著性差異脂質(zhì)分子表達(dá)量分析顯示，ResD-4中DG、TG、SQDG、PA、PC、PI、LPC、LPE、LPI的表達(dá)量上調(diào)，PE、PS、LPS的表達(dá)量下調(diào)。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)釀酒酵母可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)成分的含量來(lái)應(yīng)對(duì)重離子束輻射引起的線(xiàn)粒體損傷，顯著性差異脂質(zhì)分子可能是重離子束輻射誘導(dǎo)釀酒酵母線(xiàn)粒體損傷后的潛在標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞 脂質(zhì)組學(xué)； 重離子； 線(xiàn)粒體損傷； 釀酒酵母； 超高效液相色譜-電噴霧離子化-質(zhì)譜

1 引 言

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為酵母種屬中最重要的一類(lèi)，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)代謝快、 兼具真核生物的分子基礎(chǔ)和遺傳學(xué)特性等特點(diǎn)，已成為收集真核細(xì)胞生物信息的主要模式生物[1]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，研究人員破譯了酵母全基因組信息后[2]，對(duì)酵母的研究重點(diǎn)從獲得其全部遺傳信息逐漸轉(zhuǎn)移到解析遺傳信息所表征的生物學(xué)功能方面，由此促進(jìn)了蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的迅速發(fā)展。2003年Han和Gross提出了脂質(zhì)組學(xué)（Lipidomic）的概念[3]。 脂質(zhì)組學(xué)屬于代謝組學(xué)中的一個(gè)分支，是對(duì)生物體整體脂質(zhì)進(jìn)行分析的一門(mén)新興學(xué)科[4]。目前， 脂質(zhì)組學(xué)檢測(cè)一般采用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用及直接進(jìn)樣質(zhì)譜技術(shù)兩大類(lèi)，分析方法包括非靶向分析[5]和靶向[6]分析兩類(lèi)。非靶向分析也稱(chēng)為全脂分析，能夠?qū)颖局懈黝?lèi)型脂質(zhì)及其代謝物進(jìn)行無(wú)偏向地系統(tǒng)性解析，從中篩選生物標(biāo)志物?；诜前邢蛑|(zhì)組學(xué)分析平臺(tái)，可結(jié)合LipidSearchTM軟件進(jìn)行脂質(zhì)鑒定與數(shù)據(jù)預(yù)處理，LipidSearchTM是細(xì)胞脂質(zhì)識(shí)別和相對(duì)定量的有力工具，該軟件中收錄了8大類(lèi)、300種亞類(lèi)、約170萬(wàn)種脂質(zhì)分析的MS2及MS3數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究主要使用LipidSearch software version 4.1對(duì)采集到的圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

與哺乳動(dòng)物細(xì)胞及其它微生物相比，酵母脂質(zhì)組簡(jiǎn)單，脂質(zhì)代謝調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)比例較高，磷脂及麥角固醇等脂質(zhì)類(lèi)生物合成代謝途徑清晰明確[7，8]。近年來(lái)，酵母脂質(zhì)組學(xué)研究主要集中在生物標(biāo)志物及生物過(guò)程優(yōu)化等方面。例如，磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇和磷脂酸可作為呋喃、苯酚、醋酸耐受酵母的生物標(biāo)志物[9]； 對(duì)22株工業(yè)釀酒酵母的發(fā)酵參數(shù)及脂質(zhì)組進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)酵母乙醇產(chǎn)量低與早期較高水平的磷脂酰肌醇有關(guān)，乙醇產(chǎn)量高與磷脂酰膽堿有關(guān)[10]。酵母脂質(zhì)組學(xué)的研究已擴(kuò)展到酵母不同生長(zhǎng)階段脂質(zhì)變化的靈活性、酵母細(xì)胞膜和完整線(xiàn)粒體脂質(zhì)檢測(cè)等多個(gè)方面。如Klose等[11]發(fā)現(xiàn)，在酵母的整個(gè)生長(zhǎng)階段，甘油三酯（TG）的含量一直呈穩(wěn)定增加趨勢(shì)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期TG的含量是早期的兩倍； 而磷脂酰肌醇（PI）在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的含量比早期下降了75%，磷脂酰膽堿（PC）的含量在整個(gè)生長(zhǎng)周期中未發(fā)生明顯變化。Blagovic′等[12]對(duì)比分析了啤酒酵母細(xì)胞膜和線(xiàn)粒體脂質(zhì)的組成，發(fā)現(xiàn)PI在細(xì)胞膜、PC在線(xiàn)粒體中的含量最高，分別占37%和30%，細(xì)胞膜中性脂質(zhì)的含量是線(xiàn)粒體的2倍多，并且這兩種細(xì)胞器中的脂肪酸以不飽和脂肪酸為主，棕櫚酸是其主要成分。Angelini等[13]采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF/MS）技術(shù)，以Tetra-myristoyl-CL（14∶0）為內(nèi)標(biāo)，量化了野生酵母及兩株心磷脂（CL）缺陷型酵母完整線(xiàn)粒體脂質(zhì)的含量，建立了一種心磷脂檢測(cè)的技術(shù)方法。以上研究分別對(duì)酵母生長(zhǎng)過(guò)程、 細(xì)胞膜及線(xiàn)粒體的脂質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)分析，但是酵母線(xiàn)粒體損傷如何影響細(xì)胞脂質(zhì)代謝的研究還未見(jiàn)報(bào)道。電離輻射產(chǎn)生的大量自由基對(duì)細(xì)胞線(xiàn)粒體造成損傷后[14]，可能會(huì)引起包括三羧酸循環(huán)和脂質(zhì)代謝在內(nèi)的碳代謝途徑發(fā)生變化。重離子束是重離子加速器將大量的比α粒子重的離子加速到很高的速度（甚至接近光速）形成的帶有能量的射線(xiàn)[15]，重離子束輻射作為一種高線(xiàn)性能量轉(zhuǎn)移輻射，作用于生物體時(shí)產(chǎn)生大量自由基，會(huì)造成單個(gè)堿基替換、DNA雙鏈斷裂和團(tuán)簇?fù)p傷[16]，也會(huì)引起活細(xì)胞線(xiàn)粒體局部膜電位快速消失[17]、酵母細(xì)胞膜通透性改變等生物現(xiàn)象[18]。Cao等[18]以釀酒酵母為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)重離子束輻射會(huì)導(dǎo)致酵母細(xì)胞膜通透性和完整性發(fā)生不可逆的改變，并且細(xì)胞膜通透性的增加以及酯酶活性的下降與輻射劑量具有顯著相關(guān)性。本研究針對(duì)重離子束輻射對(duì)釀酒酵母線(xiàn)粒體損傷后脂質(zhì)代謝輪廓進(jìn)行研究，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析方法篩選出差異性顯著的脂質(zhì)代謝物，結(jié)合代謝通路分析了線(xiàn)粒體損傷后釀酒酵母脂質(zhì)變化的機(jī)理。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

重離子加速器（中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所， 中國(guó)科學(xué)院蘭州重離子加速器國(guó)家實(shí)驗(yàn)室）； UHPLC Nexera LC-30A超高效液相色譜儀（日本SHIMADZU公司）； Q-Exactive Plus質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo公司）； ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱（100 mm× 2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司）； 5430R低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）； MP Fastprep-24勻漿儀器（美國(guó)MP Biomedicals公司）； BILON-1000Y超聲儀（上海比朗儀器制造有限公司）； 恒溫?fù)u床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

乙腈、異丙醇和甲醇（色譜純，美國(guó)Thermo公司）； 甲基叔丁基醚（Methyl Tert Butyl Ether，MTBE，分析純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）； 甲酸銨（質(zhì)譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）； YPD培養(yǎng)基：1%酵母膏（生物試劑，英國(guó)OXOID公司）、2%蛋白胨（生物試劑，中國(guó)北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、2%葡萄糖（分析純，中國(guó)天津市大茂化學(xué)試劑廠）溶于水后，121℃高壓滅菌20 min，冷卻后備用； 實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）制備的超純水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 釀酒酵母樣品前處理及收集 釀酒酵母BY4743（Saccharomyces cerevisiae BY4743），購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC），為對(duì)照組（Control）。使用中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所重離子加速器國(guó)家實(shí)驗(yàn)室提供的能量為80 MeV/u的碳離子束對(duì)Control樣本進(jìn)行輻射處理，輻射劑量分別為90、120、150 Gy。以酵母2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）反應(yīng)無(wú)顯色、菌落形態(tài)變小、對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)時(shí)間倍增為篩選依據(jù)，90Gy時(shí)篩選得到兩株線(xiàn)粒體受損的酵母ResD-1、ResD-2，120 Gy時(shí)篩選得到兩株線(xiàn)粒體受損的酵母ResD-3和ResD-5，150 Gy時(shí)篩選得到一株線(xiàn)粒體受損的酵母ResD-4。Control和ResD-1、ResD-2、ResD-3、ResD-4、ResD-5分別接種于YPD培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.55（對(duì)數(shù)期）時(shí)收集酵母菌體，PBS溶液清洗兩次后的菌體沉淀，先液氮冰浴，再保存在80℃冰箱備用。每組樣本制備6個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣品。

2.2.2 脂質(zhì)代謝物提取 （1）脂質(zhì)代謝物的提取[19] 分別取100 μL解凍后的Control及ResD-1、ResD-2、ResD-3、ResD-4、ResD-5樣本于10℃ 5000 g 離心5 min后收集菌體沉淀，再分別加入200 μL純凈水混勻，勻漿2次再加入240 μL預(yù)冷甲醇及800 μL MTBE渦旋混合，冰水浴中超聲20 min，室溫靜置30 min，于10℃、14000 g離心15 min，取上層有機(jī)相后氮?dú)獯蹈桑?質(zhì)譜分析前，所有樣品加入200 μL異丙醇溶液復(fù)溶并渦旋，離心除去不溶物后再進(jìn)行檢測(cè)。（2）質(zhì)量控制（Quality control，QC）樣品的制備稱(chēng)取等量Control、ResD-1、ResD-2、ResD-3、ResD-4、ResD-5酵母樣本混合均勻后，按照上述樣品處理過(guò)程處理，所得代謝提取物作為質(zhì)量控制樣品。

2.3 UHPLC-ESI-MS分析條件

2.3.1 色譜條件 流動(dòng)相A為含10 mmol/L甲酸銨的乙腈-水（60∶40， V/V）， 流動(dòng)相B為含10 mmol/L甲酸銨的乙腈-異丙醇（10∶90， V/V）。洗脫梯度： 0～7 min，30% B； 7～25 min，30%～100% B； 25～30 min， 30%B。柱溫45℃， 流速300 μL/min， 進(jìn)樣量2 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 分別采用電噴霧電離（ESI）正、負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)。正、負(fù)離子掃描模式參數(shù)設(shè)置為：氣化溫度300℃，鞘氣流速45 arb，輔助氣流速15 arb，吹掃氣流速1 arb； 正、負(fù)離子噴霧電壓分別設(shè)為3000和2500 V； 毛細(xì)管溫度350℃； 正、負(fù)離子S透鏡放射頻率分別為50%和60%； 正、負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍分別為m/z 200～1800和m/z 250～1800； 在m/z 200 時(shí)，一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜分辨率分別為70000和17500。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用LipidSearch software version 4.1（Thermo ScientificTM， America）軟件對(duì)采集到的LC-MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰識(shí)別、脂質(zhì)鑒定（二級(jí)鑒定）、峰提取、峰對(duì)齊、定量等處理。所得數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)總峰面積歸一化并刪除組內(nèi)缺失值>50%的脂質(zhì)分子， 處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P（Version 14.1， Umetrics， Sweden）， 經(jīng)Pareto-scaling預(yù)處理后依次進(jìn)行以下分析： （1）UHPLC-ESI-MS分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性，（2）正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA），（3）脂質(zhì)分子單變量統(tǒng)計(jì)分析：變異倍數(shù)（Fold change， FC）及差異性（p），（4）顯著性差異脂質(zhì)分子表達(dá)量分析。篩選差異脂質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)為：FC>2.0或<0.5且p<0.05； 篩選顯著性差異脂質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)為：變量權(quán)重值（Variable importance for the projection， VIP）>1， p <0.05， FC>2.0或FC<0.5。

3 結(jié)果與討論

3.1 UHPLC-ESI-MS分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性

分析系統(tǒng)穩(wěn)定性是獲得實(shí)驗(yàn)可靠性數(shù)據(jù)的前提，本研究在正、負(fù)離子模式下檢測(cè)了6株酵母（Control、ResD-1、ResD-2、ResD-3、ResD-4、ResD-5）36個(gè)樣品的脂質(zhì)代謝物，每8個(gè)樣品設(shè)置1個(gè)QC樣品，共設(shè)置了5個(gè)QC樣品評(píng)價(jià)分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性。5個(gè)QC樣品在正、負(fù)離子模式下的超高效液相色譜-軌道離子阱質(zhì)譜基峰圖（UHPLC-Obitrap MS BPC）如圖1所示，QC樣品各色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間重現(xiàn)性良好，說(shuō)明分析系統(tǒng)穩(wěn)定，獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，滿(mǎn)足脂質(zhì)代謝組學(xué)分析要求。

脂質(zhì)組學(xué)的非靶向分析要求盡可能獲得所有脂質(zhì)的信息。本研究采用LipidSearch software version 4.1軟件對(duì)正、負(fù)離子模式下ResD-1、ResD-2、ResD-3、ResD-4、ResD-5/Control酵母脂質(zhì)代謝物進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，ResD-4/Control的差異脂質(zhì)分子種類(lèi)最豐富，所以后續(xù)研究主要針對(duì)ResD-4/Control的脂質(zhì)代謝物結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)分析討論。如圖2所示，ResD-4中共鑒定出的脂質(zhì)分子有648種，涉及25個(gè)亞類(lèi)，而這25個(gè)亞類(lèi)又分別歸于脂肪酸類(lèi)（FA）、甘油脂類(lèi)（DG、TG）、鞘脂類(lèi)（Cer、CerG1、SM、So）、糖脂類(lèi)（MGDG、SQDG）、甘油磷脂類(lèi)（CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS）等主要脂質(zhì)大類(lèi)[20]。

3.2 正交偏最小二乘判別分析

正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）是一種對(duì)偏最小二乘判別分析（PLS-DA）進(jìn)行修正的分析方法，可以濾除與分類(lèi)信息無(wú)關(guān)的噪音[21]，提高模型的解析能力和有效性。本研究中，OPLS-DA作為一種監(jiān)督式投影方法，通過(guò)7次循環(huán)交互驗(yàn)證，使Control和ResD-4樣品在數(shù)據(jù)集中實(shí)現(xiàn)最大分離（圖3A和3B）?；赨HPLC-ESI-MS分析檢測(cè)技術(shù)，ResD-4/Control的648種脂質(zhì)分子的OPLS-DA模型得分圖見(jiàn)圖3A，預(yù)測(cè)主成分t[1]反映了組間差異最大化，正交主成分反映了組內(nèi)變異； 圖3B顯示了ResD-4/Control的OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)圖，Q2表示模型預(yù)測(cè)能力，Q2越大，表示模型的預(yù)測(cè)能力越好； R2Y表示模型解釋率，R2越大表示解釋能力越強(qiáng)[22]； 在正、負(fù)離子模式下，R2Y=0.999，Q2=0.994，R2Y和Q2都大于0.9，表明模型解釋能力和預(yù)測(cè)能力較好，說(shuō)明檢測(cè)到的648脂質(zhì)分子能準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)Control 和ResD-4樣本的組間區(qū)分。此外，根據(jù)OPLS-DA模型得到VIP值，在后續(xù)分析中用于顯著性差異脂質(zhì)的篩選。

3.3 脂質(zhì)分子單變量統(tǒng)計(jì)分析

潛在差異脂質(zhì)標(biāo)志物的篩選是脂質(zhì)代謝組學(xué)研究的重要部分，單變量統(tǒng)計(jì)分析方法可直觀有效的篩選潛在差異脂質(zhì)標(biāo)志物。圖4是ResD-4/Control脂質(zhì)數(shù)據(jù)分析后的火山圖，橫、縱坐標(biāo)分別代表脂質(zhì)代謝物在兩組間FC值的log2FC和p值的lgp，圖中脂質(zhì)數(shù)據(jù)基本呈正態(tài)分布，

紅色方形點(diǎn)顯示部分是ResD-4/Control之間存在的差異脂質(zhì)。在差異脂質(zhì)基礎(chǔ)上，根據(jù)OPLS-DA模型得到變量權(quán)重值（VIP），結(jié)合FC及p值，以VIP>1且p<0.05且FC>2.0或<0.5為標(biāo)準(zhǔn)篩選出54種顯著性差異脂質(zhì)分子[23]，各脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、分子式等參數(shù)詳見(jiàn)表1。表1中包括2個(gè)甘油二酯（DG）、2個(gè)溶血磷脂酰膽堿（LPC）、2個(gè)溶血磷脂乙醇胺（LPE）、1個(gè)溶血磷脂酰肌醇（LPI）、1個(gè)溶血磷脂酰絲氨酸（LPS）、1個(gè)磷脂酸（PA）、7個(gè)磷脂酰膽堿（PC）、5個(gè)磷脂酰乙醇胺（PE）、2個(gè)磷脂酰肌醇（PI）、5個(gè)磷脂酰絲氨酸（PS）、1個(gè)硫代異鼠李糖甘油二酯（SQDG）、25個(gè)硫代異鼠李糖甘油二酯（SQDG）。TG作為酵母細(xì)胞中重要的儲(chǔ)能和供能脂肪，占總顯著性差異脂質(zhì)分子的46.3%，由此可見(jiàn)，重離子束輻射損傷釀酒酵母線(xiàn)粒體后，脂肪代謝途徑受到的影響較為明顯。

FC是代謝物濃度在兩組中的均值之比[24]，顯著性差異脂質(zhì)分子FC的log2FC可直觀判斷脂質(zhì)分子表達(dá)量的變化情況，log2FC>0，表示脂質(zhì)分子表達(dá)量升高； log2FC<0，表示代謝表達(dá)量降低。從表1中l(wèi)og2FC值可見(jiàn)，SQDG、PI、PA、LPI、LPE、LPC、DG及TG的表達(dá)量升高，PE、LPS的表達(dá)量下降，PS的表達(dá)量以下降為主，表達(dá)量升高的顯著性差異脂質(zhì)分子占總顯著性差異脂質(zhì)分子的79.6%。以上變化說(shuō)明，重離子束輻射誘導(dǎo)的釀酒酵母線(xiàn)粒體損傷，會(huì)導(dǎo)致酵母脂質(zhì)代謝途徑發(fā)生紊亂。

3.4 顯著性差異脂質(zhì)分子表達(dá)量分析

相同亞類(lèi)脂質(zhì)中各顯著性差異脂質(zhì)分子表達(dá)量差異明顯，而柱狀圖分析可直觀的表示脂質(zhì)代謝物表達(dá)量的變化情況。如圖5所示，ResD-4/Control中DG、TG、PA、PC、PI、LPC、LPE、LPI、SQDG表達(dá)量升高，PE、PS、LPS表達(dá)量下降。在釀酒酵母脂質(zhì)生物合成過(guò)程中，DG是脂質(zhì)分子合成的重要前體物質(zhì)，代謝途徑多樣，可通過(guò)甘油二酯途徑合成TG，也可在二酰甘油激酶（Dgk1）的作用下合成PA[25]，PA在磷脂酸磷酸水解酶（Pah1）、二酰甘油焦磷酸磷酸水解酶（Dpp1）共同作用下也可分解代謝生成DG。PA在CDP-二酰甘油合成酶（Cds1）作用下生成胞苷二磷酸-甘油二酯（CDP-DG）[26，27]， 該物質(zhì)在磷脂酰肌醇合成酶（Pis1）和磷脂酰絲氨酸合成酶（Pss1）作用下合成PI和PS[28]。在ResD-4中，PI表達(dá)量升高，PS表達(dá)量下降，說(shuō)明在以CDP-DG為底物時(shí)，PI的合成途徑優(yōu)先于PS進(jìn)行。

PC和PE在酵母膜脂質(zhì)中含量較高，線(xiàn)粒體能自主合成一部分PE，而PC則直接依賴(lài)于外部輸入[29，30]。PE可通過(guò)線(xiàn)粒體上的磷脂酸絲氨酸脫羧酶（Psd1）合成[31]，其連續(xù)甲基化后可合成PC[32]。ResD-4是線(xiàn)粒體受損的酵母，PE在線(xiàn)粒體中的合成受阻是造成PE下降的主要原因，當(dāng)PE連續(xù)甲基化合成PC的途徑未被阻斷時(shí)，也可能造成PE表達(dá)量的下降。

LPC、LPE 、LPI、LPS都屬于溶血磷脂，是PC、PE、PI和PS被磷脂酶A等水解而成。在本研究中， LPC、LPI隨PC、PI的升高而升高，LPS隨PS的降低而降低，LPE與PE變化趨勢(shì)相反。LPE在三酰甘油脂肪酶（Tgl3）和溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶（Ale1）共同作用下合成PE，Ale1位于線(xiàn)粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)處，Tgl3主要定位在脂滴上[33，34]，在LPE表達(dá)量升高時(shí)，PE表達(dá)量降低，說(shuō)明輻射影響了酵母線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生交互作用的功能平臺(tái)及脂滴的正常功能，導(dǎo)致LPE合成PE的代謝途徑受阻。SQDG屬于糖脂類(lèi)，常見(jiàn)于植物或藻類(lèi)葉綠體內(nèi)的類(lèi)囊體膜上，在植物光合作用效率、適應(yīng)生態(tài)條件改變等方面起著非常重要的作用[35，36]。與光合作用有關(guān)的色素分布在葉綠體類(lèi)囊體上，而與有氧呼吸相關(guān)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)大部分位于線(xiàn)粒體膜上，從生物學(xué)功能來(lái)說(shuō)葉綠體和線(xiàn)粒體都是能量轉(zhuǎn)換器，共同參與自然界中的碳循環(huán)，所以SQDG在釀酒酵母中的檢出也預(yù)示了糖脂類(lèi)與線(xiàn)粒體功能活動(dòng)密切相關(guān)。

4 結(jié) 論

利用UHPLC-ESI-MS技術(shù)結(jié)合多變量和單變量數(shù)據(jù)分析手段，研究了釀酒酵母Control和線(xiàn)粒體受損酵母ResD-4的脂質(zhì)代謝組學(xué)，共鑒定出54種具有顯著性差異的脂質(zhì)代謝標(biāo)志物。脂質(zhì)分子表達(dá)量結(jié)合代謝通路分析表明，重離子束輻射引起的酵母線(xiàn)粒體受損會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異常，說(shuō)明酵母線(xiàn)粒體功能與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。重離子輻射是一種高效的誘變技術(shù)，與X射線(xiàn)、γ射線(xiàn)等常規(guī)的物理誘變技術(shù)相比，重離子束輻射會(huì)導(dǎo)致生物體DNA出現(xiàn)更多的雙鏈斷裂和團(tuán)簇?fù)p傷，導(dǎo)致更多新的生物性狀產(chǎn)生，因此，重離子束輻射技術(shù)被廣泛用于微生物、植物等的誘變育種。利用重離子束輻射篩選突變體，研究輻射產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)于揭示電離輻射對(duì)生物體的損傷、修復(fù)機(jī)理以及各種代謝途徑的改變具有重要意義。

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