，，

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是以動脈血管壁炎癥改變?yōu)橹鞯穆?、增生性疾病，其發(fā)生發(fā)展過程多認(rèn)為是從變質(zhì)、滲出和增生等炎癥反應(yīng)，到粥樣斑塊的形成，乃至不穩(wěn)定斑塊的破裂和繼發(fā)血栓形成。AS是心腦血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，CVD是一類嚴(yán)重危害人類健康和生命的重大疾病，在世界范圍內(nèi)，每年約1 670萬人死于CVD，占全球死亡率第1位[1]，尤其以AS為病理基礎(chǔ)的CVD成為世界主要的疾病負(fù)擔(dān)，防治AS已成為世界公共衛(wèi)生關(guān)注的熱點。醫(yī)學(xué)界對AS的研究已逾百年，其病因及發(fā)病機制復(fù)雜，除脂代謝異常與動脈內(nèi)脂質(zhì)累積等經(jīng)典因素外，免疫炎癥反應(yīng)也是影響AS發(fā)展的重要原因[2]。巨噬細(xì)胞作為斑塊中炎癥因子的主要來源和免疫應(yīng)答中的主要免疫細(xì)胞，在AS斑塊的進程中起重要作用。

有研究表明，AS斑塊的形成和穩(wěn)定性與巨噬細(xì)胞自體吞噬(自噬)密切相關(guān)。自噬在遺傳進化中是由溶酶體介導(dǎo)的高保守代謝過程，通過降解毒性物質(zhì)及回收利用內(nèi)源性細(xì)胞成分(氨基酸、游離脂肪酸、核苷酸)以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。自噬是影響巨噬細(xì)胞在AS生存的分子細(xì)胞機制，直接影響AS的發(fā)生和發(fā)展進程[3]，深入研究巨噬細(xì)胞自噬與AS關(guān)系，為中藥防治AS提供新途徑和新依據(jù)，從而充分發(fā)揮中藥治療AS的多靶點、多效應(yīng)、不良反應(yīng)少的獨特優(yōu)勢。

1 自噬及其調(diào)控機制

自噬是普遍存在于真核細(xì)胞的一種自我保護現(xiàn)象，包括巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone- mediated autophagy)，巨自噬主要以降解生物大分子及損傷、衰老的細(xì)胞器，即通常所說的自噬，是導(dǎo)致Ⅱ型細(xì)胞死亡(即自體吞噬樣細(xì)胞死亡)的唯一途徑[4- 5]。自噬由脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的吞噬泡包裹降解的物質(zhì)形成自噬體，之后與溶酶體融合，轉(zhuǎn)變?yōu)閱螌幽そY(jié)構(gòu)的自噬溶酶體。溶酶體的酸性環(huán)境及大量水解酶使物質(zhì)變性水解，進一步降解為氨基酸、脂肪酸、糖類及核苷酸等，供細(xì)胞再利用，殘渣排出細(xì)胞[6]。

自噬過程的調(diào)控及自噬體的形成主要依賴于自噬相關(guān)基因(autophagy- associated gene，ATG)，30多種ATG編碼的特殊蛋白參與吞噬泡的成熟、延伸及自噬體與溶酶體的融合，包括Beclin1、ATG16L- ATG5- ATG12復(fù)合物及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3- Ⅱ)- 磷脂酰乙醇胺(PE)復(fù)合物等[7]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule- associated protein 1 light chain 3，LC3)由哺乳動物細(xì)胞ATG8同源染色體編碼，被ATG4活化后迅速將其切割形成LC3- Ⅰ。LC3- Ⅰ在ATG7和ATG16L- ATG5- ATG12作用下，進而與PE共價結(jié)合形式LC3- Ⅱ[8- 9]。LC3- Ⅱ可靶向定位于前自噬體和自噬體膜上，自噬時其表達增加，是目前公認(rèn)的自噬體標(biāo)志分子[10]，常用LC3- Ⅱ評估自噬水平的高低。自噬體膜的延伸依賴泛素樣蛋白質(zhì)系統(tǒng)的協(xié)同作用。

自噬受多種信號通路調(diào)控，其中磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyli- nositol 3- kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳動物西羅莫司靶蛋白(mammalian target ofrapamycin，mTOR)信號通路在自噬中發(fā)揮核心和關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[8，11- 12]。PI3K分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，目前研究較廣泛的是被細(xì)胞表面受體活化的Ⅰ型PI3K。Ⅰ型PI3K是上游關(guān)鍵分子，負(fù)調(diào)節(jié)自噬，它能連接到細(xì)胞膜上進而激活A(yù)kt；也可定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，干擾自噬體膜形成[13]。Ⅲ型PI3K激活時啟動自噬進程，對自噬的調(diào)節(jié)作用較Ⅰ型更重要，Ⅲ型PI3K與下游信號分子Beclin- 1結(jié)合形成激酶復(fù)合物，引發(fā)自噬相關(guān)蛋白在兩大泛素系統(tǒng)的聚積，從而促進自噬。由此可見，Ⅲ型PI3K 的活化對于早期階段自噬囊泡的形成更重要[14]。mTOR能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、運動、存活等，是自噬相關(guān)信號通路核心，mTOR激活可抑制自噬。細(xì)胞因子(如胰島素、胰高血糖素、瘦素)或應(yīng)激(如HBx)等通過PI3K/Akt/mTOR信號通路，參與調(diào)解自噬[15- 17]?；罨腁kt可解除下游結(jié)節(jié)硬化復(fù)合物(tuberous sclerosis complex，TSC1/TSC2)對mTOR的抑制作用，增加mTOR活性[18]。Akt活化減少，使細(xì)胞周期停滯，從而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。研究PI3K/Akt/mTOR信號通路對AS巨噬細(xì)胞自噬過程影響的干預(yù)實驗中，給予AS家兔模型Akt抑制劑比魯卡胺、mTOR抑制劑西羅莫司及mTOR- siRNA干預(yù)后，PI3K/Akt/mTOR作用通路被阻斷，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞自噬被激活，巨噬細(xì)胞白細(xì)胞介素(IL)- 10水平顯著降低，干擾素- γ(IFN- γ)分泌增加，表明炎癥反應(yīng)降低，從而穩(wěn)定AS斑塊，減少斑塊破裂[12]。

2 AS中細(xì)胞自噬的雙重作用

自噬主要功能可看作是“清洗”不需要的大分子物質(zhì)，是細(xì)胞內(nèi)重要的降解體系及自我修復(fù)過程，有助于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。大量證據(jù)表明，人類斑塊樣本的所有細(xì)胞均檢測到自噬水平的增高，且存在血管自噬樣特性：髓鞘樣結(jié)構(gòu)、細(xì)胞質(zhì)泛素化包涵體聚積及空泡形成增多[19]。在AS斑塊溶解產(chǎn)物及主動脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)纖維帽中，LC3- Ⅱ含量表達增加，在非AS血管中未檢測到LC3- Ⅱ，表明在AS中自噬被誘導(dǎo)[8]。目前研究表明其作用具有雙重性，病變早期，自噬作為潛在的補償機制，維持體內(nèi)平衡；病變后期，自噬作為細(xì)胞持續(xù)應(yīng)激或無法防御的致病過程的適應(yīng)性反應(yīng)，失調(diào)或過度激活直接影響細(xì)胞的存活[20- 21]。

2.1 適度細(xì)胞自噬抑制AS發(fā)展 自噬通過阻斷氧化應(yīng)激誘發(fā)炎癥過程抑制斑塊進展，敲除自噬基因Beclin- 1和ATG5后，斑塊中的炎性標(biāo)志物明顯增加，表明自噬功能缺失(主要是巨噬細(xì)胞)與炎癥之間存在密切關(guān)系[22]。有研究認(rèn)為，自噬功能缺失時細(xì)胞凋亡增加(主要是巨噬細(xì)胞)，同時巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的識別能力下降，無法正常清除死細(xì)胞，使得斑塊壞死增多，引發(fā)急性冠脈綜合征[3]。因此，自噬相關(guān)基因缺失引起細(xì)胞對凋亡和壞死的敏感性。體內(nèi)外實驗研究表明，選擇性抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬，抑制炎性反應(yīng)，繼而穩(wěn)定AS易損斑塊[14]。自噬可降低巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯水平，敲除自噬基因后膽固醇酯明顯增多，同時泡沫細(xì)胞形成增加。自噬除可抗斑塊細(xì)胞凋亡外，還降低循環(huán)中含載脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)的脂蛋白含量，從而減輕脂質(zhì)對AS斑塊的進一步損害。這些研究從不同方面證實基礎(chǔ)水平自噬對AS是有益的，有利于阻礙或減緩AS斑塊形成和維持斑塊的穩(wěn)定性。

2.2 過度細(xì)胞自噬影響斑塊的穩(wěn)定性 基礎(chǔ)水平的自噬可抑制AS發(fā)展，但過度自噬常引起細(xì)胞死亡，而VSMC和血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)死亡不利于斑塊的穩(wěn)定性。VSMC減少表明膠原合成減少和斑塊纖維帽的變薄，VEC受損最終引起血栓的形成。De Meyer等[23]研究采用Toll樣受體7(Toll- like receptor 7，TLR7)配體藥物咪喹莫特干預(yù)AS模型兔子的頸動脈，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬，但誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡同時引起大量炎癥因子釋放并刺激血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule- 1，VCAM- 1)的表達和白細(xì)胞的滲透。有研究表明，自噬引起的細(xì)胞死亡誘發(fā)許多細(xì)胞因子的釋放，如IL- 1β、IL- 6及TNF- α，進而引起炎癥反應(yīng)[24]。嚴(yán)重的氧化應(yīng)激和自噬形成蠟樣體，蠟樣體是一種蛋白質(zhì)和氧化脂質(zhì)結(jié)合形成的復(fù)合體，無法被溶酶體水解酶清除且能吸引大量溶酶體酶，使自噬體與溶酶體的結(jié)合受限，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[25]。因此，細(xì)胞的自噬性死亡促進不穩(wěn)定斑塊的形成。

3 巨噬細(xì)胞自噬與AS

3.1 巨噬細(xì)胞分類及在AS中的作用 巨噬細(xì)胞是AS早期出現(xiàn)泡沫細(xì)胞的主要來源，且在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。單核細(xì)胞主要分化為兩種類型：M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞。在AS硬化損傷部位，M1和M2兩種亞型的巨噬細(xì)胞均存在，且具有極化性。M1巨噬細(xì)胞型具有促炎作用，在IFN- γ存在條件下被脂多糖(LPS)激活，導(dǎo)致IL- 2、IL- 23、IL- 6、IL- 1和TNF- α的表達量升高，加快AS進程。相反，活化的M2型巨噬細(xì)胞具有抗炎修復(fù)作用，在IL- 4、IL- 13、IL- 1或維生素D3存在條件下，釋放大量IL- 10、清道夫受體(scavenger receptor，SR)、甘露糖受體和精氨酸酶[26- 27]，促進斑塊纖維組織形成，減輕斑塊組織損傷并增加斑塊穩(wěn)定性。Khallou- Lasehet等[28]采用小鼠模型解釋巨噬細(xì)胞表型與AS之間的關(guān)系，模型中分別采用精氨酸酶1和精氨酸酶2分別標(biāo)記M2和M1型巨噬細(xì)胞。早期病變中，浸潤的巨噬細(xì)胞是M2型，但M1型巨噬細(xì)胞在大齡老鼠的粥樣斑塊中占優(yōu)勢，說明病變進展與M2型巨噬細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞哪個占主導(dǎo)地位密切相關(guān)，早期病變中以促進炎癥為特點，之后是抗炎[29]。氧化型低密度脂蛋白(ox- LDL)是導(dǎo)致AS的重要因素，通過多種途徑參與AS的形成過程，是AS形成的始動因素[30]。當(dāng)血管壁受到ox- LDL損傷時，產(chǎn)生趨化因子，單核細(xì)胞遷移于內(nèi)膜下分化成巨噬細(xì)胞，通過受體特異性攝取ox- LDL，同時分泌炎癥因子刺激更多單核細(xì)胞進入血管內(nèi)膜導(dǎo)致巨噬細(xì)胞增殖，受體SR- A與ox- LDL結(jié)合后，使其無限制吞噬ox- LDL，當(dāng)ox- LDL超過巨噬細(xì)胞的代謝能力時，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞[31]。泡沫細(xì)胞清除率降低及泡沫細(xì)胞凋亡進一步激活炎癥反應(yīng)，SR上調(diào)形成惡性循環(huán)，促進血管內(nèi)膜生長與壞死核的形成，增加斑塊破裂的風(fēng)險[32]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)在眾多炎癥與慢性疾病(如AS、冠心病、癌癥等)的生理病理過程中起重要作用。在AS進程中，ROS蓄積引起氧化應(yīng)激，直接導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂類與DNA損傷，引發(fā)細(xì)胞死亡或凋亡，且巨噬細(xì)胞參與ROS中間產(chǎn)物、組織蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶的合成或分泌，加劇血管內(nèi)膜的毒性環(huán)境。斑塊內(nèi)毒性環(huán)境的危險因素包括壞死與凋亡細(xì)胞的碎片、組織缺氧、ROS水平升高及脂質(zhì)的積累[33- 34]。巨噬細(xì)胞自噬作為一種代償機制，能減輕上述因素對斑塊的不良影響。

3.2 巨噬細(xì)胞自噬對AS的影響 與AS密切相關(guān)的血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞存在一定程度的自噬。相對于前兩者，巨噬細(xì)胞屬于單核- 吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，前體為從骨髓進入血液循環(huán)的單核細(xì)胞，從內(nèi)皮滲出到組織并分化而成的免疫細(xì)胞。目前自噬在巨噬細(xì)胞中的抗AS作用研究較多。

自噬具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化功能的作用，可使促炎型M1型巨噬細(xì)胞向抑炎型M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在易損斑塊內(nèi)，M1型巨噬細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF- κB)激活，促進分泌IL- 1β、IL- 6、活性氧中間物及含氮氧化物等促炎因子，繼而引起強烈的細(xì)胞氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑依賴的細(xì)胞凋亡。在穩(wěn)定斑塊內(nèi)，M2型巨噬細(xì)胞占多數(shù)，能有效吞噬細(xì)胞碎片及凋亡小體，減輕周圍炎癥反應(yīng)。自噬通過分子伴侶蛋白P62識別泛素化NF- κB并轉(zhuǎn)運至溶酶體進行降解，調(diào)節(jié)M1向M2轉(zhuǎn)化。巨噬細(xì)胞自噬抑制后，可使M2細(xì)胞分泌類M1細(xì)胞的細(xì)胞因子。另一方面，激活骨髓來源的巨噬細(xì)胞自噬相關(guān)通路PI3K/mTOR后，M2細(xì)胞數(shù)量增多；反之，抑制PI3K/mTOR通路，M2細(xì)胞減少[35]。此研究表明，自噬通過促進巨噬細(xì)胞類型轉(zhuǎn)換穩(wěn)定易損斑塊。

自噬促進巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出，其主要機制是自噬調(diào)節(jié)膽固醇從巨噬細(xì)胞流出是通過溶酶體酸性脂肪酶(LAL)實現(xiàn)，巨噬細(xì)胞自噬將脂滴(LDS)運送到溶酶體，通過LAL在溶酶體中水解，最終可能依賴三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白A- 1(ABCA1)通路介導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞膽固醇流出。有研究結(jié)果表明，藥物阻斷或ATG5敲除的巨噬細(xì)胞中，均可見到膽固醇的流出障礙[36]。自噬在巨噬細(xì)胞膽固醇流出所發(fā)揮的積極作用，這種特殊的選擇性自噬稱為脂自噬(Lipophagy)[37]。此外，脂質(zhì)負(fù)荷巨噬細(xì)胞中，自噬標(biāo)記物明顯增加[36]。

自噬可能通過減少炎性反應(yīng)和炎癥體形成起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。ROS是自噬過程中的扳機[22]。當(dāng)大量異常蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)聚積時可對細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)。細(xì)胞通過蛋白酶體及自噬溶酶體途徑降解蛋白質(zhì)，兩者均通過泛素化信號識別蛋白。泛素樣結(jié)合蛋P62/SQSTM1(sequestosome- 1，SQSTM1)可結(jié)合泛素化的蛋白質(zhì)與LC3相互作用后將泛素化蛋白轉(zhuǎn)運至自噬溶酶體，同時自身被降解。在進展期斑塊內(nèi)，巨噬細(xì)胞P62水平顯著提高，自噬功能受損。巨噬細(xì)胞自噬抑制后，AS斑塊內(nèi)損傷蛋白不能及時清除，從而激活炎癥體及凋亡信號。另一方面，線粒體自噬缺陷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS顯著增加，ROS是激活炎癥體的潛在因子，損傷線粒體破裂后引起細(xì)胞色素C釋放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。巨噬細(xì)胞自噬通過清除損毒性蛋白及降解脂質(zhì)抑制炎癥信號激活[35]，抑制細(xì)胞凋亡降低斑塊破裂風(fēng)險。目前有部分學(xué)者認(rèn)為，巨噬細(xì)胞的自噬性死亡有利于防止AS發(fā)生發(fā)展，因此在斑塊形成中巨噬細(xì)胞的自噬作用存在一些爭議。

4 中藥對自噬的干預(yù)在AS中的作用

中藥是中醫(yī)學(xué)的傳統(tǒng)藥物，通過多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)共同參與發(fā)揮療效。近幾年來，隨著對自噬研究的不斷熱化及相關(guān)檢測方法的完善，有關(guān)中藥對自噬影響的課題受到越來越多的關(guān)注，研究者們將自噬作為某些中藥發(fā)揮作用的新靶點。Zhu等[38]體外研究顯示，白藜蘆醇通過誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)自噬而起到抗炎作用，分析其與通過激活cAMP- PRKA- AMPK- SIRT1信號通路有關(guān)。白曄等[39]研究顯示，化痰消食方對過氧化氫刺激的內(nèi)皮細(xì)胞自噬性死亡具有抑制作用，分析其與上調(diào)細(xì)胞內(nèi)PKB表達、下調(diào)LC3表達有關(guān)。楊亭等[40]用青風(fēng)藤的有效成分青藤堿體外干預(yù)人內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926，其可通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)ERK通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬起到抗炎作用。倪小鷗等[41]通過建立ApoE基因敲除小鼠AS不穩(wěn)定斑塊模型，觀察搜風(fēng)祛痰法中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯對小鼠AS模型不穩(wěn)定斑塊自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的影響，結(jié)果顯示復(fù)方穩(wěn)斑湯可能通過影響B(tài)eclin1與LC3的蛋白表達，從而影響AS斑塊的穩(wěn)定性。在闡釋中藥誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬對AS保護作用的分子機制方面?zhèn)涫荜P(guān)注，He等[42]研究發(fā)現(xiàn)，葫蘆素能增強LPS刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞自體吞噬，從而發(fā)揮抗炎作用。劉明玥等[43]表明槲皮素能明顯抑制ox- LDL誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的累積，從而起到促進膽固醇流出及抑制膽固醇流入的作用。槲皮素可降低高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟脂質(zhì)積累，降低與脂肪肝相關(guān)基因表達，調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達，提高巨噬細(xì)胞膽固醇輸出，保護低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡[44]。Liu等[45]證明在RAW264.7細(xì)胞中白藜蘆醇通過激活Sirtl調(diào)節(jié)的自噬促進其對ox- LDL誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞胞葬作用，表明白藜蘆醇可能在AS方面發(fā)揮保護作用及成為AS潛在的治療措施。玄參、密蒙花等具有清熱解毒功效的中藥中含有一種天然的黃酮類化合物芹菜素。王群[46]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)芹菜素不僅能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞發(fā)生caspase依賴的凋亡，還能誘導(dǎo)自噬小體的形成從而發(fā)生自噬，在結(jié)合自噬和凋亡通路調(diào)控AS的進展方面上提供新思路。

5 小 結(jié)

中醫(yī)藥是以整體觀為指導(dǎo)，辨證論治，系統(tǒng)治療，通過多途徑、多靶點整合起效，且具有毒副作用小、起效平穩(wěn)等西醫(yī)西藥不具備的優(yōu)點，尤其對于復(fù)雜性疾病的治療凸顯獨特的優(yōu)勢。自噬作為一種高度保守的代謝機制，維持真核生物細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)正常細(xì)胞自噬可能有以利于預(yù)防AS發(fā)生，而對已形成的粥樣斑塊動脈血管，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬可能減少炎性反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡、促進膽固醇外流等穩(wěn)定易損斑塊。因此，研究中藥對巨噬細(xì)胞自噬的影響，具有極大的研究潛力和應(yīng)用價值。中藥治療AS的自噬機制有許多問題尚待闡明，PI3K/AKT/mTOR作為自噬調(diào)控的經(jīng)典通路，將有利于深入研究其在巨噬細(xì)胞自噬及AS發(fā)生發(fā)展中的作用，是自噬復(fù)方研究新的著力點，最終將其運用至臨床以提高AS的防治效果。