王娟，鄧紅，劉蕓，郭玉蓉，孟永宏

（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，西安 710119）

0 引言

【研究意義】蘋果中含有維生素、礦物質(zhì)、糖類、酸類、果膠以及蘋果多酚、類黃酮等多種物質(zhì)[1]，具有生津、潤肺、開胃、止瀉、通便功效[2]。蘋果中類黃酮的含量隨著品種和種植地的不同而有所差異，其含量約為114—803 μg·g-1[3]，是天然的優(yōu)質(zhì)抗氧化劑。然而，在蘋果汁和蘋果酒的加工過程中，隨著植物細胞組織結(jié)構(gòu)的破壞，釋放出的多酚氧化酶（PPO）在氧氣（O2）的參與下產(chǎn)生酶促反應，生成許多新的多酚氧化物，是造成果汁褐變和劣變[4]的主要原因之一。多酚氧化酶是一種含銅離子的金屬蛋白體[5]，它的催化作用分為兩種[6]：一種是選擇性地催化酚羥基化生成鄰二酚，鄰二酚產(chǎn)物繼續(xù)被氧化生成鄰苯醌；另一種是先在多酚氧化酶的作用下形成不穩(wěn)定的鄰苯醌類化合物，然后再進一步通過非酶氧化反應聚合生成黑色素[7]，如兒茶素類多酚在多酚氧化酶與氧氣作用下生成鄰苯醌類，鄰苯醌類化合物再進一步生成茶黃素或茶紅素類物質(zhì)。多酚氧化酶可作用于一元酚、鄰苯二酚和對苯二酚等底物，科學研究中經(jīng)常利用與鄰苯二酚的反應測定多酚氧化酶活性強度[8]。酶促褐變后的果汁中含有大量的多酚氧化產(chǎn)物，在傳統(tǒng)果汁加工過程中經(jīng)過脫色樹脂進行吸附去除[9]，以便維持果汁的色值、儲藏穩(wěn)定性。但是，長久以來，人們并沒有重視和研究生產(chǎn)中大量產(chǎn)生的蘋果多酚氧化產(chǎn)物，其對果汁褐變、劣變的影響和生物功能尚不清楚。【前人研究進展】目前國內(nèi)外主要是通過研究不同蘋果多酚對多酚氧化酶催化特性的影響，為工業(yè)生產(chǎn)蘋果汁減少酶促褐變提高色值提供理論依據(jù)[10]。蘋果中的多酚物質(zhì)主要為黃酮醇類物質(zhì)（槲皮苷、蘆?。?，黃烷醇類物質(zhì)（原花青素、兒茶素類），二氫查耳酮類（根皮苷、根皮素），羥基肉桂酸（綠原酸）等[11]。宋燁等[12]通過高效液相色譜法測定分析了不同蘋果品種中多酚的組成及果實的褐變度，結(jié)果顯示，果實的褐變度與根皮苷、兒茶素、原花青素的相關(guān)性較高，綠原酸與果實褐變度相關(guān)性較低。OSZMIANSKI等[13]通過添加不同濃度的綠原酸和兒茶素研究根皮苷的酶促氧化速率，進而根據(jù)褐變值判斷同一反應體系中綠原酸和兒茶素對根皮苷氧化物積累的促進作用，但是有關(guān)蘋果多酚褐變的反應歷程尚不清楚?！颈狙芯壳腥朦c】目前國內(nèi)外通過模擬蘋果多酚體外氧化試驗對果汁工業(yè)加工減少酶促褐變提供理論依據(jù)，但并未對其褐變產(chǎn)物加以分析鑒定，無法評價多酚氧化物對蘋果汁褐變的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過多酚氧化酶氧化根皮苷反應體系的建立，分離純化POP2，對其結(jié)構(gòu)進行表征分析，明確蘋果汁酶促氧化反應中的主要氧化物，以及根皮苷氧化物生成的條件與反應歷程，以蘋果多酚氧化物的含量高低為標志，為建立蘋果汁褐變和劣變的檢測指標提供參考。

1 材料與方法

試驗于2016年11月至2017年5月在陜西師范大學長安校區(qū)食品學院進行。

1.1 材料與試劑

根皮苷（C12H24O10）由西安天美生物科技股份有限公司提供，純度為 95%；多酚氧化酶 Polyphenol Oxidase（PPO），1 800 U·mg-1，美國 Worthington 公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），美國 Fisher公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇、乙酸乙酯均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo高效液相色譜儀，美國熱電公司；高分辨液質(zhì)聯(lián)用 LC-MS，德國 Bruker；紅外光譜儀，德國Bruker；真空冷凍干燥機，北京四環(huán)科學儀器廠；紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pH、溫度、底物濃度對 PPO酶促氧化的影響選取磷酸鹽緩沖液pH梯度[14]為：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，室溫下用不同pH的磷酸鹽緩沖液分別配制3 mg·mL-1根皮苷反應液29 mL，將配制好的反應液置于35℃磁力攪拌器中，加入1 mL（900 U）PPO。

底物濃度梯度為：0.5、1.0、3.0和 5.0 mg·mL-1，用pH為6.5的磷酸鹽緩沖液分別配制根皮苷反應液29 mL，置于35℃磁力攪拌器中，加入1 mL（900 U）PPO。

反應溫度梯度[15-16]為：25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，用pH為6.5的磷酸鹽緩沖液分別配制3 mg·mL-1根皮苷反應液29 mL，分別置于不同溫度的磁力攪拌器中，加入1 mL（900 U）PPO。在研究pH和底物濃度對PPO酶促氧化的影響時，測定方法為每隔20 min移取反應液 0.5 mL，迅速置于 80℃水浴鍋中滅酶5 min，稀釋10倍后置于比色皿中，連續(xù)測定120 min內(nèi)（每隔20 min測一次）反應液在420 nm 處的吸光度值。在研究溫度對PPO酶促氧化的影響時，設(shè)定反應時間120 min，反應完成后迅速滅酶，并稀釋10倍后測定吸光度。

以吸光度An為縱坐標，各影響因素為橫坐標，研究不同pH、溫度、底物濃度對PPO酶促氧化的影響。1.3.2 無水乙醇對 PPO酶促氧化的影響 室溫下選取1.3.1中最佳反應速度的磷酸鹽緩沖液的pH、溫度、底物濃度配制無水乙醇含量分別為 0、10%、20%、30%、40%、50%的根皮苷反應液，其他反應條件及測定方法同1.3.1。

1.3.3 酶促反應歷程 室溫下在pH 6.5的磷酸鹽緩沖液中加入 20%的無水乙醇配制根皮苷反應液 3 mg·mL-149 mL，置于35℃磁力攪拌器中，加入1 mL（1 500 U）PPO，分別在反應進行的0、1、2、4、10、24和48 h取樣1 mL，并迅速儲存于-20℃冰箱終止酶促反應，用于高效液相色譜法（HPLC）在280 nm和420 nm處檢測根皮苷的減少量及氧化物的生成量。

1.3.4 根皮苷氧化物的純化 預試驗得到根皮苷氧化物為水溶性產(chǎn)物，而根皮苷易溶于乙酸乙酯，所以將反應完成的反應液用兩倍體積的乙酸乙酯溶液萃取3次以除去未反應的根皮苷，萃取后的反應液經(jīng)真空冷凍干燥后用超純水溶解至飽和狀態(tài)，加入無水乙醇進行脫鹽處理，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾除去乙醇，經(jīng)80%甲醇重結(jié)晶后得到氧化產(chǎn)物純品[17]。

1.3.5 高效液相色譜法 將1.3.4中的樣品從冰箱取出溶解后用0.22 μm濾器過濾；進樣量：5 μL；色譜柱：C18柱（Diamonsil SB-C18 column，4.6 mm×250 mm）；流動相A為pH 2.6的乙酸水溶液，B為乙腈，流速梯度：0—5 min為 3%—9% B，5—15 min為9%—16% B，15—30 min為16%—30% B，30—45 min為30%—5% B；流速為0.6 mL·min-1；柱溫30℃；檢測波長為280 nm和420 nm。

1.3.6 質(zhì)譜（ESI-MS）分析氧化物 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；噴霧電壓：0.4 bar；正離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z 100—1 000；母離子m/z 467。

1.3.7 紅外光譜（IR）分析氧化物 溴化鉀提前在90℃烘箱中烘干24 h備用，取約2 mg樣品與烘干的溴化鉀充分混合并研磨，再轉(zhuǎn)入壓片機中使其分布均勻，在抽真空狀態(tài)下將其壓成透明薄片。掃描紅外光譜時以溴化鉀空白壓片作為參比，在4 000—400 cm-1范圍內(nèi)記錄其光譜圖。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.0和Microsoft Excel軟件分析處理。采用DPS軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 pH、溫度、底物濃度對PPO的酶促氧化反應

pH作為影響酶促氧化速率的一個重要因素，由圖1-A可以看到，隨著pH逐漸從弱酸性（pH 5.5）提高至弱堿性（pH 7.5）時，反應速率也呈現(xiàn)先增后減趨勢，在前60 min內(nèi)，6種pH下的吸光度值都急劇升高，pH 6.5上升的最快，與其他5種具有顯著性差異（P＜0.05）。在60—120 min，反應逐漸趨于平緩，并且當反應液處于弱酸性和弱堿性時都不利于酶促反應的進行，其原因可能是當pH接近中性時對多酚氧化酶的銅離子輔基具有穩(wěn)定作用，pH過高或過低時都會不同程度的導致酶失活。所以選擇pH 6.5為根皮苷酶促氧化的最佳pH。

圖1-B結(jié)果顯示，當?shù)孜餄舛葹?.5—3 mg·mL-1范圍內(nèi)，PPO酶促氧化反應隨著底物濃度的增加，褐變值也有所上升，當濃度達到 5 mg·mL-1時，反應速度不及 3 mg·mL-1，原因可能是因為底物含量過高對PPO酶活力產(chǎn)生抑制，所以最佳反應底物濃度為 3 mg·mL-1，與其他3組具有顯著性差異（P＜0.05）。

溫度是果汁加工中一個關(guān)鍵控制點，經(jīng)常會采用低溫控制褐變。圖1-C結(jié)果顯示，在相同的反應時間內(nèi)，溫度較低時，酶促反應很慢；而在35℃時，與其他溫度具有顯著性差異（P＜0.05），褐變值顯示最高；隨后溫度升高時，褐變值降低，其原因可能是隨著溫度升高多酚氧化酶變性失活，為了使根皮苷完全轉(zhuǎn)化為氧化物，酶促氧化的溫度選擇35℃。

圖1 pH、溫度、底物濃度對POP2轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 1 Effects of different pH, temperatures, concentrations on conversion rate ofPOP2

2.2 無水乙醇濃度對PPO的酶促氧化反應

根皮苷在水中的溶解度較小，易溶于無水乙醇等有機溶劑，通過添加不同濃度的無水乙醇對酶促氧化的影響如圖2所示，添加不同濃度的無水乙醇均可以提高 POP2的轉(zhuǎn)化率，20%的無水乙醇作用效果最明顯，與其他4組具有顯著性差異（P＜0.05），乙醇濃度提高至40%時對PPO酶活力產(chǎn)生抑制，可能是因為乙醇是一種具有還原性的一元醇，將 PPO中的 Cu2+還原為磚紅色Cu2O沉淀，導致PPO失活。所以最佳的乙醇添加量為20%。

2.3 酶促反應歷程

圖2 乙醇濃度對酶促反應的影響Fig. 2 Effects of different ethanol concentrations on enzymatic reaction

根皮苷反應液隨時間的變化顏色也發(fā)生改變，反應剛開始溶液顏色呈微黃色，隨著反應的進行顏色逐漸從亮黃色變?yōu)槌赛S色，最終產(chǎn)物的顏色為橙紅色。高效液相色譜檢測結(jié)果如圖3顯示，反應過程中有4種物質(zhì)的含量發(fā)生變化，分別是根皮苷、中間產(chǎn)物X1、POP1和POP2，從色譜圖中可以看出，0—5 h內(nèi)，根皮苷的含量急劇減少，在280 nm處檢測到中間產(chǎn)物X1和POP1的生成，在420 nm處檢測到POP2的生成，在10 h以后，根皮苷的消耗基本不再發(fā)生變化，此時根皮苷的轉(zhuǎn)化率已達到 90.2%，中間產(chǎn)物 X1和POP1也基本接近痕量，而POP2含量一直在增加，根皮苷屬于一元酚，所以其反應歷程（圖 4）可能為根皮苷先轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物X1，X1再迅速轉(zhuǎn)變?yōu)橹虚g產(chǎn)物POP1，隨后轉(zhuǎn)變?yōu)镻OP2是一個非常緩慢的過程。HPLC結(jié)果顯示，根皮苷經(jīng)酶促氧化后，氧化產(chǎn)物的主要成分是POP2，無其他副產(chǎn)物的生成。

圖3 反應歷程中根皮苷的消耗和POP2的生成Fig. 3 Consumption of phloridzin and the formation of POP2 during 48h reaction

圖4 根皮苷氧化物POP2的形成過程Fig. 4 Reaction pathway for formation of phloridzin oxide POP2

2.4 根皮苷氧化物的純化

根皮苷反應液經(jīng)PPO酶促氧化48 h后的反應液用兩倍體積的乙酸乙酯萃取3次，得到POP2的純度為96.8%。圖5結(jié)果顯示，HPLC法在280 nm處檢測到萃取后反應液根皮苷的峰消失，在420 nm處反應液中僅存在氧化產(chǎn)物 POP2。由于此產(chǎn)物是水溶性化合物，用無水乙醇脫鹽后，用80%的甲醇重結(jié)晶，得到的結(jié)晶物即為根皮苷氧化產(chǎn)物純品，將其進行質(zhì)譜和紅外光譜分析。

2.5 ESI-MS圖

將 2.4中所得到的根皮苷氧化物的結(jié)晶純品用超純水溶解后再用色譜甲醇稀釋至10-6μg·L-1，圖6顯示，在正離子模式下分析得到根皮苷氧化物m/z為467，即其分子質(zhì)量應為 466，與所推測的最終產(chǎn)物 POP2相吻合，其分子式為C21H22O12。

圖5 萃取過程中根皮苷與POP2的含量變化Fig. 5 Content change of phloridzin (280 nm) and POP2 (420 nm) before and after extraction

圖6 根皮苷氧化物POP2的質(zhì)譜圖Fig. 6 Mass spectrogram of phloridzin oxide POP2

2.6 紅外光譜圖

根皮苷氧化物的紅外光譜圖（圖7）結(jié)果顯示，1 725 cm-1為酮基（υC=O1 725—1 700 cm-1）的特征吸收峰，1 060 cm-1為飽和脂肪醚（1 150—1 060 cm-1）的特征吸收峰，3 535 cm-1為羥基（υ-OH3 750—3 000 cm-1）的特征吸收峰，1 628 cm-1為苯環(huán)的特征吸收峰（1 500—1 700 cm-1），691為苯環(huán)上取代基的吸收峰，2 830 cm-1為飽和-CH2（υC-H2 830—2 870 cm-1）的吸收峰，3 271 cm-1為羧酸上的-OH（υO(shè)-H3 300—2 500 cm-1）的特征吸收峰，由此推測，與根皮苷氧化物POP2的結(jié)構(gòu)式吻合。

圖7 根皮苷氧化物POP2的紅外光譜圖Fig. 7 Infrared spectrogram of phloridzin oxide POP2

3 討論

3.1 無水乙醇提高POP2的轉(zhuǎn)化率

蘋果中含有一些天然香精[18-19]，在果汁加工中通過回流濃縮收集揮發(fā)性物質(zhì)得到的產(chǎn)品[20]，主要分為醇香型和酯香型兩種，馬永昆等[21]研究發(fā)現(xiàn)蘋果中 3種天然香精（SH1、SH2和 SB）中醇類所占比例分別為46.71%、47.01%、24.48%，蘋果中各香精成分隨著蘋果品種和成熟度的不同而有所差異[22]。KLIBANOV[23]和 MA[24]等研究了在有機溶劑中提高酶的活性，相比在水為溶劑的酶促反應中，酶表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。郭盼等[25]研究了非水介質(zhì)中漆酶催化多酚化合物的影響，結(jié)果表明低濃度親水性的有機溶劑甲醇可以促進酶促反應。

果蔬的酶促褐變主要是由于果蔬中富含的 PPO催化酚類物質(zhì)的氧化反應所引起。PPO可催化果蔬中酚類物質(zhì)形成醌，醌類物質(zhì)在果蔬體內(nèi)進行自身縮合或與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)反應生成黑色素[26]。在完整的果蔬體內(nèi)，PPO處于潛伏狀態(tài)并不起催化作用，但是果蔬在加工過程中組織被損傷，氧氣的侵入使多酚氧化酶被激活，作用于酚類物質(zhì)生成黑色素。所以體外模擬PPO酶促反應時必須具備的條件有：氧氣、多酚氧化酶、底物與酶的結(jié)合[27]。

果汁中香精為有機溶劑會增加多酚的溶解度，所以為了模擬果汁工業(yè)生產(chǎn)體系，在研究pH、底物濃度和溫度對PPO酶促氧化影響的基礎(chǔ)上，又研究了不同濃度的無水乙醇對PPO酶促氧化的影響，發(fā)現(xiàn)20%的乙醇濃度酶促氧化效果最佳，可提高反應轉(zhuǎn)化率 2.4倍，其可能的原因是無水乙醇能使根皮苷充分溶解，使PPO與底物充分結(jié)合，有研究表明在酶促氧化過程中乙醇是一種激活劑[28]，但是隨著乙醇濃度的升高，酶活力受到抑制，是因為乙醇是一種具有還原性的一元醇，將PPO中的Cu2+還原為磚紅色Cu2O沉淀，導致PPO失活。

在果汁生產(chǎn)過程中，可以從隔絕氧氣、滅酶、減少底物與酶的結(jié)合、除去香精4個方面減少酶促褐變。例如在果汁生產(chǎn)中盡量減少破碎后的蘋果與空氣接觸，采用冷破碎的方式去除蘋果皮和蘋果籽，防止溫度過高發(fā)生酶促褐變，殺菌時采用高溫短時滅菌或其他非熱殺菌技術(shù)。通過在根皮苷反應體系中添加不同濃度的乙醇均可促進酶促反應，因此，在工業(yè)生產(chǎn)中可先回收蘋果香精再進行果汁生產(chǎn)，最后根據(jù)需要再將香精添加至果汁中。

3.2 POP2的生成過程

根皮苷在前5 h內(nèi)消耗的最快，轉(zhuǎn)化率已經(jīng)達到86.1%，之后根皮苷的含量基本不再發(fā)生變化，5 h以后主要是中間產(chǎn)物向終產(chǎn)物POP2的轉(zhuǎn)變，在1—10 h內(nèi)，POP2的積累速度最快，在10 h后，根皮苷的含量基本不再發(fā)生變化，其原因可能是在反應前期，底物迅速與酶活性中心結(jié)合，使根皮苷迅速被消耗，但是隨著時間的延長，酶活達到極限，根皮苷與酶結(jié)合能力變?nèi)?，此時轉(zhuǎn)化率達到90.2%，并且中間產(chǎn)物X1已基本轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物 POP2，此后主要發(fā)生的反應是POP1向 POP2的轉(zhuǎn)變。GUYOT[29]和 GUERNEVé[30]的研究表明在反應時間為5 h時，根皮苷已完全轉(zhuǎn)化為氧化物POP1和POP2，在280 nm處未檢測到根皮苷的殘留及中間產(chǎn)物X1的生成，5 h后發(fā)生的反應是氧化物POP1向POP2的轉(zhuǎn)變，當反應終止時，體系中僅存在POP1和POP2兩種氧化物，并且POP2為主要產(chǎn)物，在420 nm處檢測到POP2的積累。但不同的是，王雪暉[31]的研究表明反應完成后，在287 nm處同時檢測到兩種氧化物POP1和POP2的生成，并且POP1為主要產(chǎn)物。通過HPLC追蹤根皮苷酶促反應歷程發(fā)現(xiàn)，根皮苷不能完全轉(zhuǎn)化為POP2，在420 nm處檢測到根皮苷氧化物中的主要成分為POP2。根皮苷為蘋果的特征性多酚，通過明確根皮苷氧化物POP2的結(jié)構(gòu)和HPLC的檢測方法，可以以POP2的含量多少檢測蘋果汁的摻假。

4 結(jié)論

通過多酚氧化酶氧化根皮苷反應體系的建立，明確了根皮苷酶促氧化體系中的主要氧化物為POP2，添加適宜濃度的無水乙醇可以顯著提高根皮苷的轉(zhuǎn)化率和POP2的積累；經(jīng)分離純化后利用ESI-MS和IR確定了 POP2的結(jié)構(gòu)。此研究結(jié)果可為蘋果汁中POP2的檢測分析及功能評價奠定基礎(chǔ)，進而可以用POP2含量的多少建立蘋果汁褐變和劣變的標志性檢測指標。

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