張瑞杰，王喆，連卜穎，郭展，魏東，于世慧，李紅英,2,3*，劉曉東

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031；3.雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太谷 030801;4.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所，山西 太原 030031)

谷子(Setariaitalica)，禾本科，狗尾草屬，是中國(guó)傳統(tǒng)的糧食作物，距今已有7500多年的栽培歷史[1]。研究表明，谷子具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，各種成分均衡、飼草蛋白含量高，且具有很高的水分利用效率、抗旱耐瘠、適應(yīng)性廣等突出特點(diǎn)[2～4]。因此，谷子在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位。在中國(guó)，谷子主要分布在北方黃河流域中上游的干旱、半干旱地區(qū)。由于地區(qū)性降水不均，大部分區(qū)域降水較少，干旱成為制約谷子品質(zhì)與產(chǎn)量提高的主要問題[5]。因此，選育抗旱能力強(qiáng)，適應(yīng)范圍廣的谷子品種是目前育種的主要方向之一。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporters)是一類跨膜蛋白，廣泛存在于自然界生物體中，是目前已知最大、最古老的蛋白家族之一[6]，在植物的抗逆脅迫中發(fā)揮著重要作用。已有研究證實(shí)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白廣泛參與植物的抗逆反應(yīng)[7]，如浮萍中的PDR基因SpTUR2受干旱、ABA、低溫和鹽的誘導(dǎo)表達(dá)[8]；擬南芥中AtABCG40基因的表達(dá)能夠促進(jìn)植物的抗旱能力以及對(duì)金屬鉛的耐受力[9]；在擬南芥中AtABCG36基因過表達(dá)可以提高植株對(duì)干旱與鹽脅迫的抗性，參與植物的抗旱反應(yīng)[7]；AtABCC5、AtABCG31通過調(diào)節(jié)氣孔開閉，增強(qiáng)植物的抗逆性[10，11]；水稻中的OsABCG36基因可以對(duì)干旱、ABA等脅迫做出應(yīng)答反應(yīng)[8]；在高鹽、干旱等逆境條件下，水稻ABCB基因家族中均有表達(dá)[12]；小麥中的TaPDR1基因參與植物抗病防御反應(yīng)[13]。

目前擬南芥、水稻ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究較多，分別有129個(gè)和128個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因被發(fā)掘[14]，而谷子中關(guān)于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究相對(duì)較少，對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因與谷子抗旱關(guān)系的研究更是微乎其微。為了更好地了解ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與谷子抗旱的關(guān)系，本文根據(jù)PEG脅迫處理下的抗旱品種(GG)和干旱敏感品種(JF)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析了兩個(gè)品種中與干旱相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的基本信息和表達(dá)情況，并利用生物信息學(xué)方法，進(jìn)一步分析了起始密碼子上游1 500 bp的啟動(dòng)子順式作用元件，并構(gòu)建進(jìn)化樹比較這些基因親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。初步了解谷子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因與谷子抗旱的關(guān)系，并推測(cè)Seita.7G176000.1可能是谷子抗旱候選基因，研究結(jié)果為后續(xù)該蛋白基因的功能鑒定和研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究材料為抗旱品種勾勾母雞咀(GG)和干旱敏感品種晉汾16(JF16)，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。將谷子幼苗置于人工氣候室，14 h光照28 ℃/10 h黑暗23 ℃培養(yǎng)，出苗后每3天澆一次蒸餾水，培養(yǎng)3周后，釆用20% PEG-6000干旱處理0.5 h，用蒸餾水處理相同時(shí)間做對(duì)照，每個(gè)處理隨機(jī)選取3株用于RNA提取，進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序。

1.2 研究方法

利用Phytozome v 11.0豫谷1號(hào)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)進(jìn)行關(guān)鍵詞搜索，獲取谷子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的基本信息；利用網(wǎng)站http://web.expasy.org/compute_pi/在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量和理論等電點(diǎn)理化性質(zhì)；利用MEGA 7.0進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線分析啟動(dòng)子順式元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因基本信息及理化性質(zhì)分析

通過Phytozome v 11.0豫谷1號(hào)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲取了谷子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因信息并通過網(wǎng)站http://web.expasy.org/compute_pi/在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量和理論等電點(diǎn)，結(jié)果如表1所示。4個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因分布在3條不同的染色體上，分別位于1，5，7號(hào)染色體的不同位點(diǎn)。不同的基因其基因組序列有很大區(qū)別，最長(zhǎng)為9 254 bp，而最小的只有3 384 bp；Seita.5G185300.1蛋白最長(zhǎng)有1 447個(gè)氨基酸，Seita.1G086300.1蛋白最短有457個(gè)氨基酸，相對(duì)應(yīng)的蛋白分子量范圍在51 195.75～161 579.13Da之間，CDS序列長(zhǎng)度在1 374～4 344 bp之間；等電點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，除Seita.1G039400.1的等電點(diǎn)為6.81顯酸性外，其他3個(gè)基因均顯堿性。

表1 谷子部分ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因基本信息Table 1 Basic information of some ABC transporter protein genes in foxtail millet

使用GSDS2.0對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行基因組結(jié)構(gòu)繪制，結(jié)果如圖1所示。除Seita.1G086300.1沒有內(nèi)含子以外，其他3個(gè)均含有內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)，其中Seita.1G039400.1內(nèi)含子數(shù)目最多(Seita.1G039400.1)為18個(gè)，Seita.5G185300.1和Seita.7G176000.1都含有8個(gè)內(nèi)含子；Seita.5G185300.1有較長(zhǎng)的上游序列，而Seita.7G176000.1有較長(zhǎng)的下游序列。

圖1 谷子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)Fig.1 Intron-exonstructures of ABC translocation protein genes in foxtail millet

2.2 谷子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因與其他植物ABC抗逆相關(guān)基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA7.0對(duì)4個(gè)谷子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及5個(gè)其他植物ABC抗逆相關(guān)基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，比較其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近(圖2)。從圖2可以看出，Seita.1G039400.1和Seita.7G176000.1親緣關(guān)系最近，其次與AtABCC5親緣關(guān)系較近；Seita.1G086300.1與AtABCG36和AtABCG31親緣關(guān)系較近。

2.3 谷子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動(dòng)子元件分析

谷子ABC基因中與干旱脅迫相關(guān)的元件主要有脫落酸響應(yīng)元件ABRE、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element、熱脅迫響應(yīng)元件HSE、低溫響應(yīng)元件LTR、脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats以及MYB元件等。以豫谷1號(hào)序列為參照，選取起始密碼子上游1 500 bp序列為啟動(dòng)子區(qū)，利用PlantCARE在線分析這4個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)元件。將啟動(dòng)子順式元件歸類，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表2)。結(jié)果顯示，不同基因的調(diào)控元件總數(shù)不同，Seita.1G039400.1基因的順式調(diào)控元件最多，高達(dá)75個(gè)，Seita.5G185300.1基因最少，含有51個(gè)順式調(diào)控元件；其中只有Seita.1G086300.1基因含有ABRE調(diào)控元件，只有Seita.1G039400.1 基因含有水楊酸響應(yīng)調(diào)控元件；Seita.1G039400.1 基因所含的茉莉酸甲酯響應(yīng)元件最多，高達(dá)8個(gè)；此外，在這4個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因中，啟動(dòng)子區(qū)均含MYB元件，MYB屬于轉(zhuǎn)錄因子，與干旱、ABA的誘導(dǎo)表達(dá)有關(guān)。

圖2 谷子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因與其他植物ABC抗逆相關(guān)基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of ABC translocation protein genes in foxtail millet and ABC tolerance genes in other plants

表2 谷子部分ABC蛋白基因啟動(dòng)子順式元件預(yù)測(cè)Table 2 Predicted cis acting elements of partial ABC transporter protein in foxtail millet

注：以上數(shù)據(jù)不包括基本啟動(dòng)子元件TATA-box和CAAT-box。
Note：The data does not include the basic promoter elements such as TATA-box and CAAT-box.

圖3 GG和JF16 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of expansin ABC transporter genes in GG and JF16

2.4 谷子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式分析

用20% PEG-6000模擬干旱脅迫，處理抗旱品種勾勾母雞咀(GG)和干旱敏感品種晉汾16(JF16)，對(duì)其ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行表達(dá)譜分析。

由圖3可見，GG和JF16基因組中有4個(gè)基因(Seita.1G086300.1、Seita.1G039400.1、Seita.5G185300.1、Seita.7G176000.1)均表達(dá)。2個(gè)品種的Seita.1G086300.1基因在正常澆水與干旱脅迫下均有表達(dá)。正常澆水情況下，抗旱品種GG的表達(dá)量高于干旱敏感品種JF16；干旱脅迫下，這兩個(gè)品種的表達(dá)量均下調(diào)，且GG下調(diào)幅度較JF16高。正常澆水情況下，干旱敏感品種JF16的Seita.1G039400.1的表達(dá)量高于抗旱品種GG；干旱脅迫下，2個(gè)品種的Seita.1G039400.1的表達(dá)量均下調(diào)，且JF16下調(diào)幅度較GG高。在干旱脅迫下，Seita.5G185300.1基因在抗旱品種GG中不表達(dá)，但在正常澆水情況下表達(dá)水平上調(diào)；JF16的Seita.5G185300.1基因在正常澆水與干旱脅迫下都表達(dá)，且無明顯差異。JF16的Seita.7G176000.1 基因在正常生長(zhǎng)條件下表達(dá)水平較GG高；在干旱脅迫后表達(dá)水平都上調(diào)，且GG上調(diào)幅度較JF16高。

3 結(jié)論與討論

干旱嚴(yán)重影響著作物的品質(zhì)與產(chǎn)量[5]，谷子作為抗旱作物，研究其抗旱機(jī)理對(duì)于選育抗旱新品種具有重要的意義。本文通過對(duì)谷子中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及表達(dá)譜分析，初步探討ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因與谷子抗旱的關(guān)系。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是植物中重要的抗逆蛋白。通過分析谷子中編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因序列，發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子序列中含有許多抗逆相關(guān)的元件，如脫落酸響應(yīng)元件ABRE、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element、熱脅迫響應(yīng)元件HSE、低溫響應(yīng)元件LTR、脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats以及MYB元件等。谷子具有抗旱耐瘠的特性，結(jié)合實(shí)際情況，推測(cè)其可能參與谷子抗旱調(diào)節(jié)。

ABRE是ABA合成時(shí)所需要的相關(guān)元件，ABA與抗旱息息相關(guān)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Seita.1G086300.1含有的ABRE元件最多，另外，系統(tǒng)進(jìn)化樹表明Seita.1G086300.1基因與AtABCG36和AtABCG31親緣關(guān)系較近，已有研究表明在擬南芥中AtABCG36基因的過表達(dá)可以提高植株對(duì)干旱與鹽脅迫的抵抗能力，參與植物的生物脅迫[7]。但是在表達(dá)譜分析中，抗旱品種GG在20%PEG處理后Seita.1G086300.1表達(dá)量下降，與啟動(dòng)子分析結(jié)果以及系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果不一致。這可能是因?yàn)樵摶蛏嫌魏衅渌?fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，使得GG在干旱脅迫處理中Seita.1G086300.1基因表達(dá)量下降，有待進(jìn)一步證實(shí)。20%PEG脅迫下(同正常澆水相比)，Seita.7G176000.1 基因在抗旱品種GG中表達(dá)水平的上調(diào)幅度顯著大于干旱敏感品種JF16，系統(tǒng)進(jìn)化樹中，Seita.7G176000.1 基因與AtABCC5親緣關(guān)系較近。這可能是由于抗旱品種中Seita.7G176000.1基因的高水平表達(dá)，促使植物調(diào)節(jié)氣孔開閉，提高對(duì)干旱的抵抗能力，該結(jié)果與趙胡等人的研究結(jié)果是一致的[10]。

綜上所述，本研究通過對(duì)谷子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并分析干旱處理下其表達(dá)情況，初步了解ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因與谷子抗旱的關(guān)系，并推測(cè)Seita.7G176000.1 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因可能為谷子抗旱候選基因，研究結(jié)果為進(jìn)一步探究ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在谷子響應(yīng)干旱脅迫過程中的作用提供依據(jù)。

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