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止得咳顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

2018-01-17 11:00:02黃敏黃國東韋瑀龍謝廣源陸丹萍吳變美
中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2018年30期
關(guān)鍵詞:黃芩苷薄層色譜射干

黃敏 黃國東 韋瑀龍 謝廣源 陸丹萍 吳變美

[摘要] 目的 建立止得咳顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方法。 方法 采用薄層色譜法(TLC)對(duì)白前、射干進(jìn)行定性鑒別;采用高效液相色譜法(HPLC)C18色譜柱測定黃芩苷和次野鳶尾黃素的含量:流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸溶液(49∶51);流速為1 mL/min;檢測波長為266 nm。 結(jié)果 TLC斑點(diǎn)清晰,陰性無干擾。HPLC定量測定中,黃芩苷和次野鳶尾黃素分別在947.1~7577.0 ng(r = 0.9998)、18.03~180.30 ng(r = 0.9999)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均加樣回收率分別為100.6%(RSD = 0.4%)、93.1%(RSD = 0.6%)。 結(jié)論 該方法簡便、可行、靈敏、準(zhǔn)確,可作為止得咳顆粒的質(zhì)量控制方法。

[關(guān)鍵詞] 止得咳顆粒;黃芩苷;次野鳶尾黃素;白前;射干;薄層色譜;高效液相色譜

[中圖分類號(hào)] R927.11 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2018)10(c)-0106-05

[Abstract] Objective To establish a study method for the quality standard of Zhideke Granules. Methods Thin layer chromatography (TLC) was used for the qualitative identification of Cynanchum glaucescens and Belamcanda chinensis. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine baicalin and irisflorentin by C18 chromatographic column, the mobile phase was methanol-0.2% phosphoric acid solution (49∶51), the flow rate was 1 mL/min, the detection wavelength was set at 266 nm. Results The TLC spots were clear and free from negative interference. In HPLC quantitative determination, baicalin and irisflorentin showed good linear relationships within the ranges of 947.1-7577.2 ng (r = 0.9998) and 18.032-180.32 ng (r = 0.9999), whose average recovery were 100.6% (RSD = 0.4%) and 93.1% (RSD = 0.6%), respectively. Conclusion The method is simple, feasible, sensitive and accurate, which can be used as the quality control method of Zhideke Granules.

[Key words] Zhideke Granules; Baicalin; Irisflorentin; Cynanchum glaucescens; Belamcanda chinecsis; Thin layer chromatography; High performance liquid chromatography

止得咳顆粒由桔梗[1]、白前[2]、枇杷葉[3]、射干[4]、柴胡[5]、黃芩[6]等10味中藥經(jīng)科學(xué)配伍而成,具有清熱解毒、止咳化痰的功效,臨床上用于感冒發(fā)熱、頭痛、噴嚏、急慢性氣管炎、肺炎咳嗽、喉炎。本品為廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑,其質(zhì)量控制方法簡單,無鑒別、含測等專屬性強(qiáng)的檢測項(xiàng)目,為了能更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量[7],本研究參考2015版《中國藥典》各味藥材質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)[8]、廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)第一冊(cè)[9]及廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)第二卷[10],基于樣品提取和色譜條件的優(yōu)化,選取白前和射干作為定性鑒別成分,另選取黃芩活性成分黃芩苷、射干活性成分次野鳶尾黃素作為含量測定指標(biāo)性成分,建立準(zhǔn)確性好、專屬性強(qiáng)的質(zhì)量檢驗(yàn)方法,用于該品種制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀、十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(Agilent Extend C18 250 mm×4.6 mm,5 μm;YMC-pack ODS-A 250 mm×4.6 mm,5 μm;Spolar C18 250 mm×4.6 mm,5 μm);AB265-S十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多);SQ8200HBT超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司);AXLC1820超純水機(jī)(重慶阿修羅科技發(fā)展有限公司);薄層板(青島海洋化工廠);紫外分析儀(北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司)。

1.2 樣品與試劑

樣品:止得咳顆粒(廣西匯科藥物研究有限責(zé)任公司,批號(hào):170701、170702、170703);缺黃芩、射干的雙陰性樣品(廣西匯科藥物研究有限責(zé)任公司);對(duì)照藥材:白前(批號(hào):121442-200501)、射干(批號(hào):120994-201206);對(duì)照品:射干苷(批號(hào):11632-200602)、黃芩苷(批號(hào):110715-201612)、次野鳶尾黃素(批號(hào):111557-200602),對(duì)照品與對(duì)照藥材均來自中國食品藥品檢定研究院。試劑:甲醇(色譜純),水(超純水),其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜定性鑒別

2.1.1 白前藥材的鑒別

2.1.1.1 白前對(duì)照藥材溶液 取白前對(duì)照藥材1 g,加水50 mL,加熱回流1 h,放冷,用棉花濾過,取濾液,用氨試液飽和的正丁醇振搖提取2次,每次30 mL,合并正丁醇提取液,用正丁醇飽和的水50 mL洗滌,棄去水洗液,正丁醇層蒸干,殘?jiān)右掖? mL使溶解,制成白前對(duì)照藥材溶液。

2.1.1.2 供試品溶液 取本品15 g,研細(xì),加水50 mL使溶解,用氨試液飽和的正丁醇溶液振搖提取2次,每次50 mL,自“2.1.1.1”項(xiàng)下合并正丁醇提取液起,同法制成供試品溶液。

2.1.1.3 鑒別方法 吸取供試品溶液和白前對(duì)照藥材溶液各10~15 μL,分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(4∶8∶0.05)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視,結(jié)果見圖1(封四)。由圖1可知,供試品在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),且斑點(diǎn)清晰,分離度與比移值均良好。

2.1.2 射干藥材的鑒別

2.1.2.1 射干苷對(duì)照品溶液與射干對(duì)照藥材溶液 取射干對(duì)照藥材1 g,加水30 mL,超聲提取30 min,濾過,用乙酸乙酯提取2次,每次30 mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,殘?jiān)蛹状? mL使溶解,制成射干對(duì)照藥材溶液。再取射干苷對(duì)照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為射干苷對(duì)照品溶液。

2.1.2.2 供試品溶液 取本品8 g,研細(xì),加水30 mL使溶解,自“2.1.2.1”項(xiàng)下合并乙酸乙酯液起,同法配制作為供試品溶液。

2.1.2.3 鑒別方法 吸取供試品溶液和射干對(duì)照藥材溶液、射干苷對(duì)照品溶液各2~5 μL,分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠GF254薄層板上,以三氯甲烷-丁酮-甲醇-冰醋酸(3∶1∶1∶0.1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(254 nm)下檢視,結(jié)果見圖2。由圖2可知,供試品在與對(duì)照品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),且斑點(diǎn)清晰,分離度與比移值均良好。

2.2 HPLC定量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Extend C18 250 mm×4.6 mm,5 μm;流動(dòng)相:甲醇-0.2%磷酸溶液(49∶51);流速:1 mL/min;檢測波長:266 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 供試品溶液 取止得咳顆粒樣品研磨,取粉末約2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入75%乙醇25 mL,稱定重量,密塞,超聲處理(功率250 W,頻率50 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用75%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻。

2.2.2.2 雙陰性樣品溶液 取缺黃芩與射干的雙陰性樣品,與“2.2.2.1”同法配制。

2.2.2.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液與對(duì)照品溶液 ①黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液與對(duì)照品溶液:取黃芩苷對(duì)照品50.38 mg,置25 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容稀釋至刻度,搖勻,作為黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液;精密量取2 mL,加甲醇定容至10 mL作為黃芩苷對(duì)照品溶液。②次野鳶尾黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液與對(duì)照品溶液:取次野鳶尾黃素對(duì)照品11.27 mg,置50 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容稀釋至刻度,搖勻,作為次野鳶尾黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液;精密量取5 mL,加甲醇定容至100 mL,作為次野鳶尾黃素對(duì)照品溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn)

分別吸取對(duì)照品溶液、樣品溶液(批號(hào):170703)及雙陰性樣品溶液各10 μL,依法測定。結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示陰性樣品在主峰出峰位置無吸收峰,提示陰性樣品無干擾,方法專屬性良好。

2.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液,逐步稀釋成濃度為0.094 71、0.1894、0.3789、0.5683、0.7577 mg/mL的線性系列溶液。精密量取次野鳶尾黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液,逐步稀釋成濃度為1.803、3.606、4.508、7.213、9.016、18.03 μg/mL的線性系列溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,記錄圖譜。以進(jìn)樣量C(x,ng)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合,得回歸方程。黃芩苷:y = 1.9750x + 75.5497,r = 0.9998。次野鳶尾黃素:y = 4.2999x - 2.2947,r = 0.9999。結(jié)果顯示黃芩苷和次野鳶尾黃素分別在進(jìn)樣量為947.1~7577.0 ng和18.03~180.30 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取止得咳顆粒樣品,按照“2.2.2.1”平行制備6份供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定,記錄圖譜,計(jì)算黃芩苷、次野鳶尾黃素的含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果6份供試品溶液黃芩苷平均含量為4.260 mg/g,RSD為0.6%;次野鳶尾黃素平均含量為84.73 μg/g,RSD為1.4%,表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn)

取黃芩苷對(duì)照品溶液、次野鳶尾黃素對(duì)照品溶液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄圖譜。結(jié)果兩組分峰面積RSD分別為0.1%和0.3%,表明該儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.5”項(xiàng)下重復(fù)性樣1溶液分別于室溫下放置0、4、8、16、24 h時(shí)按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,記錄色譜圖。結(jié)果顯示樣品黃芩苷、次野鳶尾黃素峰面積RSD分別為0.6%和2.0%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的止得咳顆粒樣品約1 g,平行稱取6份,黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.9321 mg/mL)5 mL、次野鳶尾黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.036 06 mg/mL)2.5 mL,依法測定,記錄圖譜并計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見表1~2。

2.2.9 耐用性試驗(yàn)

取供試品溶液,分別改變“2.2.1”項(xiàng)下色譜柱品牌(Agilent Extend C18 250 mm×4.6 mm,5 μm;YMC-pack ODS-A 250 mm×4.6 mm,5 μm;Spolar C18 250 mm×4.6 mm,5 μm)、流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)、柱溫(25℃、30℃、35℃)、波長(261、266、271 nm)、流動(dòng)相比例甲醇-0.2%磷酸溶液(46∶54、49∶51、54∶46),依法測定。結(jié)果顯示在改變色譜柱品牌、流速、柱溫、波長及流動(dòng)相比例時(shí),樣品測定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為黃芩苷:0.20%、0.20%、0.78%、0.54%、0.61%;次野鳶尾黃素:0.41%、0.51%、0.65%、0.42%、0.35%。各試驗(yàn)條件下主峰分離效果良好,黃芩苷主峰理論塔板數(shù)均>2000,提示方法耐用性良好。

2.2.10 樣品測定

分別取3個(gè)批號(hào)的樣品照本方法進(jìn)行分析測定,結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 薄層色譜定性鑒別

3.1.1 白前藥材的鑒別

由于《中國藥典》無白前藥材的鑒別方法,同時(shí)考慮到本品藥材較多,干擾大。在選擇提取方法的時(shí)候考慮用不同濃度的堿液溶解,并用乙酸乙酯多次提取,但最終結(jié)果均不如本研究中的提取方法斑點(diǎn)清晰。筆者同時(shí)對(duì)白前鑒別方法的展開劑也進(jìn)行了研究:①三氯甲烷-甲醇-水(2∶1∶1.5)下層液[11];②三氯甲烷-甲醇-水(3.5∶1∶1.5)下層液;③甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(5∶6∶3∶1)[12];結(jié)果顯示斑點(diǎn)均不夠圓整,比移值太高,而本研究中收載的展開劑效果好,比移值適中,斑點(diǎn)清晰,重現(xiàn)性好。

3.1.2 射干藥材的鑒別

除本研究中選擇的提取方法,筆者亦選取藥典中射干藥材的鑒別方法研究,但斑點(diǎn)不明顯,同時(shí)也比較以下展開系統(tǒng):①三氯甲烷-丁酮-甲醇(10∶5∶1)[13];②三氯甲烷-甲醇-冰醋酸(20∶3∶0.5)[14];結(jié)果顯示①斑點(diǎn)不夠圓整,②特征斑點(diǎn)不明顯,而本研究中收載的展開劑效果好,比移值適中,斑點(diǎn)清晰,重現(xiàn)性好。

3.2 HPLC定量測定研究

3.2.1 定量測定成分的選擇

筆者參考產(chǎn)品中10味藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),在對(duì)白前和射干藥材進(jìn)行定性鑒別的基礎(chǔ)研究上,對(duì)比研究枇杷葉、桔梗、柴胡、黃芩、射干等藥材的含量測定的方法,由于處方中中藥成分較多,組分復(fù)雜,各組分峰之間難分離,同時(shí)考慮各藥材在成品中的功效,選取黃芩中黃芩苷[15]與射干中次野鳶尾黃素[16-17]作為本品質(zhì)量研究的主成分。

3.2.2 測定波長的選擇

《中國藥典》中“黃芩”與“射干”的“含量測定”項(xiàng)下波長分別為280 nm及266 nm。本方法同時(shí)測定黃芩苷和次野鳶尾黃素2種成分,但樣品中黃芩苷響應(yīng)大,而次野鳶尾黃素響應(yīng)較低,故選擇266 nm作為本方法的檢測波長。

3.2.3 樣品提取方法的選擇

分別以70%乙醇、乙醇、甲醇、70%甲醇為溶劑采用超聲提取和回流提取的方法對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)比研究。結(jié)果顯示本方法70%乙醇作為溶劑得到的含量較高,峰型較好,而超聲30 min提取效果與加熱回流1 h結(jié)果無明顯差別,但超聲提取省時(shí)、操作簡便。而在對(duì)超聲時(shí)間進(jìn)行考察時(shí),結(jié)果顯示超聲20 min與40 min的結(jié)果與30 min無明顯差異,故本法選取超聲30 min作為樣品提取的條件。

3.2.4 流動(dòng)相比例的選擇

結(jié)合《中國藥典》2015版一部中黃芩、射干含量測定的方法及相關(guān)文獻(xiàn)資料調(diào)整流動(dòng)相比例[18],考慮到梯度洗脫時(shí),系統(tǒng)精密度與重復(fù)性較等度洗脫差,且梯度洗脫程序平衡時(shí)間較長,故本法選擇等度洗脫,同時(shí)對(duì)不同比例的甲醇-0.2%磷酸溶液進(jìn)行調(diào)整,建立了能同時(shí)測定黃芩苷和次野鳶尾黃素的定量分析方法,經(jīng)過一系列方法學(xué)項(xiàng)目驗(yàn)證試驗(yàn)[19-20],表明本方法簡便、分離效果好、準(zhǔn)確、重復(fù)性好。

綜上所述,本文建立的質(zhì)量控制方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好,能較好地控制產(chǎn)品質(zhì)量,但配方中桔梗、枇杷葉等藥味還有待建立專屬性強(qiáng)的控制方法,進(jìn)一步完善止得咳顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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(收稿日期:2018-04-08 本文編輯:張瑜杰)

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