李臻　王慶國　劉煒　潘教文

摘要：利用不同技術(shù)創(chuàng)制突變體是作物遺傳改良和功能基因組學(xué)研究的重要途徑。本研究利用強(qiáng)磁場對水稻品種圣稻15進(jìn)行輻射誘變，在構(gòu)建水稻突變體庫的基礎(chǔ)上，經(jīng)多年種植及篩選，獲得93份在性狀上與對照有明顯差異的突變體。其差異表型主要集中在葉色、葉片形態(tài)、株高、抽穗期、穗型、粒型等方面。這些材料作為新的種質(zhì)資源，將有助于水稻功能基因組學(xué)的研究及遺傳育種。

關(guān)鍵詞：水稻；突變體誘變；葉色；株高；穗型；粒型

中圖分類號(hào)：S511.035.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2018）11-0016-07

Abstract Using different technologies to create mutants is an important way to study crop genetic improvement and functional genomics. In this research， rice mutant library of variety Shengdao 15 was generated by the method of electromagnetic mutagenesis. After years of propagation and screening， 93 mutant lines were obtained with significant phenotypic variations compared with the control. The phenotypic differences were mainly concentrated in leaf color， leaf morphology， plant height， heading stage， panicle architecture and grain shape etc. As new gemplasm rescources，the mutants would be contributed to functional genomics research and genetic breeding of rice.

Keywords Rice； Mutagenesis of mutants； Leaf color； Plant height； Panicle architecture； Grain shape

水稻為重要的糧食作物，全世界50%以上人口以水稻為主食。隨著人口增加、耕地面積減少以及環(huán)境的惡化，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆的水稻新型品種對于維護(hù)世界糧食安全具有重要意義。突變是遺傳變異的源泉，利用各種物理和化學(xué)方法誘變創(chuàng)制水稻新種質(zhì)并培育新型品種是水稻育種的重要途徑之一。至今，世界上已培育出約500份水稻突變品種[1]，在其它主要農(nóng)作物中，如小麥、玉米、大豆等，利用各種誘變手段也育成一系列新品種[2]。誘導(dǎo)種子基因變異、培育優(yōu)質(zhì)新種質(zhì)成為作物育種亟待解決的問題。

事實(shí)證明，通過誘變可獲得各種農(nóng)藝性狀、品質(zhì)、生育期、抗性等性狀優(yōu)良或具有特異性狀的突變種質(zhì)資源。同時(shí)，構(gòu)建水稻突變體庫，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)定位、克隆突變基因，分析突變基因作用機(jī)理，已成為目前水稻功能基因組學(xué)研究的重要任務(wù)。在世界范圍內(nèi)利用T-DNA插入、DS/dSpm標(biāo)簽、Tos17標(biāo)簽以及化學(xué)和輻射誘變等方法產(chǎn)生了大量水稻突變體[3]。其中主要包括水稻葉形、葉色、穗型、粒型、根系、生育期、株高、抗性等發(fā)生改變的突變體。

植物中多種性狀突變體的獲得，為進(jìn)一步開展遺傳育種及品種培育提供了豐富資源。對利用Ac/Ds標(biāo)簽系統(tǒng)獲得的矮稈突變體分析發(fā)現(xiàn)，一個(gè)氧化還原酶蛋白發(fā)生了突變，該蛋白可能通過影響GA的合成控制水稻株高[4]。水稻卷葉突變體sll1-fh673遺傳分析表明，該性狀是由基因Os09g23200突變所導(dǎo)致，這為后續(xù)研究水稻卷葉的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[5]。對秈型恢復(fù)系縉恢10號(hào)EMS誘變獲得的矮化大粒突變體sdb1遺傳分析發(fā)現(xiàn)，控制該性狀的基因定位于4號(hào)染色體406 kb的物理范圍內(nèi)[6]。類病斑突變體spl34株高變矮， 穗長變短， 穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率明顯降低，遺傳及測序分析發(fā)現(xiàn)該表型可能是由于候選基因LOC_Os04g56480突變所導(dǎo)致[7]。通過航天誘變育種獲得的穗型突變體cl表現(xiàn)出熟色好、產(chǎn)量高，但花序結(jié)構(gòu)異常，枝梗頂端小穗三粒簇生，BSA性狀定位法初步將該基因定位于6號(hào)染色體[8]。水稻的葉色突變體報(bào)道比較多，一般認(rèn)為是由葉綠體發(fā)育異常或者是葉綠素合成或降解過程發(fā)生變異所導(dǎo)致，據(jù)統(tǒng)計(jì)水稻中與葉綠素含量相關(guān)的基因超過130多個(gè)[9]。對于這些突變體的研究不但有利于揭示突變性狀的相關(guān)分子機(jī)制，而且有利于提升對水稻育種遺傳機(jī)理的研究，提高水稻育種效率。

電離輻射作為一種高能物理損傷因素，可通過電離激發(fā)產(chǎn)生大量自由基，引起直接受照的生物組織和細(xì)胞損傷。用E≥50 kV/cm的強(qiáng)電場對種子進(jìn)行處理，實(shí)現(xiàn)“電子剪刀”的作用，可以打斷分子間所有的化學(xué)鍵，成為單分子物質(zhì)，同樣也可以使基因斷裂、重組，從而使植物種子產(chǎn)生基因突變。本研究利用強(qiáng)磁場輻射誘變水稻品種圣稻15，獲得一系列穩(wěn)定的遺傳突變體。這些材料的獲得不但為水稻的遺傳育種提供新的種質(zhì)資源，而且有助于水稻功能基因組學(xué)與遺傳育種的研究。

1 材料與方法

1.1 電磁輻照誘變水稻突變體

以水稻品種圣稻15為材料，選取顆粒飽滿、大小均勻的種子，用E≥50 kV/cm的強(qiáng)電場對濕種子輻照10 min，以未經(jīng)輻照的種子作為對照。電磁輻照處理由廣東石油化工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 水稻突變體性狀的調(diào)查及篩選

將誘變后的水稻M0代種子進(jìn)行田間種植及擴(kuò)繁，自M2代開始，在水稻幼苗期、分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期、成熟期對群體中各材料的株高、葉色、分蘗、葉夾角、抽穗期、穗型、粒型等性狀進(jìn)行調(diào)查，篩選表型差異株系并進(jìn)行單株收種，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行每年的擴(kuò)繁及相關(guān)性狀調(diào)查，直到突變性狀穩(wěn)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻突變體的創(chuàng)制

2013年利用強(qiáng)磁場對水稻品種圣稻15進(jìn)行輻射誘變，誘變種子經(jīng)田間種植，對M1代進(jìn)行單株收獲，獲得約2 000多份材料。2014年對收獲的M1代種子進(jìn)行擴(kuò)繁，每份材料種20株，對M2代群體表型進(jìn)行觀察、記錄。篩選出93份表型性狀與對照有明顯變異的材料進(jìn)行單株收獲（表1），并于2015—2018年連續(xù)在田間進(jìn)行繁種及性狀調(diào)查，目前已獲得一批性狀穩(wěn)定的突變材料。

2.2 部分突變材料的性狀觀察

2.2.1 葉片形態(tài)、葉色突變體 圣稻15經(jīng)強(qiáng)磁場輻射誘變后，篩選到一批葉色、葉片形態(tài)發(fā)生變異的突變體。其中有3個(gè)突變體葉色黃化（編號(hào)為M6L1、M6L32和M6L47），特別是M6L1葉片不但黃化，而且植株長勢較弱、分蘗減少（圖1A、B和C）。突變體M6L66的葉片發(fā)生了不同程度的扭曲、皺縮，葉脈比較明顯（圖1D）。

2.2.2 株高和株型突變體 在植株高度和形態(tài)方面，部分材料也發(fā)生了變異。其中突變體M6L48在成熟期株高約為130 cm，而同期對照圣稻15的株高約為105 cm（圖2A）。其它兩個(gè)突變體M5W18和M5W19與對照相比植株高度也有明顯增加，尤其是M5W19旗葉高度更為明顯（圖2B和C）。突變體M6L46株高約為140 cm，且成熟期水稻穗型也發(fā)生明顯變異，穗型松散，穗長約為對照的1.5倍，穗節(jié)間長度明顯增加（圖2D）。同時(shí)我們也篩選到一些矮化突變體如M6L13（圖2E），該突變體株高約為50 cm，并且在植株基部葉片上存在明顯的褐色斑點(diǎn)。

2.2.3 抽穗相關(guān)突變體 水稻抽穗標(biāo)志著水稻發(fā)育由營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變，是決定水稻結(jié)實(shí)率的關(guān)鍵期。輻射誘變對水稻發(fā)育有較大影響，產(chǎn)生了一系列抽穗時(shí)期改變的突變體，發(fā)育的改變也伴隨著植株株高及成熟期的改變（圖3）。M5W1作為較典型的早穗突變體，其抽穗期相比對照提前約20 d，但成熟后結(jié)實(shí)率降低，株高約為50～60 cm（圖3A）。M5W5抽穗比對照早15 d，株高約為80 cm，成熟早，穗型散（圖3B和圖4C）。M5W10抽穗較早，早熟，而且容易落粒（圖3C）。M5W13抽穗期提前，早熟，早衰（葉色發(fā)黃），較易落粒（圖3D）。M6L17苗期長勢弱，抽穗期比較早，株高約為50 cm，結(jié)實(shí)率低（圖3E）。M6L33葉片稍發(fā)黃，抽穗期提前（圖3F）。M6L6抽穗期延遲，葉片顏色較深，葉片略寬（圖3G）。M6L31抽穗期延遲，晚熟（圖3H）。

2.2.4 穗型、粒型突變體 輻射誘變后也產(chǎn)生了部分穗型、粒型發(fā)生變異的突變體。其中M5W3穗型較對照細(xì)長，粒型比較癟（圖4A）。M6L25穗型與對照相比較細(xì)，穗頂部帶芒（圖4B）。M5W5為散穗型，小穗呈分支狀（圖4C、D和E）。M6L22植株比對照高，粒型較對照長（圖4F）。M6L29粒型比較飽滿，粒型圓（圖4G）。M5W15穗及小穗均長于對照，粒型較大，粒較圓（圖4H和I）。

3 討論與結(jié)論

水稻是世界上重要的糧食作物，也是發(fā)育和遺傳研究的模式植物。水稻突變體的獲得對于研究水稻基因功能、揭示其生長發(fā)育的分子機(jī)制具有重要意義。

水稻株高和分蘗是組成水稻株型的重要農(nóng)藝性狀，與植株的光合效率、抗倒伏及產(chǎn)量等密切相關(guān)，是影響水稻產(chǎn)量的主要因素。研究表明，水稻株高和分蘗數(shù)呈一定程度的負(fù)相關(guān)性。適當(dāng)降低作物株高不但能有效防止倒伏，而且能夠一定程度上增加分蘗數(shù)，達(dá)到單位面積高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的目的。被譽(yù)為“綠色革命”的sd-1基因曾在育種上得到廣泛應(yīng)用，但由于遺傳背景狹窄不但限制了育種工作的發(fā)展，而且具有一定的遺傳脆弱性[10，11]。因此，通過不同方式發(fā)展水稻矮稈、半矮稈突變體，開展水稻株高相關(guān)基因的定位及克隆，從而揭示株高的調(diào)控機(jī)制對水稻育種具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。目前已發(fā)現(xiàn)控制水稻矮稈的基因有80多個(gè)，有17個(gè)基因已經(jīng)被克隆。對模式植物擬南芥和水稻株高機(jī)制的研究表明，赤霉素GA和油菜素類固醇BR在調(diào)控植物的株高方面起著重要作用，主要通過調(diào)控GA和BR合成代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而調(diào)控植株的高度[12， 13]。劉凱等[14]通過EMS誘變獲得遺傳穩(wěn)定的水稻顯性矮稈突變體Dy，發(fā)現(xiàn)突變體Dy具有較強(qiáng)的降株高能力。

水稻的粒型主要由粒長、粒寬和長寬比決定，與水稻品質(zhì)也有著直接關(guān)系，是影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。目前已有22個(gè)控制水稻粒型的基因被克隆，相關(guān)調(diào)控機(jī)制也逐漸被揭示[15]。GS3是第一個(gè)克隆到的控制水稻粒長和粒寬的主效基因，編碼一個(gè)跨膜蛋白，由四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。OSR結(jié)構(gòu)域缺失后會(huì)導(dǎo)致粒型變長，而TNFR/NGFR結(jié)構(gòu)域和C端的VWFC缺失導(dǎo)致粒型變短[16，17]。水稻穗型的大小與產(chǎn)量密切相關(guān)，也是目前水稻研究的熱點(diǎn)之一。目前已克隆到多個(gè)與水稻穗發(fā)育相關(guān)的基因。DEP1編碼一個(gè)類似磷脂酸乙醇胺蛋白，該基因突變?yōu)轱@性突變，C端230氨基酸的缺失突變導(dǎo)致枝梗數(shù)增加、穗變密、穗粒數(shù)增加、產(chǎn)量也有所增加[18]。SP1（short panicle1）基因編碼一個(gè)多肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該基因突變后導(dǎo)致水稻穗型變短，但該基因如何調(diào)控穗的發(fā)育還需進(jìn)一步研究[19]。LAX（LAX PANICLE）基因控制穗軸分支分生組織的起始并控制穗的發(fā)育，該基因突變后穗分支減少，穗粒數(shù)減少[20，21]。

本研究通過對圣稻15進(jìn)行輻照誘變，篩選到一系列株高、穗型、粒型等農(nóng)藝性狀發(fā)生明顯變異的突變體，為進(jìn)一步定位、克隆控制相關(guān)性狀的基因提供了重要材料。實(shí)驗(yàn)室將在已獲得的突變體基礎(chǔ)上，通過遺傳分析及測序技術(shù)，結(jié)合生理生化分析，進(jìn)一步揭示控制水稻株高、穗型、粒型等重要農(nóng)藝性狀的分子機(jī)制，為水稻育種提供新的種質(zhì)資源，從而推進(jìn)水稻遺傳育種研究。

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