羅亮，趙志剛，都雪，徐奇友

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

腸道菌群作為生物體“被遺忘的器官”在生命活動過程中發(fā)揮著重要的作用，其含有的幾百萬個基因也被稱為生物體的“第二基因組”[1]。機(jī)體腸道內(nèi)大量而復(fù)雜的微生物在演變和適應(yīng)過程中逐漸形成了腸道菌群。魚類受環(huán)境的影響和作用，腸道內(nèi)進(jìn)化出與所處環(huán)境相適應(yīng)的正常菌群[2]。魚類腸道中這些有益菌群分泌多糖、脂類、維生素、相關(guān)活性酶類等一系列代謝產(chǎn)物，共同促進(jìn)了免疫系統(tǒng)的作用。這些有益微生物占優(yōu)勢時，抑制了病原微生物的生長，提高了魚體的抗病能力，腸道正常菌群就像一道屏障保護(hù)魚體健康生長[2,3]。魚類腸道菌群在促進(jìn)建立機(jī)體免疫、屏障致病菌入侵、提高營養(yǎng)物質(zhì)吸收與利用等方面起重要作用[4]。近年來，腸道菌群與宿主健康的關(guān)系已成為研究熱點，作為人類路線圖計劃（road map plan）一部分的人體微生物群系項目（Human Microbiome Project，HMP）、歐盟資助的“人類腸道宏基因組計劃”都在如火如荼地進(jìn)行，而且取得了很多重要研究成果[1,5-7]。為提高健康水產(chǎn)養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益，也圍繞著魚類腸道菌群形成、組成和種類及影響因素、生理功能、與機(jī)體免疫相關(guān)性等方面開展了一系列研究。本文著重討論了魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)與免疫力相關(guān)性的研究進(jìn)展。

1 魚類腸道菌群的形成

腸道菌群與宿主關(guān)系密切，了解腸道菌群在宿主發(fā)育過程中的變化是揭示腸道菌群形成的關(guān)鍵。有研究者認(rèn)為，腸道菌群與宿主間的復(fù)雜相互作用始于宿主出生之后[8]。Hansen等[9]測定了鱈Gadus morhua L.和鰈Hippoglossus hippoglossus卵中的菌群，發(fā)現(xiàn)在魚卵階段由于其消化腺還沒有形成，不存在菌群定植情況。魚類發(fā)育早期腸道微生物群落的形成和組成目前仍不清楚[10]。魚類胚胎在卵膜內(nèi)無菌環(huán)境中發(fā)育孵化，只有破膜而出接觸外界環(huán)境及獲得開口餌料后，腸道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)才開始形成[10,11]。Sugita等[12]研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚Oreochromis mossambicus仔魚在孵出20～60d后，腸道內(nèi)開始有菌群定植。他們推斷這些細(xì)菌來自養(yǎng)殖水、底泥或其他魚類糞便等外界環(huán)境。史秀清等[13]研究了影響大菱鲆Scophthalmus maximus仔稚魚發(fā)育早期腸道菌群結(jié)構(gòu)形成的因素，發(fā)現(xiàn)其腸道菌群結(jié)構(gòu)在開口攝食后不久就趨于穩(wěn)定。大菱鲆仔稚魚腸道對定植的菌種具有選擇性，一些水環(huán)境和餌料中的非優(yōu)勢菌也會定植于腸道，成為大菱鲆腸道中的次優(yōu)勢菌。仔稚魚時期腸道菌群的定植對后期菌群的形成與發(fā)展具有重要的影響[14]。Roeselers等[15]研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚Danio rerio飼養(yǎng)在不同條件下腸道菌群中存在著相似的核心微生物組群。

也有部分研究者比較研究了魚類整個生命周期腸道菌群組成的變化。Stephens等[16]從受精卵到成魚7個特定時間采樣，發(fā)現(xiàn)不同生長階段的斑馬魚腸道菌群結(jié)構(gòu)不同。Li等[17]分析了銀鯽Carassius auratus gibelio在不同發(fā)育階段的腸道菌群組成，結(jié)果表明隨著魚類的發(fā)育，腸道菌群多樣性顯著增加，在相同環(huán)境及投喂情況下，不同發(fā)育階段的銀鯽腸道菌群組成有所改變。腸道菌群的一些特征可能由宿主的發(fā)育決定。魚類不同發(fā)育階段的腸道菌群形成受到各種外界環(huán)境因素的共同作用和影響。

2 魚類腸道菌群的數(shù)量及組成

種類、生長與棲息環(huán)境、是否投餌、投飼策略、腸道自身生理特征等因素均影響魚類腸道菌群的數(shù)量和組成，這些因素間既統(tǒng)一又相互作用。有研究表明，淡水魚腸道內(nèi)細(xì)菌數(shù)量在105～108CFU·g-1之間[12,18]，而海水魚腸道內(nèi)細(xì)菌數(shù)量在106～108CFU·g-1之間[19]。Turst&sparrow[20]曾指出，魚類腸內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量與腸道組織的關(guān)系比與腸道內(nèi)容物的關(guān)系更密切。不同種類的魚腸道菌群組成也各不相同。李學(xué)梅等[21]采用PCR-DGGE指紋技術(shù)研究了斑點叉尾Ictalurus punctatus、銀鯽和異育銀鯽Carassius auratus gibelio腸道微生物群落，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在斑點叉尾腸道中檢測到的菌群主要是變形桿菌門Proteobacteria，而銀鯽和異育銀鯽腸道中菌群主要包括梭桿菌門Fusobacteria中的類群，還包括變形桿菌門中的氣單胞菌Aeromonas，以及一些未知的類群。所研究的不同種類魚幼魚腸道菌群組成不同，這種差異受基因型的影響可能更大。黃麗麗等[22]利用16S rRNA高通量測序方法比較了新疆冷水魚腸道中微生物多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種魚腸道微生物的組成及多樣性在門和屬水平上有明顯差異，而同種冷水魚的腸道內(nèi)容物和黏膜間微生物群落組成較為相似，無顯著差異。魚類生長或棲息的環(huán)境和其所攝食的餌料是影響魚類腸道菌群中微生物數(shù)量和組成最重要的兩個因素。周志剛等[23]利用PCR-DGGE指紋圖譜分析比較了川紋笛鯛Lutjanus sebae及圓白鯧Ephippus orbis消化道壁的優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種魚消化道壁的細(xì)菌多樣性及相對豐度有明顯區(qū)別，圓白鯧消化道壁細(xì)菌多樣性高于川紋笛鯛，這可能歸因于它們天然棲息地的差異性。白曉慧[24]研究認(rèn)為，消化酶活性在魚的生長發(fā)育過程中起重要作用。消化酶的活性隨水環(huán)境的變化而改變。尹軍霞等[25]對魚食性與腸道菌群關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，烏鱧Channa argus、鰱Hypophthalmichthys molitrix、鳊 Parabramis pekinensis、鯽Carassius auratus等4種不同食性魚的后腸壁和后腸內(nèi)容物中厭氧菌總數(shù)遠(yuǎn)大于好氧菌總數(shù)，后腸內(nèi)容物菌數(shù)遠(yuǎn)大于后腸壁菌數(shù)；不同的魚后腸壁的好氧菌總數(shù)差別很大（如鰱后腸壁好氧菌總數(shù)7×1010CFU·g-1，而鯽后腸壁好氧菌總數(shù)為1.2×109CFU·g-1，前者是后者的58倍），而厭氧菌總數(shù)差別不大（最大數(shù)鳊與最小數(shù)鰱之間的比值僅為2.4倍）。

3 魚類腸道菌群與黏膜免疫

魚腸道內(nèi)棲息著大量的正常菌群，它們覆蓋在腸道表面黏膜上，形成一道天然拮抗致病菌入侵的機(jī)械屏障，同時刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性和特異性免疫反應(yīng)，與宿主共同維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡，加強(qiáng)對機(jī)體的免疫保護(hù)[3,26]。Gallo等[27]研究認(rèn)為，腸道內(nèi)的正常共生菌群可以分泌一些具有抑菌活性的物質(zhì)，抑制病原微生物在腸道黏膜內(nèi)生長、定植。Bergh等[28]研究指出，在魚體表和腸道黏膜內(nèi)定植的正常共生菌群作為屏障防止病原菌的入侵和寄居。如腸道中具有抑菌效果的乳酸菌可增強(qiáng)魚類免疫，促進(jìn)生長[29]。周金敏等[30]從黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco腸道篩選了病原拮抗性芽孢桿菌，并研究了其特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株F14抗菌譜較廣，抑菌作用強(qiáng)，耐高溫和酸性環(huán)境，在飼料中穩(wěn)定性好，具有做為水產(chǎn)益生菌的潛力。健康魚腸道菌群的數(shù)量和種類處在動態(tài)平衡之中，病原菌不能過量繁殖，以免引起疾病。但是，當(dāng)腸道正常菌群受到宿主各種因素刺激而失調(diào)時，病原菌就會趁機(jī)異常繁殖，導(dǎo)致宿主免疫能力降低而發(fā)病。張正等[31]分析發(fā)現(xiàn)，患病半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis腸道菌群中細(xì)菌種類數(shù)僅是同一養(yǎng)殖系統(tǒng)中健康魚的45.8%和64.5%，病魚腸道中細(xì)菌多樣性明顯下降。腸道正常菌群與腸道黏膜的共生互利關(guān)系在魚類腸道黏膜免疫中具有重要的作用。

4 魚類腸道菌群與細(xì)胞免疫

魚類的細(xì)胞免疫包括遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、淋巴細(xì)胞直接參加的細(xì)胞毒性、移植物排斥反應(yīng)、巨噬細(xì)胞游走抑制和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)等[32]。凡參與免疫應(yīng)答或與免疫有關(guān)的細(xì)胞均稱為免疫細(xì)胞。固有免疫的效應(yīng)細(xì)胞主要有單核/巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、自然殺傷（Natural killer,NK）等。它們具有吞噬和殺傷功能，也分泌免疫相關(guān)的細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[33]。目前關(guān)于魚類腸道菌群與細(xì)胞免疫間的相互作用研究較少。孫敬鋒等[3]推測，魚類腸道正常菌群對魚類細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用主要在于對免疫系統(tǒng)發(fā)育的影響。李莉[2]研究了草魚Ctenopharyngodon idellus腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的變化與免疫機(jī)能關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著草魚腸道中氣單胞菌屬細(xì)菌比例下降而腸桿菌科Enterobaeteriaeeae細(xì)菌的含量上升時，草魚白細(xì)胞的吞噬百分比和吞噬指數(shù)明顯上升，這說明草魚腸道優(yōu)勢菌群的變化可能與增強(qiáng)白細(xì)胞吞噬活性有關(guān)。利用益生菌鼠李糖乳桿菌L.rhamnosus JCM1136投喂虹鱒發(fā)現(xiàn)其腸道中的有益菌群比例提高，頭腎白細(xì)胞的吞噬作用也顯著增強(qiáng)[34]。

5 魚類腸道菌群與體液免疫

體液免疫是指機(jī)體受抗原刺激后，淋巴細(xì)胞分化增殖，產(chǎn)生免疫球蛋白的應(yīng)答過程[32]。魚類體液免疫是魚類免疫的重要組成部分，包括特異性和非特異性體液免疫。魚類特異性體液免疫主要是指由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類免疫球蛋白，它能與相應(yīng)抗原進(jìn)行特異性結(jié)合。微生物生長抑制物、補(bǔ)體、干擾素、凝集素、溶菌酶和急性期蛋白等作為非特異性抵抗作用的分子存在于魚類血液或粘液中[32]。葛莉莉[35]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對無菌動物進(jìn)行常規(guī)的喂養(yǎng)或喂食益生菌后，機(jī)體腸道形態(tài)和免疫系統(tǒng)迅速反應(yīng)，產(chǎn)生大量不同的針對腸道正常菌群的特異性抗體表型。王彥波等[36]在研究益生菌免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，芽孢乳酸菌09.712（Bacillus coagulans 09.712）在體外能顯著提高對細(xì)胞的保護(hù)性，在體內(nèi)能誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生先天免疫應(yīng)答，提高斑馬魚的免疫力。陳勇等[37]應(yīng)用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)建立了異育銀鯽免疫抑制性實驗?zāi)Ｐ?，以研究添加殼聚糖或益生菌對異育銀鯽免疫功能的影響。發(fā)現(xiàn)銀鯽的IgM含量和頭腎的溶菌酶活力均有不同程度的提高，適量的添加殼聚糖或益生菌能夠不同程度地消除魚類的免疫抑制。

6 結(jié)語

魚類腸道微生物菌群與宿主的代謝、營養(yǎng)吸收、生長發(fā)育和免疫等密切相關(guān)，維持腸道正常菌群動態(tài)平衡對宿主正常生命活動至關(guān)重要。益生菌的利用研究主要集中在：一是用益微生物來調(diào)控養(yǎng)殖水質(zhì)、底質(zhì)，預(yù)防疾??；二是作為魚飼料添加劑添，提高消化酶、免疫酶等活力，提高魚機(jī)體免疫力。但是，腸道菌群與魚類免疫的研究理念、技術(shù)手段還較落后，應(yīng)深入研究腸道菌群與水產(chǎn)動物的免疫力二者之間的關(guān)系。